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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的
标准分子构建及其适用性鉴定
李俊毅1，2 李想2 褚庆华2 吕蓉2 张舒亚2 潘良文2 黄新3 朱水芳3
(1华东理工大学生物工程学院，上海 200237;2上海出入境检验检疫局，上海 200135;
3中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京 100029)
摘 要: 针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题，构建适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的标准分子
pEASY-RT73，其包含转基因油菜 RT73 品系 3端侧翼序列，油菜内标准基因 HMG和 PEP片段。对其在定性和定量检测中的
适用性进行了实验室内部验证，结果表明，标准分子 pEASY-RT73 高度特异于转基因油菜 RT73 品系。以标准分子为标准品的
普通 PCR扩增中，3 个目标片段的检测下限(LOD)均为 10 拷贝。实时荧光 PCR检测的 LOD均为 25 拷贝，定量下限(LOQ)均
为 50 拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率介于 0． 96 － 1． 02 间，相关系数均大于 0． 999。分别以 PEP和 HMG
为内标准基因对 5 个盲样的测试结果显示，测量值与设定值间偏差(Bias)介于 － 14． 13% － 14． 29%间，SD 小于 0． 20，RSD 小
于 18． 0%。因此，标准分子 pEASY-RT73 可很好地替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜 RT73 及其来源产品品系特异性
检测。
关键词: PCR RT73 标准分子 品系特异性检测 实时荧光 PCR
Applicability of a Reference Molecule Suitable for Event-specific
Analysis of Genetically Modified Rapeseed RT73
Li Junyi1，2 Li Xiang2 Chu Qinghua2 Lv Rong2 Zhang Shuya2 Pan Liangwen2
Huang Xin3 Zhu Shuifang3
(1East China University of Science and Technology，Shanghai 200237;
2Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135;
3 Institute of Animal and Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029)
Abstract: Due to deficiency of reference materials for GMO analyses，a reference molecule pEASY-RT73 suitable for event-spe-
cific analysis of GM rapeseed RT73 was developed． The applicability of pEASY-RT73，which contains three DNA fragments，i． e． 3flan-
king sequence of RT73，and two endogenous gene fragments of HMG and PEP，in identification and quantification of RT73 was also vali-
dated in our lab． Results showed that pEASY-RT73 was highly specific to rapeseed RT73 detection． In the qualitative PCR analysis u-
sing pEASY-RT73 as the calibrator，limit of detection(LOD)for three targets are all 10 copies． In the real-time PCR，LOD for three tar-
gets were all 25 copies，and LOQs were all 50 copies． The reaction efficiency of three standard curves using pEASY-RT73 as the calibra-
tor was between 0． 96 to 1． 02，and the squared regression coefficients(R2)were all higher than 0． 999． Five blind samples analyses u-
sing PEP and HMG as endogenous gene，respectively，showed that bias between measured value and true value was between － 14． 13%
and 14． 29%，SD and RSD values were lower than 0． 20 and 18． 0%，respectively． Therefore，the developed reference molecule pEASY-
RT73 could be used to qualitatively and quantitatively analyze GM rapeseed RT73 and its derived products as a good alternative of
收稿日期:2010-09-27
基金项目:国家科技支撑项目(2008BAK41B01) ，国家转基因重大专项(2009ZX08012-002B) ，上海市科委创新平台服务项目(10DZ2294102) ，
