全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期:2007-10-16
基金项目:教育部优秀青年教师资助计划项目[教育司(2003)355号];河南科技学院博士科研启动项目资助(6011)
作者简介:孙涌栋(1980-),河南安阳人,博士,讲师,研究方向为分子生物学,E-mail:sunyd2001@163.com
黄瓜CsEXP10蛋白的结构构建和分析
孙涌栋 罗未蓉 李贞霞
(河南科技学院园林学院,新乡 453003)
摘 要: 利用一系列生物信息学软件预测了黄瓜 CsEXP10蛋白的理化性质、卷曲螺旋、疏水性、信号肽、跨膜结
构、糖基位点、活性位点、亚细胞定位及二级和高级结构。结果表明:该蛋白是一个疏水性稳定蛋白,定位于细胞壁,含有4
个α-螺旋,11个β-折叠,5个跨膜区域和10个糖基化位点。
关键词: 黄瓜 CsEXP10蛋白 生物信息学
ConstructionandAnalysisofCsEXP10StructureinCucumber
SunYongdong LuoWeirong LiZhenxia
(ColegeofLandscape,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003)
Abstract: The characterofCsEXP10 protein such asthe physicaland chemicalproperties,coiled coil,
hydrophobicity,signalpeptide,transmembranedomains,O-glycogylation site,activesite,subceluarlocalization,second and
threestructurewereanalyzedbyaseriesofbioinformaticssoftware.TheresultsshowedthatCsEXP10proteinhadfour
α-helix,elevenβ-sheet,fivetransmembranedomainsandtenO-glycogylationsites;itwasahydrophobicandstable
proteinandlocatedtocelwal.
Keywords: Cucumber CsEXP10protein Bioinformatics
·研究报告·
扩张蛋白是一类能使植物细胞壁松弛的、非酶类的活性细胞壁蛋白,通过打断细胞壁多聚物之间的氢
键来促进细胞壁大分子结构网的解聚,改变细胞壁的刚性结构和使之松弛,以利于细胞膨大生长[1]。扩张
蛋白普遍存在于正在生长的组织和成熟的果实中[2],目前,已从拟南芥、水稻、棉花、苹果、黄瓜和番茄等 77
个物种中得到克隆。但是扩张蛋白参与果实膨大生长的研究相对较少,且稀有克隆。CsEXP10蛋白[3]来自于
正在生长的黄瓜幼果,参与了黄瓜果实膨大生长过程,但是有关该蛋白生物信息学方面的研究还未见报
道。利用生物信息学软件对其进行结构构建和分析,为深入研究扩张蛋白基因参与黄瓜果实膨大生长的作
用机制提供一定的理论基础。
1 材料与方法
利用分子生物学方法克隆、测序出的黄瓜 CsEXP10基因序列,应用一系列的生物信息学数据库和互联
网在线服务软件对 CsEXP10蛋白的理化性质、卷曲螺旋、疏水
性、信号肽、跨膜结构、糖基位点、活性位点、亚细胞定位及二
级和高级结构进行分析。所用生物信息学分析软件,见表 1。
2 结果与分析
2.1 黄瓜 CsEXP10蛋白的理化性质
克隆的 CsEXP10基因序列编码 248个氨基酸。利用 htp:
/www.expasy.ch/tools/protparam.html网站对蛋白质的各种理
化性质进行分析。预测结果显示:CsEXP10蛋白的分子量是
2008年第1期
NCBI:htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
EXPASy:htp://www.us.expasy.ch
htp://www.ch.embnet.org
htp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
htp://www.ch.embnet.org/software/tepred_form.html
htp://www.cbs.dut.dk/services
www.expasy.org/swissmod/swiss-model.html
AnthewinV5.0软件
Spdbv软件
表 1生物信息学分析软件
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
26957.5Da;理论等电点 pI9.645;该蛋白质由 20种氨基酸组成,其中 Gly、Ser、Ala、Asn含量最为丰富,Glu
和 His含量较少,不含 Asx、Glx和 Xaa(图 1);原子组成是 C1208H1813N339O341S13;消光系数:280nm时为 56420;
不稳定系数是 33.52,说明该蛋白是一个稳定蛋白;脂肪系数为 65.32;总平均亲水性为-0.123,说明该蛋白
是一个疏水蛋白。
2.2 CsEXP10蛋白的二级结构预测
