全 文 ：生防菌 ZJY21 及 ZJY2116 的 GFP 标记及其
在黄瓜根围的生态适应性 3
张　昕1 　张炳欣1 3 3 　喻景权1 　张　震2 　沈卫峰2 　陈振宇3 　石　江4
(1 浙江大学农业与生物技术学院 ,杭州 310029 ;2 浙江农业科学院 ,杭州 310021 ;3 浙江大学图书馆 ,杭州 310029 ;
4 杭州市蔬菜研究所 ,杭州 316004)
【摘要】　将具有绿色荧光蛋白 ( GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒 pRP222GFP 导入生防菌 B revibacillus
brevis ZJ Y21 和 B acillus subtilis ZJ Y2116 中 ,用这些标记菌株处理黄瓜种子 ,出苗后通过定期分离计数具有
上述表型的转化子 ,研究了 2 株生防菌在黄瓜根围的定殖规律. 结果表明 ,在整个生育期 2 株生防菌株均
能在黄瓜根围有效定殖 ,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰. 盆栽试验发现 ,引入黄瓜根围的 2 株生
防菌有向周边杂草迁移的特性 ,且在前一季寄主植物死亡后 ,菌株可在下一季植株根围增殖.
关键词 　质粒 pRP222GFP 　GFP 基因 　短短芽孢杆菌 　枯草芽孢杆菌 　黄瓜根围 　定殖
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 11 - 2144 - 05 　中图分类号 　S336 　文献标识码 　A
Labeling of biocontrol agents ZJY21 and ZJY2116 gf p gene and its ecological adaptability in cucumber rhizo2
sphere. ZHAN G Xin1 ,ZHAN G Bingxin1 , YU Jingquan1 ,ZHAN G Zhen2 ,SHEN Weifeng2 ,CHEN Zhenyu3 ,SHI
Jiang4 (1 College of A griculture and Biotechnology , Zhejiang U niversity , Hangz hou 310029 , China ; 2 Zhejiang
Academy of A gricultural Science , Hangz hou 310021 , China ; 3 L ibrary of Zhejiang U niversity , Hangz hou
316004 , China ; 4 V egetable Institute of Hangz hou , Hangz hou 316004 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,
16 (11) :2144～2148.
The recombined plasmid pRP222GFP contained with gf p gene and chloramphenicol resistant was successfully in2
troduced into two biocontrol agents B revibacillus brevis ZJ Y21 and B acillus subtilis ZJ Y2116. After seed inocula2
tion ,the survival and colonization of the two strains were studied by periodically retrieving the GFP2tagged
strains in the cucumber rhizosphere based on the selective markers. The results showed that both the strains could
successfully colonize in the rhizosphere during the whole life of cucumber ,and a higher colonization level was ob2
served during anthesis and fruition stages. In pot trials ,they could migrate to the nearby non2inoculated sponta2
neous weed plants ,and reestablish in the rhizosphere of plants subsequently grown in the same pot .
Key words 　Plasmid pRP222GFP , Gf p gene , B revibacillus brevis , B acillus subtili , Cucumber rhizosphere ,
Colonization. 3 国家自然科学基金重点资助项目 (30230250) .3 3 通讯联系人.
2005 - 03 - 02 收稿 ,2005 - 06 - 13 接受.
