全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2008年第1期
收稿日期:2007-07-05
作者简介:洪亚辉(1955-),女,湖南益阳人,硕士生导师;yahuihong@vip.sina.com
MTT法检测石刁柏悬浮细胞技术的研究
洪亚辉 1,2 周涌 1 周向华 1 程鹏 2 张永和 1
(1湖南农业大学生物科学与技术学院,长沙 410128;2湖南农业大学 湖南省植物激素与生长发育重点实验室,长沙 410128)
摘 要: 本研究确定了MTT法测定悬浮培养的石刁柏细胞活力所需的最适条件为:比色波长560nm,最适缓冲
液为柠檬酸钠-Vc缓冲液,渗透促进剂为二甲基亚砜,洗脱剂为酸化异丙醇,0.133‰浓度的MTT溶液适于对未知培养时
期的细胞计数,0.267‰浓度的MTT溶液适于鉴定细胞活力;同时,本研究通过MTT对培养细胞的生长过程进行了测
定,确定细胞活性最强时期为指数期;并研究了细胞数量与吸光值之间的关系以及培养时间对MTT染色的影响。
关键词: 石刁柏 MTT 细胞活力
ResearchonMTTMethodforDetectingtheCelViabilityof
AsparagussuspendedCels
HongYahui1.2 ZhouYong1 ZhouXianghua1 ChengPeng2 ZhangYonghe1
(1ColegeofBioscienceandTechnological,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128;2HunanProvincialKey
LaboratoryofPhytohormonesandGrowthDevelopment,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128)
Abstract: ThisresearchoptimizedtheMTTmethodfordetectingthecelviabilityoftheasparagussuspended
cels.Theoptimizedcondition:560nmColorimetricwavelength,sodiumcitrate-Vc(Na2HPO4-C6H8O7(0.1mol/L,PH7.0)is
thebufer,DMSO isusedtoenhancethepermeabilityofcel.Therinsebuferisacidicisopropyl.0.133‰ MTT is
appropriateforcountingthecelsgrowingatanunknownphase,0.267‰ MTTispropertobeusedfordetectingthe
celviability.Additionaly,thisresearchshowsthatthemoststrongcelactivityisontheexponentialgrowthphase.
Meanwhile,boththerelationshipbetweencelamountsanditsopticaldensity,andefectoftheculturetimeontheMTT
stainingcelarealsostudiedinthisresearch.
Keywords: Asparagus MTT Celviability
·研究报告·
前言
MTT(Thiazolylblue),即噻唑蓝,四甲基偶氮唑盐,化学式 C18H16N5SBr,淡黄色,溶于水和醇,不溶于氯
仿,2～8℃保存。淡黄色的 MTT被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶分解产生蓝紫色结晶状甲瓒颗粒,聚积在
细胞周围和细胞内,聚积的量与细胞活力成正比。
自从 1983年美国学者 Mosmam [1]首次报道能快速测定细胞增殖和细胞毒性的 MTT比色方法以来,
MTT比色法现已广泛应用于各个领域[2],如检测细胞对化学药物[3,4]、生物材料的敏感性[5,6]、免疫细胞毒活
性[7]、细胞因子活性[8]等。国内有人应用 MTT法对仙人掌多糖的抗肿瘤作用进行体外试验研究[9,10],以了解
