全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·综述与专论·
收稿日期：2008-09-01
基金项目：国家自然科学基金（30560184），国家“863”计划（2007AA02Z114），新世纪优秀人才支持计划（NCET-04-0837），海南省重点学科建
设项目专项与海南省教育厅高等学校科研项目（Hjkj200719）
作者简介：高炳淼（1982-），男，安徽明光人，硕士研究生，研究方向：海洋药物
通讯作者：罗素兰，Tel：0898-66289538，E-mail：luosulan2003@163.com
从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白质一
直是个难题。 对于基因重组蛋白纯化技术来说，选
择合适的表达系统是相当重要的，因为表达系统决
定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的
杂蛋白。毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白
质的表达载体。毕赤酵母能使外源真核基因正确翻
译和翻译后加工，并分泌多种蛋白质，使产物易于
提纯。纯化重组蛋白质的主要目的是分离出目的蛋
白，主要的方法有浓缩沉淀、离子交换、亲和层析、
反相层析等。
1 酵母表达体系
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是在酿酒酵母
表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可
高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型酵母（Methy-lotrophicyeast）表达系统 [1]。 作为第 2
代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统
不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌
到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥
补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表
达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具
有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处 [2]。
巴斯德毕赤酵母表达系统具有强有力的醇氧
化酶基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；同
时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后
的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性 [3]。
另外 ，毕赤酵母菌营养要求低 、生长快 、培养基廉
价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已
成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
高炳淼 长孙东亭 罗素兰 安婷婷
（热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海洋学院材料与化工学院 海南大学生物技术实验中心，海口 570228）
摘 要： 随着基因重组技术的快速发展，基因工程产品的利用越来越广泛，但其分离纯化的成本约占总成本的
60%~70%。因此，探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要。简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系，着重概述
了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况。
关键词： 毕赤酵母 重组蛋白质 分离 纯化
Study on Separation and Purification of Recombinant Proteins in
Pichia pastoris Expression System
Gao Bingmiao Zhangsun Dongting Luo Sulan An Tingting
（Key Laboratory for Tropical Biological Resources，Ministry of Education Ocean College College of Materials & Chemical
Engineering Center for Experimental Biotechnology，Hainan University，Haikou 570228）
Abstract： Along with fast development of the gene recombinant technology，the application of genetic engineering
product is getting widespread，but the cost of the separation and purification approximately have been being high. So it is
essential to explore simple and effective separation and purification method to decrease the cost. This review focused on
progress of Pichia pastoris yeast expression system，the technique of separation and purification of the recombinant
proteins recently.
Key words： Pichia pastoris Recombinant protein Separation Purification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
每升克级以上水平； 表达的外源蛋白可分泌到胞
外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外
源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗
