全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
基因预测与 PCR技术相结合从 cDNA
文库中获取表达基因的研究
谢小燕 谭有将 李景全 陈芳 高剑峰
(石河子大学生命科学学院,石河子 832003 )
摘 要: 应用计算机工具、G enScan软件预测中国美利奴绵羊 MHC C lass I区段的 BAC 文库中 453o 克隆的基因数目、
特性及结构, 建立一种可以从 cDNA文库中简便有效获取表达基因的技术方法。选取 4个预测基因作研究对象设计引物,应
用 PCR技术,对已构建好的 cDNA文库进行 PCR扩增, 回收 !目的基因 ∀片段并连接 pGEMT载体, 转 DH5大肠杆菌中扩增
后测序。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物, cDNA文库中有目的条带, 测序结果与 G enBank进行 B last分析, 分析结果表明
这些基因与羊的基因均具有 99%以上的相似性。因此应用基因预测分析与 PCR结合技术可简便迅速的从 cDNA文库中获取
表达基因。
关键词: 基因预测 PCR cDNA文库
Gene Prediction by GenScan Software Combined w ith the PCR
Technique to Obtain Specific Expressed Genes from cDNA L ibrary
Xie X iaoyan T an Youjiang L i Jingquan Chen Fang Gao J ianfeng
(College of L ife Science, Shihezi University, Shihez i 832003)
Abstrac:t P redicting the num be r, identity and structure of genes of 453o clon ing, w hich in the BAC library o f Ch ineseM er ino
sheepMHC C lass# sec tion by com puter and GenScan softw are, a techn ica lm e thod that could sim ply and effectively access expressed
gene from the cDNA libraryw as estab lished. Four genes as study objections w ere selected, and spec ific prim ers w ere des igned to am pli
fied these genes from the library. PCR produces we re linked to the pGEMT vector, then transform the vec to rwh ich conta in target genes
intoE. co li DH 5. By agarose gel electropho res is, w e detec ted the purpose bands, then w e sequence the PCR products, blast the se
quences w ith the sheep gene, and the results show s high iden tity( m ore than 99% ) . The re fo re, the technicalm ethod that integrated gene
pred icted ana lysis and PCR could obta in expressed gene from the library easily and quick ly.
Key words: Gene pred icting PCR cDNA library
收稿日期: 20100317
基金项目:中国美利奴绵羊 MHC区段基因组成与结构研究项目 (国际合作项目, 2006DFB33750)
作者简介:谢小燕,女,硕士生,主要从事生物化学与分子生物学研究
通讯作者:高剑锋,男,教授,主要从事生物化学与分子免疫学研究; Em ai:l jian fengg@ sh zu. edu. cn
基因分离和克隆是分子生物学研究的一项基础
性工作,随着分子生物学的迅速发展,目前涌现出了
一系列克隆基因的技术,并得到广泛应用 [ 1- 5]。 cD
NA文库筛选是目前最经典、应用最普遍的一种克
隆全长基因序列的技术, 它又可分为以核酸探针杂
交为基础的文库筛选法和以 PCR为基础的文库筛
选法。以核酸探针杂交为基础的文库筛选, 优点是
准确性高,特别是当目的基因在文库中的丰度很低
时, 采用这种方法非常有效, 但放射性同位素对人体
危害大, 周期长 [ 6]。与上述方法相比, 利用生物信
息学软件与 PCR技术结合的方法可以简单快速的
从 cDNA文库中获取目的序列的基因组成, 进而为
基因功能的研究提供研究靶点。该方法具有操作简
单快捷、试验费用低、周期短等优点。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
1 材料与方法
11 材料
中国美利奴绵羊 cDNA文库由本实验室构建;
中国美利奴绵羊 BAC文库由中国科学院刘海波博
士构建; 14种新疆各地方的绵羊血样; 克隆载体
pGEM T vector, Taq酶购自 Promega公司。大肠杆
菌宿主菌株 DH5由本实验室提供。
12 质粒获取
从中国美利奴绵羊的 BAC文库中筛选出 26个