细胞的增殖情况。有人采用 MTT法观察中药补肾健骨汤载药血清体外对大鼠成骨细胞增殖的影响取得了
满意的结果[11]。在临床医学上,MTT法用于抗病毒药物筛选[12],肿瘤药敏试验中培养基的选择[13],胃癌及食
管癌细胞的体外药物敏感率的检测[14]等。但未见到用于测定植物悬浮细胞活力的报道 [15,16]。由于此法涉及
的因素较多,因此,有人认为采用 MTT法测定悬浮细胞的活力不太适宜[17]。通过本研究,发现用 MTT法测
定植物细胞的活力是可行的。但测定悬浮细胞活力时,不同种类细胞所需要的条件不同,如缓冲液的浓度
和 pH值、MTT的浓度、处理的时间和温度等。因此,使用 MTT法测定细胞活力时应首先确定其最适的条
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 悬浮石刁柏细胞(由湖南农业大学遗传工程实验室提供)
1.1.2 MTT溶液 取 0.5gMTT(Sigma公司产品),溶于 100ml磷酸缓冲液或无酚红的基础液中,配制体积
比 5‰的 MTT母液,4℃冷藏备用。
1.1.3 缓冲液 ①柠檬酸钠缓冲液 (Na2HPO4-C6H8O7)(0.1mol/L,pH7.0);②EDTA-磷酸钠缓冲液(0.01mg/
ml,pH7.0);③EDTA-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l,pH7.0);④柠檬酸钠-Vc缓冲液(0.1mol/l,pH7.0);⑤磷酸
钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液(0.1mol/l,pH7.0);⑥磷酸钠-Vc缓冲液(0.1mg/ml,pH7.0)
1.1.4 渗透促进剂 二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)和曲拉通(Triton)分别用缓冲液配制成浓度为
5%、0.1%的溶液。
1.2 方法
1.2.1 比色波长的确定 MTT测定悬浮细胞活力时,取悬浮培养的石刁柏细胞,抽滤除去培养基。取六支
试管,各加入 2.5ml4‰的 MTT溶液和 0.5g(鲜重)石刁柏细胞,并分别加入上述 6种含有 5%二甲基亚砜
渗透促进剂的缓冲液各 2.5ml,25℃静置于黑暗处处理 20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入 5ml蒸馏水
洗去 MTT,如此重复 3次,再加入 4ml酸化异丙醇洗脱剂,置于 60℃水浴中充分洗脱 1～2次,使细胞完全
无色。取上清液,定容到 5ml,在 UV-9100型分光光度计上以不同的波长测其吸光值,以确定最佳测定波
长。
1.2.2 缓冲液的确定 根据以上实验所确定的方法,取六支试管,各加入 2.5ml4‰的 MTT溶液和 0.5g
(鲜重)石刁柏细胞,并分别加入上述 6种含有 5%二甲基亚砜渗透促进剂的缓冲液各 2.5ml,25℃静置于黑
暗处处理 20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入 5ml蒸馏水洗去 MTT,如此重复 3次,再加入 4ml酸化
异丙醇洗脱剂,置于 60℃水浴中充分洗脱 1～2次,使细胞完全无色。取上清液,定容到 5ml,在 UV-9100型
分光光度计上以 1.2.1所确定的波长进行测定,确定最佳缓冲液。
1.2.3 渗透促进剂的确定 根据以上实验所确定的方法,设置三个处理,处理 1(Control):Vc-磷酸钠(Vc-
Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液(0.1mol/L);处理 2(DMSO):Vc-磷酸钠(Vc-Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液(0.1mol/L)
+DMSO5%;处理 3(Triton):Vc-磷酸钠(Vc-Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液(0.1mol/L)+Triton(0.1%))
1.2.4 洗脱剂的确定 根据以上实验所确定的方法,取两支试管,各加入 2.5ml4‰的 MTT溶液、0.5g(鲜