国家“863”项目(2006AA10Z442) ，上海检验检疫局科研项目(HK003-2010)
作者简介:李俊毅，男，硕士研究生，研究方向:食品科学;E-mail:lijunyi77@ hotmail． com
通讯作者:李想，女，博士，工程师，研究方向:分子生物学;E-mail:idealne@ 163． com;
潘良文，男，博士，研究员，研究方向:食品安全检测;E-mail:panlw888@ 126． com
2011 年第 4 期 李俊毅等:适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定
reference material derived from plant materials．
Key words: PCR RT73 Reference molecule Event-specific Real-time PCR
转基因作物在解决全世界日益严重的粮食危
机的同时，也带来了食品安全和环境安全问题，因
此，世界各国政府和相关国际组织非常重视转基
因作物及其产品的监督和管理。作为转基因产品
监管的重要技术支撑之一，核酸检测技术已成为
转基因生物检测的最主要和常用的方法。而不论
采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时
均必须使用标准物质(Reference materials)作为阳
性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准
确检测［1，2］。
标准物质是具有一种或多种足够稳定、均一和
确定的特性值，用于对设备进行校准、对测量方法进
行评价或为材料定值的物质和材料［3］。目前实际
检测中使用的标准物质多来源于国外研究机构，这
些标准物质不仅价格昂贵，购买周期长，而且商业化
品种不全，很难满足日常检测需求。标准分子(Ref-
erence molecule)是一种重组质粒分子，其一般包含
转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段以及
物种特异性片段。由于操作简便、生产成本低、容易
获得高纯度和高浓度 DNA样品，且在一个标准分子
中可容纳多个目标序列等突出优点，近年来，标准分
子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有
效途径之一，已作为新型 DNA标准物质用于转基因
作物检测和定量分析［4，5］。
转基因油菜 RT73 品系由孟山都公司研发，是
全球种植最广泛的转基因油菜品系，占全球油菜种
植面积的 45% 左右［6］。RT73 品系已先后在加拿
大、日本、美国和澳大利亚批准环境释放，并在中国、
欧盟等 9 个国家和地区批准用于食品或饲料加工原
料［7］。我国每年进口几百万吨油菜籽，主要来自加
拿大等国，而其中大部分为转基因油菜籽，并以
RT73 品系为主。为了给我国转基因油菜 RT73 品
系监管提供必要的技术支撑，本研究旨在构建适于
转基因油菜 RT73 品系特异性检测标准分子，并对
其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部
验证。
1 材料与方法
1. 1 材料
转基因油菜 RT73、MS1 × RF1、MS1 × RF2、MS8 ×
RF3、T45、Oxy235 和 Topas19 /2 品系及非转基因油
菜籽样品来自本实验室储备。
1. 2 油菜籽 DNA提取和制备
用冷冻研磨机(美国 SPEX 公司 FREEZER
MILL 6850 型)将各品系油菜籽样品分别研磨成均
匀的粉末。使用植物基因组 DNA 提取试剂盒(天
根生化科技(北京)有限公司，Cat:# DP305-02)并按
其操作步骤提取样品基因组 DNA。用核酸蛋白含
量测定仪(德国 Eppendorf 公司)测定浓度后，置
－ 20℃保存。
1. 3 标准分子构建
查阅和整理我国现行标准和国际公开刊物中发
表的检测方法，获得引物和探针序列信息。根据转
基因油菜 RT73 3端品系特异性序列和油菜内标准
基因 HMG、PEP片段设计标准分子构建用引物(表
1) ，这些引物的扩增区域涵盖转基因油菜 RT73 检
测方法所涉及的所有检测区域。
采用 pEASY-T3 为基础载体，将转基因油菜
RT73 品系 3端侧翼序列片段(316 bp)采用 T-A 克
隆方式连接到载体中，得到 pEASY-RT73-1，进一步
将 PEP(307 bp)和 HMG 片段(311 bp)通过重叠
PCR技术整合为一个重组片段，并通过 Spe I 和 Sac
I酶切位点克隆到 pEASY-RT73-1 中，得到标准分子
pEASY-RT73。标准分子分别送英潍捷基(上海)贸
易有限公司和鼎安生物技术(上海)有限公司进行
质粒全基因测序。
1． 4 标准分子质粒 DNA提取和制备
培养 4 mL 已达对数生长期的 pEASY-RT73 大
肠杆菌菌液，采用 Axygen 质粒 DNA 小量提取试剂
盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，Cat:#AP-MN-
P-50)并按其操作步骤提取和纯化质粒 DNA。用核
酸蛋白含量测定仪(德国 Eppendorf 公司)测定浓度
后，置 － 20℃保存。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
表 1 标准分子构建中设计的引物
目标片段 引物 序列(5→3) 产物大小(bp)
RT73 3端品系
特异性序列
L2-RT73-3-F CGACGGATCGTAATTTGTCGTT
L2-RT73-3-R TAGCCGTCGATTTCCACATG
316
HMG
HMG-F CGAAGCCTCAGGGAGAGTCA
HMG-R CGATTTGCTACAGCGTCAACT
311
PEP
PEP-F CGGCGTTTCAGACATTCCTG
PEP-R TTTCCCACTCAGCTCGGATAA
307
重叠 PCR
HMG + PEP-1-F TGCGACGACTAGTCGAAGCCTCAGGGAGAGTCAAGCCACG
