全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
一种 PCR酶切克隆目的 DNA方法
王俐 张俊河 董卫华 王芳 王天云
(新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡 453003 )
摘 要: 以 PCR扩增克隆 surv iv in启动子为例, 根据 GenB ank报道的序列设计引物, PCR扩增克隆 surv iv in启动子。通
过软件在线分析扩增的 surv iv in启动子酶切位点,将扩增与预期的片段大小一致的 DNA片段进行酶切, 再进行测序。结果表
明, 采取酶切鉴定 PCR产物的方法,可以初步对 PCR产物是否正确做出判断。
关键词: PCR 引物 酶切 电泳
A PCR AmplicationM ethod of Combining Endonuclease D igestion
W ang L i Zhang Junhe DongW e ihua W ang Fang W angT ianyun
(D epartm ent of Biochem istry and M olecularB iology, X inx iang M edical University, X inx iang 453003)
Abstrac:t A PCR am plication m ethod o f com bining endonuclease digestion w as reported. W hen the surv iv in prom oter was am pli
fied, pr ime rs w ere des igned according to the surv iv in prom oter sequence and then PCR was ca rr ied out. The restriction endonuclease en
zym es sites w ere analyzed by online softw are, and PCR products we re dig ested and then sequenced. Resu lts showed that use the me thod
o f enzym e dig estion to appra ise the product o f PCR, it can pre lim inary to decide the correctness o f the product of the PCR.
Key words: PCR P rim er Enzyme d igestion E lectrophoresis
收稿日期: 20100517
基金项目:河南省科技厅科技攻关项目 ( 0624410041) ,河南省教育厅自然科学基金项目 ( 2008A310008)
作者简介:王俐,女,副教授,主要从事基因工程方面的研究; Em ai:l w angli0834@ 163. com
通讯作者:王天云,男,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:基因表达调控与基因工程; Em ai:l w ty@ xxm u. edu. cn
聚合酶链反应 ( po lym erase cha in react ion, PCR)
是一种在体外由引物介导的特异 DNA序列的酶促
扩增反应,自 1985年发明 PCR技术以来,由于其具
有快速、灵敏、特异性高等优点 [ 1] , 目前已广泛应用
于分子生物学、医学等各个领域。尽管目前 PCR技
术已相当普遍和成熟,但由于 PCR反应中有许多变
性条件 (如 Mg2+、dNTPs、引物、模板、循环中的参数
等 )严重地影响试验结果, 特别对于一些基因组
DNA复杂的模板, 普通 PCR往往得不到理想的产
物。PCR反应的关键因素之一是引物的设计。
引物设计要遵循一定的原则, 但由于真核高等
生物基因组结构比较复杂,存在大量重复序列,因此
有时即使使用按照设计原则设计的引物也难以得到
目的片段。
PCR产物的鉴定往往最初用凝胶电泳判断产
物的大小是否和预期的片段大小相符, 然后通过测
序进一步验证。如果不进行测序仅凭片段大小与预
期相符,其结果是不可靠的, 之前本实验室在克隆一
些目的 DNA片段时,曾出现过两例扩增的产物片段
大小与预期基本一致,但测序结果不是目的 DNA的
情况 [ 2]。由于绝大多数实验室不能自己测序, 测序
要由专业基因公司完成。鉴于上述原因,我们在试
验中摸索了一种先 PCR酶切再进一步测序的试验
方法,即先通过凝胶电泳判断目的 DNA片段大小,
通过在线分析目的 DNA的酶切位点,利用酶切分析
目的 DNA是否正确, 然后再决定是否送公司进行
测序。
1 材料与方法
1. 1 DNA提取
根据 TaKaRa公司细胞基因组 DNA提取试剂
盒说明书提取 HeLa细胞基因组 DNA。
1. 2 引物的设计与 PCR扩增
根据 surv ivin启动子的序列 [ 3] ( GenBank登录
号: U752851)设计以下引物: P1: 5 GCCATTAATCT
2010年第 12期 王俐等: 一种 PCR酶切克隆目的 DNA方法
GGCCATAGAACCAGAGAAGTGA3 ; P2: 5 ATACG
CTAGCCGCACGCCCTCTTAGGCGGTCCACC3 ; 按照
标准 PCR体系配置, PCR程序为: 95! 3 m in;然后
94! 40 s, 55! 30 s, 72! 40 s循环 30次; 72!
