全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
枯草芽孢杆菌 BS224的 16S rDNA
序列测定及系统进化分析
刘杰 张琼 房春红 蔡文君
(西北农林科技大学生命学院,杨凌 712100)
摘 要: 利用细菌通用引物, 通过 PCR的方法, 对菌株 BS224的 16S rDNA基因进行扩增, PCR产物经胶回收试剂盒纯
化后测序, 测序结果与 GenBank上已登录的高同源 16S rDNA序列进行比较, 并构建系统进化树,结果 BS224与 Bacillus sub tilis
stra in ZHA9相似性最高,达到 9938% , 与模式菌株 Bacillus subtilis stra in 168的相似性也达到 9855% , 结合其形态特征、培养
特征、生理生化特性的分析结果, 可以确定 BS224属于枯草芽孢杆菌属。
关键词: BS224 16S rDNA 系统进化分析
Determ ination and Phylogenetic Analysis of 16S rDNA
Sequene inBacillus subtilis BS224
L iu J ie Zhang Q iong Fang Chunhong Ca iW en jun
(College of Life Sciences, N or thwestA&F University, Yangling 712100)
Abstrac:t The un ive rsal prim e rs o f bac teria we re used to am plify the 16S rDNA sequence o f BS224 by PCR. The PCR products
w ere pur ified by Aga rose Ge lDNA Pur ification K it and sequenced. The resultant nucleotide sequence w as com pared w ith the reg is
tered 16S rDNA sequences in the G enB ank, then the phy logenetic tree w as constructed. BS224 exh ib ited the h ighest s im ila rity,
99 38% w ith B. sub tilis stra in ZHA9, and also disp layed 98 55% sim ilar ity w ith the type stra in B. subtilis stra in 168. A cco rd ing
to dete rm ina tion and phy log ene tic ana lysis o f 16S rDNA sequene in BS224, as w ell a s its m orpho log ica l cha ra cter istics, cu ltura l
cha rac ter istics, phys io log ical and b iochem ica l cha racte ristics, w e cou ld prove tha t the strain BS224 be longed toB acillus sub tilis.
Key words: BS224 16S rDNA Phylogenetic ana lys is
收稿日期: 20100416
基金项目:西北农林科技大学人才专项 ( Z111020825 ),博士后科研项目 ( K308020901)
作者简介:刘杰,男,讲师,博士,研究方向:微生物与分子生物学; Em ai:l neau liu@ s ina. com
菌株 BS224是从健康人正常皮肤中分离得到
的 [ 1] ,对多种病原菌具有生物拮抗作用,例如, 金黄
色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌等, 同时能够
分泌枯草杆菌素等活性物质及各种酶类, 如 淀粉
酶、碱性磷酸酶和 葡萄糖氧化酶等 [ 2, 3] , 因此, 在
工农业生产、食品加工与保藏、医疗卫生等方面具有
广泛的应用价值和开发前景。根据微生态学原理,
利用微生物间的拮抗作用, 由 BS224活菌体制成的
微生态制剂: 抑菌生 [ 4 ]和白天鹅气雾剂 [ 5, 6 ]均具有
预防和治疗烧伤创面感染,修复损伤组织,加速创面
愈合的功效,目前已在多家医院得到临床应用。
从形态、培养特征及生理生化反应的结果看,
BS224菌株符合枯草芽孢杆菌的特征 [ 1 ]。然而, 枯草
芽胞杆菌并不是人体的正常居住菌,而且单纯按照形
态和生理生化等特征难以区分诸多亲缘关系相近的
菌株,不能保证分类的科学性和准确性,因此, 目前对
于 BS224的种属划分还存在一定的置疑。本研究采用
分子生物学手段,通过对 BS224的 16S rDNA进行序列
测定及系统进化分析,对其做进一步的分类鉴定。
1 材料与方法
11 供试菌株与试剂
枯草芽孢杆菌 BS224由哈高科白天鹅药业提
供; A garose G el Purificat ion DNA K i,t DL2000 DNA
M arker, ExTaq酶, RN ase均购于 TaRaK a公司; T ryp
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tone、Yeast Extract购于 Ox iod公司。
12 菌株基因组 DNA的提取
参照刘刚等 [ 7]方法,略有改动。将保存菌种接种
于 LB液体培养基, 37 , 230 r /m in培养过夜;取 1mL
菌液, 12 000 r/m in离心 5 m in; 弃上清,将沉淀溶于
200 L丙酮,振荡混匀,冰浴5 m in; 8 000 r /m in离心 2
m in;弃上清,沉淀溶于 500mL TE缓冲液, 振荡混匀;
8 000 r/m in离心5m in;将沉淀重悬于 400 L裂解液
( 2% SDS, 20mmol /L N aA c, 40 mmo l/L Tris, 10
mmo l/L EDTA, pH80) ,反复吹打混匀; 冰浴 5 m in,
然后 70 温育 20 m in; 再加入 100 L 5 mmol /L
N aC ,l 12 000 r/m in离心 10m in; 上清加 500 L氯仿,
颠倒混匀, 8 000 r/m in离心 5m in;上清加 2倍体积预
冷无水乙醇, 12 000 r /m in离心 5 m in; DNA沉淀溶于
500 L 70%乙醇, 10 000 r/m in离心 2m in; DNA沉淀
溶于 50 L TE缓冲液, 加 RN ase至终浓度为 025
mg /mL;置 - 20 保存备用。
13 16S rDNA的 PCR扩增
以基因组 DNA为模板, 采用细菌通用引物:
27F ( 5!AGAGTTTATCTGCCG3!) 和 1492R ( 5!