MHC区段的阳性克隆, 测序。从中选取 MHC C lass
I区段的 453o 克隆为研究对象, 采用碱裂解法小
量提取质粒。
13 绵羊全血中 DNA的提取
采取绵羊血样 5 - 10 mL 离心, 收集细胞,
NH4C l溶液溶解红细胞, 离心, 弃上清, NH 4 C l溶液
溶解红细胞,离心。重复步骤直到离心收集到的细
胞为灰白色为止。加入 DNA提取缓冲液悬浮细胞,
蛋白酶消化,同时加入 10% SDS过夜, 再加入适量
的 5mo l/L NaC l溶液混合,溶解沉淀直到溶液变澄
清。离心,取上清酒精沉淀,离心晾干, TE溶解,测
浓度为 1 g /L。
14 基因预测与引物设计
应用 G enScan软件对 453o 克隆的序列进行
基因预测。预测结果有 15个完整基因, 从中选取
C10、C11、C13、C15四个基因设计引物。引物由北
京华大基因有限公司合成。
目的序列的 PCR引物: Cxxy10F: 5∃GAGGAT
CAAATTGCCAACA 3∃, Cxxy10R: 5∃TCTTGAATAT
GCTATCTAAGTTGGT3∃; Cxxy11F: 5∃AAGCCAGG
AACAGGGTAT3∃, Cxxy11R: 5∃ACAGGGATGGAAA
GATGAA3∃; Cxxy13F: 5∃ATTGTCACCCTGCTTATT
3∃, Cxxy13R: 5∃GCTCAGCCTTCTTCATAG3∃; Cxxy
15F: 5∃AGCCTTCTTCAGCAATCA3∃, Cxxy15R: 5∃
GTGCAGCACTTTCACAGC3∃。
15 PCR扩增
取 100 L噬菌体溶液, 98% 破壁 2 m in后作为
模板备用。 20 L反应体系: 模板 4 L, 10 & PCR缓
冲液 20 L, dNTP( each 25mmol /L ) 05 L, 引物
( 10mmo l /L)各 1 L, Taq酶 15 U, ddH 2O补至总
体积 20 L。 94% 预热 5m in,然后以 94% 变性 45 s,
按各引物的退火温度需要设置退火温度, 退火
1m in, 72% 延伸 1m in, 40个循环, 72% 延伸 10m in。
反应完毕后,取 3 L PCR产物进行 10%琼脂糖凝
胶电泳检测,检查有无目的条带。
16 PCR产物回收、连接、鉴定
PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶回收后, 与
pGEM T载体连接, 4% 过夜。转化到感受态菌株 DH
5中,蓝白斑筛选, 挑取白斑进行菌落 PCR方法鉴
定重组克隆。
17 核苷酸序列测定及其生物信息学分析
将阳性重组子穿刺培养后,送北京华大基因测
序, 结果采用 BLAST方法与 GenBank序列进行同源
性比较。
2 结果
21 质粒获取与绵羊全血中 DNA的提取
将提取的质粒与绵羊全血中的 DNA分别用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图 1,图 2所示。
图 1 绵羊基因组 DNA
图 2 质粒 DNA
22 PCR扩增
PCR扩增 C10、C11、C13、C15其中 C11(结果未
显示 )没有扩增出目的条带,结果如图 3-图 5所示。
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2010年第 9期 谢小燕等: 基因预测与 PCR技术相结合从 cDNA文库中获取表达基因的研究
1. m arker∋ ; 2. 453o 克隆质粒作为阳性对照; 3, 4.绵羊
基因组 DNA为模板; 5.绵羊 cDNA文库为模板
图 3 C10 PCR电泳图
1. DL2000; 2. CK; 3. 453 o 克隆质粒作为阳性对照; 4.绵羊
基因组 DNA为模板; 5. KK64; 6- 8.绵羊 cDNA文库为模板
图 4 C13 PCR电泳图
1. m ark er∋ ; 2. 453o 克隆质粒作为阳性对照; 3.绵羊
基因组 DNA为模板; 4.绵羊 cDNA文库为模板; 5. CK
图 5 C15 PCR电泳图
23 PCR产物回收、连接、鉴定
PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶回收后, 与
pGEM T载体 4% 连接过夜, 转化到感受态菌株
DH5中,蓝白斑筛选, 挑取白斑进行菌落 PCR方
法鉴定重组克隆。鉴定结果如图 6-图 8所示。
1. m arker∋ ; 2 - 4. C10 cDNA文库 PCR产物鉴定;
5.基因组菌落 PCR; 6. CK; 7.基因组菌落 PCR
图 6 C10菌落 PCR鉴定结果
1. CK; 2, 3.基因组菌落 PCR; 4, 5. C 13 cDNA文库
PCR产物; 6. 453o 克隆 PCR产物; 7. DL200
图 7 C13菌落 PCR鉴定结果
1. CK; 2- 4. C15 cDNA文库 PCR产物;
5 - 7. 基因组菌落 PCR; 8. m arker∋
图 8 C15菌落 PCR鉴定结果
24 核苷酸序列测定及其生物信息学分析
将阳性重组子穿刺培养后,送北京华大基因测
序, 结果采用 BLAST方法与 GenBank序列进行同源
性比较。测序结果显示, 基因组扩增出来的序列与
cDNA文库扩增出来的序列有着 99%以上的相似
性; 采用 BLAST方法与 GenBank中的序列比对结果
显示,此 3个基因为羊的基因, 但是具体是什么基
因, 基因库里并没有相关注析,其功能与特性还有待
进一步的试验研究。
3 讨论
PCR是 20世纪 80年代发展起来的一种体外脱
氧核糖核酸扩增系统,此前 DNA扩增一般采用分子