利用 AnthewinV5.0软件对 CsEXP10蛋白的二级结构进行预测。预测结果(图 2)显示,在整个结构中
有四个 α-螺旋,分别是 1~9,73~78,123~136和 177~179四个区域;有 11个 β-折叠,其中 α-螺旋占到
11%,β-折叠占到 22%。
2.3 CsEXP10蛋白的卷曲螺旋结构预测
卷曲螺旋(coiledcoil)是控制蛋白质寡聚化的元件,它存在于很多蛋白质中,是一种很简单的三级结
构。蛋白质卷曲区域的预测网站是 htp:/www.ch.embnet.org。CsEXP10蛋白经网上预测后发现该蛋白不存
在卷曲螺旋结构。
2.4 CsEXP10蛋白的疏水性预测
蛋白质的疏水性分析是蛋白质二级结构以及三级结构预测中一个必要的过程,通过分析可以得到蛋
白质的亲疏水区域,一方面可以为二级结构预测结果提供参考,另一方面还可以为结构域以及功能域的划
分提供依据。利用 AnthewinV5.0软件对 CsEXP10蛋白的疏水性进行预测。从图 3中可以看出整个蛋白质
中有 6个疏水性区域。从前面的预测可知,这些区域实际上大部分是预测的 α-螺旋区,所以预测为疏水性
蛋白。
2.5 CsEXP10蛋白的信号肽预测
信号肽本身由氨基酸组成,是蛋白质的一部分,常位于蛋白质的一端。它将蛋白质导向细胞的正确位
置并使蛋白质越过细胞器的膜。预测蛋白质结构的同时对其进行信号肽分析有助于蛋白质功能域的区分
及蛋白质细胞定位。利用 htp:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/网站对 CsEXP10蛋白的信号肽进行预测。
标记为 C的列是剪切位点打分,标记为 S的列是信号肽打分,Y列是综合剪切点打分。只有 C、Y、S值的计
算结论为 YES的预测结果较好。具有高 C分值同时又是 S分值由高转低的位点才是信号肽预测的最可能
的剪切点。图 4中的第 18~19位点正是 CsEXP10蛋白信号肽预测的最可能的剪切点。
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2008年第2期
(下转第139页)
2.6 CsEXP10蛋白的跨膜结构预测
跨膜结构域是膜内在蛋白与膜脂相结合的主要
部位,一般由 20个左右的疏水氨基酸残基组成,形成
α-螺旋,它固着于细胞膜上起“锚定”作用[4]。跨膜结构
域的预测和分析,对正确认识和理解蛋白质的功能、
结构、分类、方位及细胞中作用部位均有着重要的指
示意义。利用网上膜结构分析程序 Tmpered,网址是:
www.ch.embnet.org/software/tepred_form.html,把 CsEXP10
氨基酸序列送到网上进行蛋白质二级结构预测,结果
发现,它具有 5个跨膜区域。图 5展示了 CsEXP10蛋
白的跨膜区域预测结果。从图中可以看出,CsEXP10
蛋白形成了 5次高峰,这 5次高峰就是它的跨膜区
域,分别是 1~19,27~53,52~72,85~109和 157~180。
2.7 糖基化位点预测
利用糖基化位点预测网站 htp:/www.cbs.dtu.dk/
services/对 CsEXP10蛋白的糖基化位点进行预测,结
果见图 6。从图 6可以看出,CsEXP10氨基酸序列有 10
个糖基化位点,分别是 18位的 S、57位的 T、143位的
S、183位的 S、204位的 S、220位的 S、224位的 T、225
位的 S、226位的 T和 227位的 S,其中 226位的 T位点可能性最大,143位的 S、225位的 S和 227位的 S
位点次之,其他位点的可能性相对较小。
2.8 CsEXP10蛋白的活性位点分析
利用网上蛋白质活性位点预测分析软件 Scanprosite,网址为 htp:/us.expasy.org,对 CsEXP10蛋白的氨
基酸序列进行了活性位点分析,在不同位置分别发现了 cAMP-和 cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点、蛋白
激酶 C磷酸化位点、酪氨酸激酶 I磷酸化位点和 N端酰基化位点等活性位点。
2.9 CsEXP10蛋白的亚细胞定位预测
蛋白质亚细胞定位预测分为 3个步骤。首先,为每一类亚细胞定位构建客观而具有代表性的数据集。
其次,从数据集中提取特征参数。最后通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的定位的相
似度,作出判断,一般会用一组概率的形式来表述。利用网上在线服务器,网址为 htp:/wolfpsort.seq.cbrc.
jp/对 CsEXP10蛋白的亚细胞定位进行预测,结果是:定位于细胞壁的可能性为 48.0%,定位于细胞质的可
能性为 16.0%,定位于细胞核的可能性为 12.0%,定位于分泌腺的可能性为 8.0%,定位于内质网的可能性
为 8.0%,定位于液泡的可能性为 4.0%,定位于线粒体的可能性为 4.0%。
从而推断 CsEXP10蛋白可能最终定位于细胞壁,即这种蛋白是一种细胞
壁蛋白,这个结论完全符合扩张蛋白家族的特性。
2.10 CsEXP10蛋白的高级结构预测
蛋白质高级结构的预测和分析,对理解蛋白质结构和功能之间的相
关性有着极其重要的意义。为了获得 CsEXP10蛋白的高级结构模拟图,先
把 CsEXP10蛋白的氨基酸序列通过网上在线服务器,网址为 www.expasy.