GGTTACCTTGTTACGATT3!) PCR反应扩增出 16S
rDNA。 PCR反应体系 ( 25 L ) : DNA 模板 ( 200
ng / L) 2 L, 10 ∀ PCR buffer 25 L, dNTPM ix ture
( 25 mmo l/L ) 35 L, 引物 ( 10 nmo l/L )各加
1 L, E x Taq酶 ( 5 U / L ) 1 L, ddH 2O 15 L。
PCR扩增程序: 95 5 m in; 94 1 m in, 50 50
s, 72 1 m in, 35个循环; 72 10m in。 PCR产物
纯化后送北京三博远志生物技术有限公司测序。
14 序列分析
将测得的 16S rDNA序列输入 GenBank上的
B lastn软件进行相似性搜索比较, 然后用 C lusta l
X18软件进行多序列比对,从比对的高度同源序列
中随机选取部分序列利用 Mega 40构建系统进化
树,并利用 DNAMAN软件计算序列间的相似性 [ 8, 9]。
2 结果与分析
21 16S rDNA的 PCR扩增结果
利用细菌 16S rDNA通用引物 27F和 1492R对
菌株 BS224进行 PCR扩增, 其产物电泳结果显示,
从其基因组 DNA中成功扩增出约 1 500 bp的特异
性片段,与预期大小一致 (图 1)。
将 PCR扩增获得的特异性片段经胶回收试剂
盒纯化后进行测序,测序结果如图 2所示。
M. DL 2000 DNA M ark er; 1. BS224; 2.阴性对照
图 1 BS224 16S rDNA的 PCR扩增结果
22 16S rDNA序列的相似性比较和系统进化分析
目前, BS224的 16S rDNA 序列已经提交到
GenBank上,得到的序列登录号为 GU 230167。将所
测序列与枯草芽孢杆菌已知种进行比较, 并利用
C lusta lX18和 Mega 40构建系统进化树, 如图 3
所示。根据比对结果,发现 BS224与 B. subtilis stra in
ZHA9在进化位置上最为接近, 同时通过 DNAMAN
软件对这两个序列进行比较, 其相似性达到
9938%,与模式菌株 B. subtilis stra in 168的相似性
也达到 9855%。同时根据齐函等对该菌株的形态
特征、培养特征、生理生化特性的分析结果, 可以确
定 BS224为枯草芽孢杆菌。
3 讨论
枯草芽胞杆菌本身是一个十分复杂的菌株群,
广泛存在于水、土壤和空气中,但它并不是人体的正
常居住菌。因此, 从人的皮肤中分离得到的菌株
BS224仅通过传统的生理生化试验方法的种属鉴定
结果并不具备说服力,因为单纯按照形态和生理生
化等特征难以区分诸多亲缘关系相近的菌株, 不能
保证分类的科学性和准确性 [ 10 ]。
随着细菌分类学的发展, 以生理生化为主的
分类体系, 已被以生理生化为基础结合分子生物
学技术的多相分类所取代。目前, 16S rDNA已被
作为一个分子指标,广泛地应用于各种细菌的遗传
特征和分子差异的研究。大量已知细菌的 16S rDNA
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2010年第 9期 刘杰等:枯草芽孢杆菌 BS224的 16S rDNA序列测定及系统进化分析
图 2 PCR扩增的特异性片段测序结果
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
图中分枝上数字表示树形可信度
图 3 BS224与参比菌株系统发育关系树状图
数据都被测定并输入到国际基因数据库, 使之成为
对细菌鉴定和分类非常有用的参照系统; 并且 16S
rDNA序列的相似性已成为划分属的标准, 属内相
似性应不低于 95% [ 11, 12]。
本研究通过对菌株 BS224的 16S rDNA进行序
列测定和系统进化分析,结果表明, BS224与 B. sub
tilis stra in ZHA9在进化位置上最为接近,其相似性
达到 9938%,与模式菌株 B. subtilis stra in 168的相
似性也达到 9855%, 同时综合齐函等 [ 1]对该菌株
的形态特征、培养特征、生理生化特性的分析结果,
可以将 BS224鉴定为枯草芽孢杆菌, 确定了该菌株
的分类进化地位。
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