3 m in。
1. 3 酶切位点分析及酶切反应
酶切位点分析利用 NEB 公司的在线分析
( http: / / too ls. neb. com /NEBcutter2/ index. php)。酶
切反应按照标准体系进行。
1. 4 PCR产物回收及测序
PCR产物采用 15%琼脂糖凝胶电泳分析,纯化
目的条带,送上海生物工程有限公司进行测序,测序
结果 http: / /www. ncb.i nlm. n ih /B last进行同源性
比较。
2 结果
2. 1 surviv in启动子酶切位点分析
根据 GenBank报道的 surv iv in启动子的序列,
将序列通过 NEB公司的在线分析 ( http: / / too ls.
neb. com /NEBcu tter2 / index. php)
[ 4]
, 分析结果如图
1所示,根据酶切分析结果,在 511 bp位点有个 Sma
I酶切位点, 用 Sma I可将该片段酶切成 511 bp和
400 bp的两个片段。
图 1 survivin启动子的序列酶切位点分析结果
2. 2 surv ivin启动子 PCR扩增及酶切结果
用上、下游引物进行 PCR扩增 [ 5] surv iv in启动
子,电泳分析结果 (图 2)显示片段大小与预期大小
相符, 用H ind III酶切结果只有一条带, Sma I酶切
PCR产物结果酶切出 511 bp和 400 bp片段,进一步
说明克隆的片段应为目的 DNA片段。
2. 3 测序结果分析
PCR产物经过纯化送公司测序,测序结果 B last
分析和 GenBank报道的序列完全一致。
3 讨论
PCR作为一种体外扩增 DNA的方法, 以其敏
感、特异、简便、快速、可以定量等优点 [ 6] ,目前在生物
1. PCR扩增 su rvivin启动子; 2.H ind III酶切; 3. Sm a I酶切
图 2 survivin启动子 PCR扩增及酶切结果
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
医学领域中应用越来越广泛。引物是 PCR的重要成
分,是影响 PCR结果的最重要因素,此引物设计在
PCR中是试验成功的关键。好的引物在模板上的结
合位点应该是唯一的,只有这样才能保证扩增产物的
特异性。根据引物设计的一般规律, 在 1个大小为
3 ∀109 bp的哺乳动物基因组中,只存在 1个与序列
长度为 15个核苷酸数的寡核苷酸完全互补的序列。
如果引物的长度为 6个碱基,那么在一种典型的哺乳
动物 cDNA文库 (其复杂度为 107 bp)中含有与此引
物完全配对的序列的可能性仅为 1 /10。然而由于真
核生物基因中核苷酸序列的分布并非是随机的,存在
着密码子使用上的偏爱性以及大量的重复序列和基
因家族,使 PCR扩增往往产生非特异性的产物,即使
用 20个或 20个以上核苷酸的引物,在哺乳动物基因
组中也仅有 85%的序列能被准确地配对 [ 7 ]。
鉴于上述原因, PCR扩增时, 有时会出现非特
异性扩增的现象,有时通过电泳检测目的带与预期
的大小一致, 但测序结果仍为非目的带 [ 2 ]。目前
DNA片段证实的最可靠依据是测序结果,但由于绝
大多数实验室不具备测序条件,而有时由于一些因
素的限制,并非每个测序样品都可以及时无误地得
到测序结果。采取酶切鉴定 PCR产物的方法,可以
初步对 PCR产物是否正确做出正确判断, 试验所要
求条件简单,绝大多数实验室都可以完成。
参 考 文 献
[ 1] 秦清华.结核杆菌聚合酶链反应 ( TBPCR)在肝硬化合并结核性
腹炎诊断中的应用.重庆医学, 2004, 33( 11 ) : 17361737.
[ 2] 王天云,臧卫东,赵清赞,等. 2例 PCR扩增失败的分析与探讨.
生物技术通讯, 2004, 15 ( 6) : 593595.
[ 3] 吴冰,王燕,任继鸿,等. survivin启动子的克隆及在 H ela细胞中
的特异生物活性. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2005, 12 ( 2 ):
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[ 4] h ttp: / / too ls. neb. com /NEB cutter2 / index. php.
[ 5] 司英健,张曦,陈幸华,等. Cx43和 GFP双基因共表达重组腺病
毒载体的构建和鉴定.重庆医学, 2007, 36( 10 ) : 927929.
[ 6] 岳昌武,吕玉红,刘坤祥,等. 粪便基因组 DNA提取方法比较及
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