org/swissmod/swiss-model.html,生成原子坐标(PDB格式),然后利用 spdbv
软件观看 CsEXP10蛋白的三维立体分子结构 (图 7)。从图 7中可以清楚
图 7 CsEXP10蛋白的高级结构
1,2,3和 4:α-螺旋
孙涌栋等:黄瓜CsEXP10蛋白的结构构建和分析 135
2008年第2期
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(上接第135页)
地看出 CsEXP10蛋白有四个 α-螺旋。这与图 2蛋白质的二级结构预测结果相一致。
3 讨论
生物信息学是一门由分子生物学和信息科学技术相结合的交叉学科。随着人类基因组计划的完成,生
物科学的发展已从基因组时代步入蛋白质组时代。利用国际互联网资源对蛋白结构和功能预测分析不仅
有效地利用了生物信息资源,且大大缩短了实验周期,现已成为生物学研究领域的热点和方向之一。目前
为止,CsEXP10蛋白的结构和功能方面的研究,还未见报道。利用生物信息学资源对 CsEXP10蛋白的结构
和功能进行预测,为今后对该蛋白的结构和功能的研究提供理论参考依据,同时也为该蛋白在植物体内的
作用机制及基因的表达调控提供一定的线索。
参考 文献
1 McQueen-MasonSJ,CosgroveDJ.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:6574~6578.
2 McQueen-MasonSJ,DurachkoDM,CosgroveDJ.PlantCel,1992,4(9):1425~1433.
3 孙涌栋,张兴国,杜小兵,等.植物生理与分子生物学学报,2006,32(3):375~380.
4 翟中和,王喜忠,丁明孝.细胞生物学[M].北京:高教出版社,2000,79~240.
的,这样可减少成活小孢子数目,减少它们之间竞争;第三,高温是小孢子发育同步化,增加处于发育周期
中诱导敏感阶段小孢子数;第四,高温损害非单倍体,促进单倍体生长。
3.4 碳源与胚状体的诱导
花培中,糖不仅是作为渗透稳定剂,维持细胞和培养基渗透压,而且还是重要碳源,其种类和浓度大小
对胚状体诱导有很大影响。油菜花药培养中,Dunwel和 Thurling报道蔗糖浓度对小孢子活力及胚状体发生
有影响,并认为高浓度蔗糖对小孢子启动是必需的,但随后又阻碍小孢子进一步发育。陈军等[10]也表明,高
浓度蔗糖在培养起始最重要作用之一是维持小孢子活力,但随后又影响小孢子进一步膨大,从而影响其发
育。以蔗糖和麦芽糖为碳源,试验结果发现,菜心花药培养以 13%的蔗糖浓度效果最好,在 10%和 19%的
蔗糖浓度中没有产生胚,说明一定浓度蔗糖可促进胚产生,但浓度过低或过高均不能诱导出小孢子胚。
麦芽糖等其它碳源已用于小麦等作物的花药培养中[11],但在蔬菜花药培养上还未应用。余凤群等[12]用
13%的麦芽糖代替蔗糖,没有诱导出胚。采用蔗糖与麦芽糖配合使用,结果表明,培养基中随着蔗糖浓度减
少,麦芽糖浓度增加,胚状体诱导频率逐渐下降,当麦芽糖浓度为 13%时,无胚产生,说明麦芽糖不适合用
作菜心花药培养碳源。
参考 文献
1 CaoMQ,LiuF,LiY,etal.ActaHorticulture,1995,392:27~38.
2 王晓佳.中国蔬菜,1988,(2):59.
3 钟维瑾,方光华.上海农业学报,1990,6(2):7~14.
4 王怀名,G米克斯-瓦格钠,杨艳丽.华北农学报,1992,7(4):61~67.
5 钟维瑾,方光华.上海农业学报,1990,6(2):7~14.
6 寸守铣,万萌,邱仕芳,等.西南农业学报,1994,7(3):32~35.
7 徐武,李鸣,张敬,等.遗传学报,1997,24(2):165~169.
8 VergneP.Progressinplantcelularandmolecularbiology.London:KluwerAcademicPublisher,1990,416~421.
9 SeikiSato,NorioRatah.BreadingScience,2002,52(1):23~26.
10 陈军,陈正华,刘澄清,等.遗传学报,1995,22(4):307~315.
11 陈耀峰,朱庆麟.作物学报,1993,14(4):401.
12 余凤群,刘后利,傅丽霞.华中农业大学学报,1995,14(6):522~526.
朱允华等:菜薹花药培养诱导胚状体的研究 139