1 　引 　　言
一些根围细菌能通过分泌植物生长激素和对病
原菌有拮抗作用的次生代谢产物等机制起到促进植
物生长和防治植物病害的作用[2 ,26 ,27 ] . 目前已有很
多关 于 根 围 细 菌 促 生 防 病 效 应 的 研 究 报
道[6 ,11 ,19 ,29 ] . 引入根围的生防因子能否发挥预期的
生防作用 ,有赖于该因子的成功存活和有效定殖 ,因
此有必要选择理想的研究方法 ,跟踪检测环境中的
生防菌株 ,从而明确其在田间的定殖规律及其与其
它各因素的相互制约关系. 为了与土壤习居菌分开 ,
通常需要对引入根围的有益菌进行特殊标记. 很久
以来 ,抗生素标记成为人们常用的手段[3 ,5 ,17 ,20 ] ,可
是这种方法却不易区别环境中对标记抗生素有同样
抗性的土著微生物 ,而且使用选择平板法并不能明
确细菌在根围小生境的空间分布. 标记基因技术的
建立与发展 ,为根围细菌定殖的微生态学研究提供
了有效手段. lacZ、gus、xyl E 以及 l ux 等标记基因
已被广泛应用于微生物的环境示踪[7 ,10 ,15 ,25 ,28 ] . 其
中绿色荧光蛋白 ( GFP) 因为荧光性能稳定、检测方
便以及表达不受受体种属限制等特性 ,而越来越为
人们重视[14 ] ,并被成功地用于研究细菌在植物根部
的定殖[8 ,13 ,18 ]及工程菌向环境的释放[4 ,12 ,21 ] .
利用构建的含 GFP 基因和氯霉素抗性的质粒 ,
分别转化对黄瓜枯萎病菌 ( Fusari um oxysporum )有
明显抑制作用的生防菌株 B revibacill us brevis ZJ Y2
应 用 生 态 学 报 　2005 年 11 月 　第 16 卷 　第 11 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Nov. 2005 ,16 (11)∶2144～2148
1 和 B acill us subtilis ZJ Y2116 ,得到具有 GFP 绿色
荧光和氯霉素抗性的转化子. 用这些标记菌株处理
黄瓜种子 ,通过筛选具有上述表型的菌落 ,研究了 2
株生防菌株在黄瓜根围的定殖规律. 本试验证明了
GFP 和氯霉素抗性双标记系统检测生防菌的可靠
性 ,以及菌株在田间定殖的可行性 ,为菌株的实际开
发利用提供依据.
2 　材料与方法
211 　供试材料
生防菌株 ZJ Y21 ( B revibacillus brevis)和 ZJ Y2116 ( B acil2
l us subtilis)系本试验室分离自温室大棚黄瓜根围土壤 ,对黄
瓜枯萎病菌 ( F. o. c) 菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制
作用. 质粒 pRP22 由江苏农业科学院陈志谊老师惠赠 ,具有
氯霉素抗性标记 ; E. coli2B . subtilis 穿梭载体 pRP222GFP 是
将 xyl R2gf p 的 Kpn Ⅰ/ S ph Ⅰ双酶切片段插入 pRP22 质粒
的相应酶切位点构建而成 ,携带有组成型表达的 gf p 基因和
氯霉素抗性. 氯霉素购自上海生物工程公司 ,使用浓度为 3
mg·L - 1 . 供试土壤为杭州华家池地区菜园土. 供试作物为黄
瓜 (品种 :新泰密刺) .
212 　试验方法
21211 菌株对病原菌的抑制作用 　生防菌株对 F. o. c 菌丝
生长的抑制作用采用平皿对峙法测定 ;对孢子萌发的抑制作
用参照林福呈等方法测定 [16 ] .
21212 菌株转化及质粒稳定性测定 　重组质粒 pRP222GFP
在大肠杆菌 TG1 中扩繁后 ,采用 SDS碱裂解法提取. 质粒向
受体菌的原生质体高频转化主要参照文献 [9 ]进行 ,略有修
改.受体菌在 LB 培养液 37 ℃下振荡培养到对数期. 取 5 ml
菌液 ,离心收集菌体 ,然后将菌体悬浮于 015 ml SMML (2 ×
SMM 与 4 ×LB 液等体积混合)缓冲液 ,振荡摇匀后加入 4μl
50 mg·ml - 1溶菌酶 ,充分混匀后于 37 ℃下振荡培养 2 h.