传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化 ，增加
了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒
害作用；具有糖基化程度低等多种优点。 与酿酒酵
母（Saccharomyces ceresiviae）表达系统相比，巴斯德
毕赤酵母具有分泌效率高，表达菌株稳定，表达质
粒不易丢失，不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋
白的免疫原性较低，更利于临床应用 [4]。
近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，
已有 300 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达 [5]，
主要用于人类药物的生产，还包括来自植物 、动物
和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以
及可用于研究晶体结构的蛋白质等。它还可以同时
表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生
物催化剂 [6]。 其中利用毕赤酵母分泌表达的硫代羟
腈裂合酶已达到 14.8 g/L 的高产率；而胞内表达的
羟腈裂合酶达到了 22 g/L 的高产率 [3]。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利
用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、
溶解度、等电点 、亲疏水性以及与其它分子的亲和
性等性质建立起来的（表 1） [7]。 从表 1 可看出，高纯
度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。由于重
组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存
在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成
的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离
出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一
套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
2.1 离子交换
离子交换色谱 （Ion Exchange Chromatography，
IEC） 是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交
换的离子进行交换，而达到分离目的的方法。 该法
主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷
的微小差异进行分离、且有较高的分离容量。 几乎
所有的生物大分子都是极性的，所以离子交换法已
广泛用于生物大分子的分离纯化。离子交换色谱分
辨率高、工作容量大、易于操作，已成为蛋白质 、多
肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方
法，在合成多肽分离中约有 75%的工艺采用离子交
换色谱 [8]。
在中性条件下，根据多肽的带电性 IEC 可以用
来分离、纯化具有生物活性的多肽，通常分为阳离
子柱与阴离子柱两大类及一些新型树脂。如大孔型
树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶和
琼脂糖凝胶树脂等 [9]。Garde 等 [10]采用阴离子交换色
谱法使用 DE52 树脂纯化人的重组 PSP94 蛋白，纯
度大于 98%。 在多肽类物质的分离分析研究中，对
多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的
多肽分离条件有所不同 ， 特别是洗脱剂的离子强
度、盐浓度等对纯化影响较大。
对于离子交换色谱分离纯化重组蛋白，若要获
得好的分离结果 ，必须选用适合的基质 ，其基质主
要有 3 类，包括多糖、硅胶和有机聚合物 [9]。 Shi 等 [11]
采用阴离子交换色谱和 Macro-prep 陶瓷羟基磷灰
石分离纯化在毕赤酵母中分泌表达人的过氧化氢
酶，其纯度达到 95%，产率 60%。 传统的离子交换
色谱一般采用多糖类凝胶作为基质，但是存在机械
强度差、承受压力小等缺点，且不能进行快速淋洗，
分离时间长，易造成生物分子的变性、失活。无机硅
胶 [12]填料机械强度大 、柱效高 、孔径和颗粒大小易
于控制 ，但 pH 应用范围窄 （2.0~8.0），硅胶表面残
余的硅羟基对蛋白质产生不可逆吸附等问题，从而
导致蛋白质的质量回收率低，生物活性损失。 硅胶
涂敷固定相 [13]在连续使用中涂层易脱落 、稳定性
差。 聚合物基质 [14]固定相具有良好的生物兼容性、
化学稳定性及易于被衍生化的优点，在生物大分子
分离中的地位越来越重要，其亲水性减小了基质与
蛋白之间发生非特异性相互作用的机会， 可在 pH
为 1~12 内广泛使用。
2.2 亲和层析
亲和层析（Affinity Chromatography，AFC）是利用
(IEC)
(GFC)
(HIC) (RPC)
! !(AC)"#$% !(IMAC)
& ! ’()*+ (EBA)
表 1 依据蛋白特性采用的分离纯化方法
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2009年第 3期
偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附
目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具
有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要
一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的
混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持
较高的活性 [15]，是分离纯化以及分析生物大分子尤
其是蛋白质的有力工具。 自从 1967 年 Axen 等 [16]用
溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功
制备了固定化酶，此后亲和层析在 20 世纪 70 年代
有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析
成功的关键因素。根据配体与生物大分子之间相互