重)石刁柏细胞、2.5ml1.2.2中所确定的缓冲液以及 1.2.3中所确定的渗透促进剂,25℃静置于黑暗处处理
20h,细胞变成红色,离心去上清液,加入 5ml蒸馏水洗去 MTT,重复 3次,再分别加入 4ml酸化异丙醇洗脱
剂,无水乙醇,并置于 60℃水浴中充分洗脱 1～2次,使细胞完全无色。取上清液,定容到 5ml,在 UV-9100型
分光光度计上以 1.2.1所确定的波长进行测定,确定最佳洗脱剂。
1.2.5 MTT浓度的确定 根据以上实验所确定的方法,各取 0.5g处于生长延迟期、指数期、稳定期的石刁
柏细胞,加入 1.2.2所确定的缓冲液以及 1.2.3中所确定的渗透促进剂,分别用浓度为 0.033‰、0.066‰、
0.100‰、0.133‰、0.167‰、0.233‰、0.266‰、0.300‰、0.333‰、0.367‰和 0.400‰的 MTT溶液 25℃静置于
黑暗处处理 20h,经 1.2.4所确定的最佳洗脱剂脱色后,取上清液,定容为 5ml,在 UV-9100型分光光度计上
以 1.2.1所确定的波长进行测定。
1.2.6 MTT对石刁柏细胞检测能力的分析 分别取 4×104～2.4×105石刁柏细胞,在 1.2所确定的各种条件
下测定细胞数量与 OD值的关系,并进行 R2分析,对 MTT对石刁柏细胞数量的检测能力进行评价。
1.2.7 培养时间对 MTT染色的影响 取 5ml石刁柏细胞培养液,400r/min离心以收集细胞,并对其活力
进行测定,以得出培养过程中的培养中细胞活力的变化规律。
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1.3 MTT对悬浮细胞活力的检测
采用比色波长 560nm,最适缓冲液为柠檬酸钠-Vc缓冲液,渗透促进剂为二甲基亚砜,洗脱剂为酸化
异丙醇,0.267‰浓度的 MTT溶液鉴定细胞活力。
2 结果
2.1 比色波长
各种不同缓冲液处理后得到相同的波形,并均在 560nm处有一明显吸收峰(图 1)。因此,确定在 λ=
560nm处测定吸光值。
2.2 缓冲液对吸光值的影响
由图 2可以看出,在 MTT法测石刁柏细胞活力时,用柠檬酸钠-Vc缓冲液(0.1mol/L,pH7.0)较好。
2.3 渗透促进剂及处理时间对吸光值的影响
结果如图 3所示,处理 1的处理时间在 12h之内 OD值较为稳定,但 OD值最低,24h达到最大值;处
理 2在 18h之内 OD值最高,而且一直较为稳定,21h达到最大值,以后逐渐降低;处理 3在 24h之内 OD
值始终比较稳定,但其 OD值一直较低。因此,选用处理 2中二甲基亚砜作为渗透促进剂效果最好。
2.4 不同洗脱剂对石刁柏细胞活力检测的影响
针对同样的实验材料,使用酸化异丙醇洗脱后的 OD值为 0.809,无水乙醇洗脱后的 OD值为 0.621。因
此,在通过选用这三种洗脱剂对石刁柏细胞活力的检测,发现最佳洗脱剂为酸化异丙醇。
2.5 MTT浓度对吸光值的影响
图 5结果显示延迟期细胞在浓度为 0.233‰的 MTT溶液处理后 OD值最大,而在浓度为 0.267‰的
MTT溶液处理后 OD值最小;指数期细胞在以浓度为 0.3‰的 MTT溶液处理后 OD值最大,而在浓度为
0.167‰的 MTT溶液处理后 OD值最小;稳定期细胞在以浓度为 0.233‰的 MTT溶液处理后 OD值最大,而
在浓度为 0.367‰的 MTT溶液处理后 OD值最小。当浓度为 0.133‰时延迟期.指数期.稳定期三个时期 OD
值相差最小,适于对未知培养时期的细胞计数;浓度为 0.267‰时三个时期 OD值相差最大,细胞颜色差异
最明显,适于鉴定细胞活力。
图 1 波长测定图形 图 2 不同缓冲液对吸光值的影响
图 3 渗透促进剂及处理时间对吸光值的影响 图 4 不同洗脱剂对石刁柏细胞活力检测的影响
洪亚辉等:MTT法检测石刁柏悬浮细胞技术的研究 153
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
2.6 MTT对石刁柏细胞活力检测能力的分析
相关性曲线回归方程 y=0.1867×10-5x+0.0405 R2=0.9725
由图 6可见,细胞数量在 4×104～2.4×105之间时,与 OD值之间有明显的相关性,能够利用 MTT法进行