3 000 r ·min - 1 离心 10 min , 去上清后在管中加入 2 ml
SMML 缓冲液 ,悬浮均匀后离心 ,在沉淀里加入 015 ml
SMML ,充分悬浮后再加入 011 ml 体积比为 1∶1 的质粒与 2
×SMM 混合液. 加入 115 ml 40 %PEG ,室温放置 2 min 后再
加入 5 ml 缓冲液 ,离心后去上清液 ,在沉淀中加入 1 ml 缓冲
液 ,悬浮后 30 ℃摇床上培养 115 h. 吸取 011 ml 液体至 DM2
3 再生培养基上 ,37 ℃过夜培养. 标记菌株代时及外源质粒
稳定性的测定参照吕泽勋等的方法进行 [13 ] .
21213 黄瓜种子和细菌接种物的准备 　黄瓜种子表面消毒、
清水漂洗后 ,催芽待用. 细菌接种物准备 :转化菌株 ZJ Y21 G
和 ZJ Y2116 G在 LB 平板上分别培养 24 h 后 ,用无菌水稀释
至 A600 = 1 [即 ZJ Y21 G 为 618 ×107 菌落形成单位 (CFU) ·
ml - 1 ,ZJ Y2116 G为 714 ×107 CFU·ml - 1 ]浸泡黄瓜种子. 2 h
后取出种子 ,自然凉干播种.
21214 盆栽试验 　将新鲜培养的病原菌菌碟接入查氏培养
液 ,在 26 ℃、200 r·min - 1摇培 ,待孢子大量形成时 ,用双层
灭菌纱布过滤培养液 ,所得滤液经血球计数器计数孢子浓度
后 ,待用. 盆栽用土准备 :将取回土壤过筛 (20 目) 分为 2 份 ,
其中 1 份称重后加入病原菌的孢子悬液 ,制成密度为 1 ×106
CFU·g - 1病土 ,另 1 份加入等量无菌水 ,分别搅拌均匀后 ,装
钵.每钵播入 10 粒种子 ,每个菌株 2 种土壤处理 ,每种处理
10 钵 ,设 3 次重复. 出苗后每隔 3 d 浇 1 次水. 此外 ,为研究
菌株在第二季植物根围的富集情况 ,黄瓜生育期结束后 10
d ,重新在盆钵中播种第二季的黄瓜种子.
21215 田间小区测定 　种子经上述两个标记菌株处理后 ,按
常规的栽培模式播入田间 ,每种种子处理的播种面积为 10
m
2
,设 3 个重复 ,在整个生育期定期回收标记菌株.
21216 菌株的定期回收 　黄瓜出苗后 ,按 1 ,4 ,7 ,10 d. . . . . .
的时间间隔 ,将黄瓜苗连根带土挖掘出来 ,把紧贴于根上的
薄层土壤用无菌水洗下. 悬浊液经一系列倍比稀释后 ,分别
吸取 100μl 悬液均匀涂布平板 ,每稀释度 3 个重复 ,最后于
37 ℃培养. 24 h 后在紫外透射仪波长 230 nm 下计数荧光菌
落.为研究菌株的迁移特性 ,对盆栽试验中随机长出的杂草
根围用同样方法进行分离.
3 　结果与分析
311 　生防菌株对 F. o. c 的抑制
平皿对峙试验中 ,供试 2 株生防菌明显地抑制
F. o. c 菌丝的生长 ,菌落周围有清晰的抑菌圈 (图
1) . 此外 ,2 菌株的抗菌水溶液均能显著抑制分生孢
子的萌发和芽管的生长 (表 1) .
图 1 　生防菌对 F. o. c 的抑制作用
Fig. 1 Inhibition effect of biocontrol agents to F. o. c.