作用体系不同， 可以把亲和层析分为生物亲和层
析、免疫亲和层析、金属离子螯合层析、拟生物亲和
层析 4 种类型 [17]。固定化金属螯合层析（Immobilized
Metal Affinity Chromatography，IMAC）是近年来发展
起来的一种亲和方法。1975 年，Porath[18]首次提出固
定化金属螯合亲和层析 （IMAC），并发展为一种有
效的生化分离技术，该方法利用固定在基质上的过
渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、 半胱氨酸、
色氨酸等残基的配位作用来实现对金属离子有亲
和力的蛋白质分离 [19]。 其中，组氨酸是与金属离子
作用较强的氨基酸，含有多个组氨酸的蛋白质可在
IMAC 中有效保留， 故多聚组氨酸已成为最常用的
蛋白质纯化标签 [20，21]。 真核表达体系中的毕赤酵母
载体就加入了组氨酸标记，这为应用固定化金属螯
合亲和层析（IMAC）提供了方便。
固定化金属螯合层析 （IMAC）以其分辨率高 、
选择性好 [19]，并且既可在常规的非变性条件下进行
蛋白质纯化，又可在变性条件下使用等优点而成为
一种重要的蛋白质分离方法 [22]。 研究表明，影响金
属螯合亲和色谱分离效果的因素很多，但决定色谱
填料分离效果的主要因素在于填料的基质、配基及
螯合金属离子种类 [18，23]。 孙永亮等 [24]用琼脂糖为基
质 ，以羧甲基天冬氨酸 （CM-ASP）为络合剂合成了
具有不同络合剂担载量的填料 ， 分别与过渡金属
Co2+及 Ni2+配位得到两种金属离子配位的金属螯合
亲和色谱介质 ， 与商品化色谱分离介质 Agarose-
NTA-Ni 进行比较，目标介质蛋白结合容量大、结合
快、易洗脱、选择性高及金属离子不易脱落等。
2.3 反相高效液相色谱
反相高效液相色谱（Reversed-phase High Perfo-
rmance Chromatography，RP-HPLC）利用非极性的反
相介质为固定相，极性有机溶剂（如甲醇、乙睛等）
或其水溶液作为流动相进行溶质的洗脱分离，根据
溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱色
谱法 [25]。 蛋白的分离多采用降低流动相极性（水含
量）的线性梯度洗脱法 [26]。 由于可使用挥发性冲洗
剂作为流动相，所以这种色谱不仅适用于分析型的
实验，还适用于制备型的分离。
RP-HPLC 主要用于分子量低于 5 000， 尤其是
1 000 以下的非极性小分子多肽的分析和纯化 [26]，
而重组蛋白大都是分子量较小 ， 其完全符合 RP-
HPLC 的分子量的要求。 李顺子等 [27]应用反相高效
制备液相色谱法，成功地对 5 种合成的蜂毒肽类似
物进行了分离制备。 耿信笃等 [28]用反相高效液相色
谱（RPLC）对 2 种化学合成多肽 32 肽和 21 肽进行
了分离、纯化和制备，用 RPLC 一步就可对 21 肽进
行分离纯化，其纯度达到 98.6％。 而 32 肽由于样品
组分更加复杂，RPLC 一步纯化后其纯度仅有 80％。
通过对色谱分离条件的再次优化， 对 32 肽进行二
次分离纯化，纯度达到 96.4％。 反相高效液相色谱
具有十分高的分辨力，分离对象儿乎覆盖了所有类
型的化合物，已成为小分子的蛋白质、多肽、核酸等
分离纯化的一种重要方法。
目前 RP-HPLC 分离柱仍然是以硅胶基质的键
合相填料为主体。 尤其是键合 C18（Octadecyl Silica，
ODS） [29]，C18 烷基以及苯基填料的出现，使该技术得
到长足发展。 Pi[21]等用 C18 反相柱的 HPLC 成功的
纯化了富含二硫键的芋螺毒素多肽重组蛋白。这类
填料的最大特点是颗粒刚性好，有利于传质可以得
到很高的柱效，并有良好的选择性。 硅胶基质填料
的 pH 值适应性一般均限制在 2~8， 高分子基质的
RP-HPLC 填料 ， 目前较为广泛使用的是微球形交
联聚苯乙烯树脂。这类树脂的表面具有烷基键合相
那种非极性的特征，因此无须化学改性即可直接用
作 RP-HPLC 的填料 [30]。
3 纯化方法的综合利用
在蛋白质的分离纯化中，一条好路线要求纯化
步骤尽可能简单 ，操作的成本低廉，同时具有高的
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化 35
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
活性回收率和高纯度。选择何种纯化路线不仅与各
种提取方法的原理和应用范围有关，还取决于目标
蛋白的特征和样品蛋白溶液的复杂性。在对目标蛋
白还不了解的情况下，应根据各种层析法的基本原
理和应用情况，设计纯化程序。在很多情况下，采取
3 个阶段纯化策略：第一阶段的目标是捕获目标蛋
白质，采取分离、浓缩方法，使样品转成小体积的操
作；第二阶段为中间提纯阶段 ，在该阶段应除去大
量杂质；第三阶段为最终提纯阶段，目的是获得最
后的高纯度的目标蛋白 [31]。 但是在实际工作中，需
要根据具体情况设计纯化策略。
离子交换层析 （IEC）、亲和层析 （AFC）或反相
层析（RPC）是两相分离的温和有效的主要方法。 大
部分的重组蛋白的分离纯化都是采用以上方法的
综合利用，设计出合理的纯化程序。Wu 等 [32]报道了
分泌的重组内源血管发生抑制因子（endostatin，EDN）
通过 SP 琼脂糖 FF 离子交换层析和琼脂糖-肝素
Hi-Trap 亲和层析纯化，纯度达到 98%。 Roll-and 等 [33]
采用 EBA 阳离子交换柱和亲合色谱法纯化在毕赤
酵母表达的重组蛋白 rP30，出产量达到了 49%。 在
液相层析技术中，目前主要在改进纯化操作系统的
性能和提高载体介质的性能上。 此外，扩张柱床吸
附、径向膜层析、灌柱层析、液液萃取和置换层析等
技术均在发展中。
目前已经有很多成功运用亲和层析-高效液相
色谱 （AFC-HPLC）、亲和层析-高效液相色谱-质谱
（AFC-HPLC-MS）、亲和层析-毛细管电泳（AFC-CE）
等串联结合的应用 [34]。 Wang 等 [35]使用 CHO-GS 系
统表达嵌合抗体以及发展了简单有效的纯化方法，
第一步用亲和层析，得率和纯度分别为 60 %和 91%，
第二步用反相高性能液体色谱法（RP-HPLC）纯化，
纯度大于 99%。 这种结合因其不可替代的优点，仍
将继续发展。
4 展望
在当前对基因工程产品的需求不断增加的情
况下， 要想获得易于分离纯化的基因工程产品，关
键在于表达体系的不断完善。 如果蛋白质合成、折
叠和分泌的技术得以有效控制，重组蛋白的分离纯
化必定会变得越来越简单。 最终会发展成快速，高
分辨率，高上样量，易于操作，低成本和电脑控制的
全自动化等技术。
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