63
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
克隆法。PCR的快速、灵敏、操作简便等优点, 已成
为基因工程研究中不可缺少的技术之一 [ 7]。本研
究首次将这一技术与基因预测结合起来应用到 cD
NA文库的筛选中。鉴于 cDNA中不存在内含子和
其它重复序列,我们采用了基因预测与 PCR结合的
方法, 预测出目的片段的基因以及基因的 CDs序
列,根据 CD s序列设计引物。直接以绵羊的基因组
和 cDNA文库做模板,扩增出目的基因。该技术较
之噬菌体原位杂交 [ 8]以及噬菌体原位杂交与 PCR
技术相结合筛选 cDNA文库的方法更为简单、快捷。
以往的噬菌体原位杂交的方法由于需要反复接触放
射性同位素,因此对身体伤害较大, 也比较危险,而
用此方法, 可以去除这些顾虑。采用基因组和 cD
NA文库同时进行扩增并测序比对, 就进一步使试
验结果更可信。当然采用该方法时, 必须已知用于
杂交的序列,这样才可以预测出该段杂交序列的基
因和 CDs区,引物设计才有章可循。同时设计引物
的位置也是非常重要的。在外显子比较连续的区域
设计引物是该方法成功的关键所在。由于基因预测
是根据 ORFs,所以基因预测的结果可能比目的序列
真正含有的基因要多, 这就有可能使部分预测出的
基因不能从 cDNA文库中获得, 同时 cDNA文库的
质量也会在很大程度上影响目的基因的获取, 如在
本试验中没有扩增出来的 C11基因就有可能属于
上述两种情况。综上所述, 该方法较之与原位杂交
的方法更具有简便快捷、经济有效的特点。因此,本
研究认为运用基因预测与 PCR相结合从 cDNA文
库中获得表达基因是一种行之有效的方法。
参 考 文 献
[ 1] S earlesLL, Jokerst RS, B inghham PM, et a.l Molecu lar clon ing of se
qu ences from a d rosoph ila RNA polym erase locus by Pelem ent
transposon tagging. C el,l 1982, 31: 585588.
[ 2] S ongWY, W ang GL, Ch en LL, et a.l A receptor k inase like protein
cod ed by the rice d isease res is tan ce gen e, Xa21. S cience, 1995, 270:
18041806.
[ 3 ] Liang P, Pardee AB. D ifferen tial d isp lay of eukaryot ic m essenger
RNA by m ean s of the po lym erase ch ain react ion. Science, 1992, 257
( 14) : 967971.
[ 4] L is itsyn N,i L is itsyn N a, W igler M. C lon ing the differences betw een
tw o com p lex genom es. Scien ce, 1993, 259 ( 12) : 946951.
[ 5] D iatchenho L, Lau YF, Cam pbell AP, et a.l Supp ression sub tract ive
hybrid izat ion: am ethod for generating d ifferent ially regu lated or tis
su esp ecific cDNA probes and lib raries. Proc Natl A cad S ci USA,
1996, 93: 60256030.
[ 6] B entonWD, Dav is PW. Screen ing lgt recom b inant clones by hybrid
ization to s ingle p laqu es in situ. S cien ce, 1977, 196: 180182.
[ 7] 朱平. PCR基因扩增实验操作手册 [M ] .北京:中国科学技术出
版社, 1992.
[ 8] 萨姆布鲁克 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆试验指南 (第
2版 ) [M ] .北京:科学出版社, 2002: 154160.
(上接第 50页 )
[ 6] 赵丽红,杨宝玉,吴礼树,等. 重金属污染的转基因植物修复 原
理与应用.中国生物工程杂志, 2004, 24( 6 ): 6874.
[ 7] 刘义,何钢.细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用.生物
技术通报, 2008 ( 2) : 3538.
[ 8] Fran cova K, Mackova M, M acekSylvestre M. Ab il ity of bacterial b i
phenyl dioxygenases from Bu rkh old eria sp. LB400 and C omarnonas
testosterone B356 to catalyse oxygenation of orthohydroxych lorob i
phenyls form ed from PCB s by p lants. Environ Po llu tion, 2004, 127
( 1) : 4148.
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