表 1 　抗菌水溶液对 F. o. c 分生孢子萌发和芽管生长的抑制作用
Table 1 Inhibition effect of antagonistic metabolites in aqueous concen2
trate on germination and tube growth of conidia of F. o. c
处 　理
Treatment
发芽率 Germination rate ( %)
发芽率
Germination
rate ( %)
抑制效果
Inhibition
effect ( %)
显著性
Signifi2
cance
芽管长 Tube length(μm)
发芽率
Germination
rate ( %)
抑制效果
Inhibition
effect ( %)
显著性
Signifi2
cance
CK 100 - a 229 - a
ZJ Y211) 4 9610 b 4112 8210 b
ZJ Y21161) 517 9413 b 4316 8110 b
1)拮抗水溶液 Antagonistic metabolites.
312 　质粒向生防菌的转化
用质粒 pRP222GFP 转化上述生防菌的原生质
体细胞后得到了大量的转化子. 它们在 LB 平板上
541211 期 　　　　　　张 　昕等 :生防菌 ZJ Y21 及 ZJ Y2116 的 GFP 标记及其在黄瓜根围的生态适应性
表现出氯霉素抗性 ,在荧光显微镜下 ,菌体呈现明亮
的绿色 (图 2) . 分别选取其中之一定名为 ZJ Y21 G和
ZJ Y2116 G. xyl R2gf p 基因的 PCR 扩增显示 2 菌株
携带有 GFP 标记的外源质粒 (图 3) .
图 2 　转化菌株在荧光显微镜下
Fig. 2 Transformants under fluorescence.
图 3 　重组质粒酶切及 xylR2gf p 基因的 PCR 扩增
Fig. 3 Plasmids digestion and xylR2gf p PCR amplification.
泳道 1 ,3 :两菌株抽提质粒的 Kpn Ⅰ/ S ph Ⅰ双酶切 Plasmids digested
by Kpn Ⅰ/ S ph Ⅰ;泳道 2 ,4 :转化菌株 xylR2gf p 的 PCR 扩增 xylR2
gf p PCR amplification from plasmid.
313 　质粒稳定性的测定
质粒稳定性结果表明 ,在无选择压力培养条件
下 ,菌株 ZJ Y21 G 连续传 10 代 , 质粒保存率为
8211 % ;连续传 70 代 ,质粒保存率为 911 %. 菌株
ZJ Y2116 G连续传 10 代 ,质粒保存率为 6913 % ;连
续传 70 代 ,质粒保存率为零.
314 　盆栽条件下菌株在黄瓜根围的定殖
研究发现 ,2 菌株在病土和自然土中呈现类似
的动态变化规律. 黄瓜出苗后的前 22 d ,标记菌株的
种群数量呈波浪状下降趋势 ,且未接种病原菌的黄
瓜根围的标记菌株数量有略高于接种病原菌的黄瓜
根围的趋势 (图 4) . 之后 ,随着黄瓜盛花期和盛果期
的出现 ,标记菌株种群有所回升 ,并出现数量高峰.
高峰过后 ,随着植株的逐步衰败 ,种群密度又呈下降
趋势 ,并在植株死亡后趋于平稳状态 ,2 个菌株具有
一致性. 此外 ,对盆钵中随机长出的杂草根围的分离
也发现了标记菌株的存在 ,说明标记菌株有向周边
杂草迁移的特性.
图 4 　盆栽条件下标记菌株在黄瓜根围定殖的动态变化
Fig. 4 Dynamic variation of labeled strains in cucumber rhizosphere in
the pot .
A :菌株 ZJ Y21 G在自然土中 ZJ Y21 G in natural soil ;B :ZJ Y21 G在病原
菌接种土 ZJ Y21 G in soil inoculated with pathogen ; C :菌株 ZJ Y2116 G
在自然土中 ZJ Y2116 G in natural soil ;D : ZJ Y2116 G在病原菌接种土
ZJ Y2116 G in soil inoculated with pathogen.
315 　室内盆栽条件下菌株在第二季植物根围的增
殖
　　待黄瓜植株生育期结束后 ,在上述盆钵中播种
第二季的黄瓜种子 ,定期取样发现 ,有黄瓜植株生长
的盆钵中的标记菌株数量均明显高于无苗土中标记
菌数 (图 5) . 这种现象说明 ,菌株能在第二季的黄瓜
植株根围增殖 ,2 个菌株具有一致性.