细胞计数。其相关系数 R2达到 0.9725。
2.7 培养时间对 MTT染色的影响
如图 7所示,在不更换培养基的情况下,1～2d细胞进入延迟期,随着培养时间的增长,细胞数目以指
数的方式增加,3～7d时细胞活力达到最大,活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶酶解 MTT产生大量蓝紫色结晶状
甲瓒颗粒,使其 OD值在 560nm处达到最大,7d~9d,细胞增长放缓,细胞活力开始下降,因而 OD值趋于下
滑。9d以后,培养基中养分几乎耗尽,使得死亡细胞的数量大于活细胞的数量,细胞活力严重下降,OD值
持续下滑。由此可见,MTT对细胞染色能力与不同生长时期的活细胞数量成线性关系,而且继代培养基也
应该在 9d之内更换,否则影响细胞活力。
2.8 MTT对悬浮细胞活力检测的结果
淡黄色的 MTT被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶分解产生蓝紫色结晶状甲瓒颗粒,聚积在细胞周围和
细胞内,聚积的量与活力成正比。其结果见图 8。
3 结论
MTT法是常用的测定细胞活力的方法,但一般用于动物细胞的活力检测,未见到用于测定植物细胞活
力,根据本试验结果,只要选择合适的缓冲液、渗透促进剂、洗脱剂、MTT浓度以及处理时间,MTT法同样
可以测定植物细胞的活力。测定石刁柏细胞活力的最适条件为比色波长 570nm,最适缓冲液为柠檬酸钠-
Vc缓冲液,渗透促进剂为二甲基亚砜,洗脱剂为酸化异丙醇,0.267‰浓度的 MTT溶液,处理时间为 6～
15h。
MTT法操作的难点是培养后,细胞的培养基要吸干净,否则,残留的蛋白会对 MTT有一定的吸附作
用,影响准确性。测吸光值要有一定的时间范围,否则在测定时随着时间的推移每个样品颜色都会变深,这
可能是由于 MTT在空气中氧化的结果[18]。
MTT比色法的优点是灵敏度高,操作简便、经济、快速、易自动化,而且没有放射性污染,无需特殊设备[19]。
所以 MTT法经不断改进、完善,必将会得到更为广泛的应用。
图 5 MTT浓度对吸光值的影响 图 6 细胞数量与吸光值的线性关系
图 7 培养时间对 MTT染色的影响
图 8 MTT对悬浮细胞活力的检测
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2008年第1期
酸组成,分子质量 27ku。与其他发光性报告分子不同,GFP不需
要其他蛋白质、底物或共同因子的参与,紫外线激发即可产生明
亮、稳定的绿色荧光,但只有完整的 GFP才能激发出绿色荧光[5]。
GFP无种系依赖性,且对宿主细胞无毒性,目前已作为一种新型
的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域,尤其在基因表达和
定位等方面更具优越性[6]。所用 pEGFP-C1载体中 EGFP为一种突
变型 GFP,其基因编码区含有 190多个沉默碱基突变,具有更适
合于在人类细胞中表达的开放读框,而且其 mRNA翻译效率提
高,GFP表达增强,所产生的荧光比野生型 GFP增强 35倍,因而
更适用于检测各类细胞中 GFP融合蛋白的表达情况。将构建好的融合 GFP表达载体通过 LipoGen脂质体
介导转染 Hela细胞(人子宫颈癌细胞系),24h后即可观察到转染的部分细胞发出较强的绿色荧光,散在或
成对出现,阳性细胞约为 40%,72h左右达最高,有灶性发光细胞出现。在 Hela细胞中成功地表达了融合
荧光蛋白,证实构建的 GFP与 GnRH/TRS融合基因可以在真核细胞中有效地表达,为低促性腺激素性功能
减退综合征治疗提供了理论基础。
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图 3 Western印迹分析转染后的 Hela细胞
1.Hela/GnRH/TRS2.Hela/GnRH/TRS-GFPP
3.Hela/GF 4.Protein molecularweightstandards
(66、45、36、29、24ku)
(上接第123页)
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