图 5 　黄瓜植株生育期结束后菌株的定殖动态
Fig. 5 Dynamic variation of labelled strains following crop harvest .
A :ZJ Y21 G 在第二季黄瓜根围 ZJ Y21 G in re2planted cucumber rhizo2
sphere ;B :ZJ Y2116 G 在第二季黄瓜根围 ZJ Y2116 G in re2planted cu2
cumber rhizosphere ; C : ZJ Y21 G 在无苗土中 ZJ Y21 G in non2planted
soil ;D :ZJ Y2116 G在无苗土中 ZJ Y2116 G in non2planted soil.
316 　田间小区情况下菌株在黄瓜根围的定殖
两细菌菌株在田间小区条件下 ,呈现相似的动
态变化规律 (图 6) . 接种后至盛花期前数量逐渐降
低 ,在盛花期和盛果期有所回升 ,并出现数量高峰 ,
后随着黄瓜植株的衰亡 ,种群略有下降 ,并在土壤中
以相当数量群稳定存在.
4 　讨 　　论
本文通过原生质体高频转化法成功地实现了
GFP标记质粒向2株生防菌株的转化 ,得到了2个
6412　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
图 6 　田间条件下标记菌株在黄瓜根围定殖的动态变化
Fig. 6 Dynamic variation of labeled strains in cucumber rhizosphere in
the field.
A :ZJ Y21 G的动态变化 Dynamic variations of ZJ Y21 G;B :ZJ Y2116 G的
动态变化 Dynamic variations of ZJ Y2116 G.
具 GFP 标记和氯霉素抗性的转化子. 尽管在液体培
养基条件下连续培养 70 代后 ,菌株 ZJ Y2116 G的质
粒保存率为零 ,而菌株 ZJ Y21 G 的质粒保存率也仅
为 911 % ,但在播种有标记菌株的土壤中 6 个月后
仍能回收到较高数量种群的转化子 ( 104 CFU ·
g - 1) . 其原因可能是黄瓜根围的营养较培养液贫乏 ,
造成菌株代时延长 ,从而使得质粒丢失率比试验室
条件下低的多.
根围细菌与植物之间存在着密切的互作关
系[1 ,22 ] .前者通过直接或间接的生物机制促进植物
的生长发育 ,植物在代谢过程中引起的微环境理化
变化 ,又反作用于其根围的细菌. 本研究中细菌的种
群数量在植物代谢最为旺盛的盛花期和盛果期出现
高峰 ,以及标记菌株在有黄瓜植株生长的盆钵中的
数量明显高于无苗土的研究结果 ,也证明了这一点.
生防菌能正常发挥功能的一个必要条件就是施
用后该菌株能在不同于最初生境的环境下存活 ,并
在植物根围有效定殖. 我们的结果表明 ,2 株分离自
黄瓜根围的细菌菌株在供试黄瓜的整个生育期均可
有效定殖 ,并可向邻近未接种的野生杂草迁移 ,而且
植株死亡后还可以在第二季播种的黄瓜根围增殖 ,
与 Wiehe 等的研究结果一致[23 ,24 ] . 由此可见 ,2 株
生防菌具有广泛的环境适应性和在植物根围稳定定
殖的潜力. 本研究为生防菌的实际开发利用提供了
有利依据.
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态与生态旅游规划和管理 ,污染生态与环境生态工程 ,城市生态与城市生态建设 ,景观生态与区域生态建设 ,
保护生物学与生物多样性 ,全球重大生态问题与对策.
本书可供生态学、农学、林学、地学和环境科学等领域的科技人员参考 ,也可供有关研究部门管理者和高
等院校师生参考.
本书由科学出版社出版 ,计 146 万字 ,定价为 163 元 ,另加邮费 10 元 ,有需要者请与《应用生态学报》编
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