HMG + PEP-1-R CAGGAATGTCTGAAACGCCGCGATTTGCTACAGCGTCAACTT
HMG + PEP-2-F AGTTGACGCTGTAGCAAATCGCGGCGTTTCAGACATTCCTGA
HMG + PEP-2-R TGCGATGCGAGCTCTTTCCCACTCAGCTCGGATAATAGCCA
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1． 5 标准分子适用性鉴定
1． 5． 1 标准分子用于普通 PCR 检测的适用性鉴定
标准分子 pEASY-RT73中仅包含转基因油菜 RT73
3端品系特异性序列，油菜内标准基因 HMG 和 PEP
片段，因此标准分子应特异于上述 3 个片段的检测。
利用我国现行标准中油菜内标准基因 HMG［8］和
PEP［9］检测引物，转基因油菜 RT73［10］、MS1［11］、
RF1［11］、RF2［12］、MS8［13］、RF3［13］、Oxy235［14］、T45［15］
和 Topas19 /2［16］品系特异性检测引物分别扩增标准
分子 DNA以检测标准分子的特异性。
为了鉴定 pEASY-RT73 用于普通 PCR 检测的
灵敏度，采用两种 PCR体系和 3 种不同型号 PCR仪
进行扩增，并进行了 3 位研究人员参与的实验室内
部验证。试剂包括 TaKaRa Premix Ex Taq(大连宝
生物公司，Cat． D332)和 Bocai Taq(上海申能博彩生
物技术有限公司，Cat． B31) ;使用仪器包括 Master-
cycler Gradient PCR 仪(德国 Eppendorf 公司) ，AB
Thermal Cycler PCR仪(美国应用生物系统公司)和
PTC-225 PCR仪(美国 MJ Reserarsh公司)。
将标准分子 DNA稀释至 104、103、102、20、10、2
和 1 拷贝 /μL，使用普通 PCR 检测引物(表 2)分别
扩增 RT73 3端品系特异性序列(204 bp) ，HMG 片
段(219 bp)和 PEP片段(248 bp) ，确定以标准分子
为标准品在普通 PCR检测中的 LOD值。
表 2 普通 PCR检测引物及探针
目标 引物 /探针 序列(5→3) 产物大小(bp) 来源
HMG HMG-1F GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG 219 ［8］
HMG-2R GCAACCACCAGGCACCATC
PEP PEP-1 GCTAGTGTAGACCAGTTCTTG 248 ［9］
PEP-2 CACTCTTGTCTCTTGTCCTC
RT73 3端品系
特异性序列
RT73-F AATAACGCTGCGGACATCTA 204 ［10］
RT73-R CAGCAACATTCTCTGTCAACAA
采用 25 μL 体系进行 PCR 反应，包括 1 ×
Premix Ex Taq(TaKaRa Premix Ex Taq 体系)或 1 ×
PCR 缓冲液，0． 40 mmol /L dNTPs，1． 25 U Taq DNA
聚合酶(Bocai Taq 体系) ;0． 20 μmol /L 上下游引
物，以及 5 μL DNA模板。反应程序为 95℃ 10 min;
95℃ 30 s，60℃ /55℃ 40 s(RT73，HMG 片段 60℃;
PEP片段 55℃) ，72℃ 40 s，40 个循环;72℃延伸
5 min。所有反应重复 3 次，PCR 产物利用 2． 0%的
琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 5． 2 标准分子用于实时荧光 PCR检测的适用性
鉴定 将标准分子 DNA 稀释至 106、105、104、103、
102和 10 拷贝 /μL。对 3 个目标片段分别进行实时
荧光 PCR扩增，每次设 3 个平行重复，试验重复 3
次，计算 R2和反应效率(E) ，制作标准曲线。反应
效率 E计算公式:
E = 10 －1 /K － 1(K为标准曲线斜率)
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2011 年第 4 期 李俊毅等:适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定
以 10、5 和 2 拷贝 /μL 标准分子 DNA 为模板，
扩增 25 次反应检测标准分子用于实时荧光 PCR 检
测的 LOD和 LOQ。
采用 Hot Start qPCR Master MixⅠ试剂盒(上海
睿诚生物科技有限公司)和 AB PRISM 7300 定量
PCR 仪(美国应用生物系统公司)进行实时荧光
PCR检测，引物和探针序列见表 3。采用 25 μL 体
系，包 括 1 × Hot Start qPCR Master Mix Ⅰ;
0． 40 μmol /L 引物和 0． 32 μmol /L 探针(RT73、PEP
片段)或 0． 40 μmol /L 引物和 0． 20 μmol /L 探针
(HMG片段) ;5 μL DNA 模板。扩增程序为 95℃，
10 min;95℃，15 s，60℃，60 s，45 个循环。
表 3 实时荧光 PCR检测引物及探针
目标 引物 /探针 序列(5→3) 产物大小(bp) 参考文献
HMG HMG-1F GTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG 99 ［17］
HMG-2R CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC
HMG-P FAM-CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT-BHQ1 121 ［18］
PEP PEP-1F CCAGTTCTTGGAGCCGCTTGA
PEP-2R AAGGGCCAGTCCAAATGCAGA
PEP-P FAM-CAGGTCGCTATGCGACTGCGGAGAA-BHQ1
RT73 3端品系
特异性序列
RT73-1F CCATATTGACCATCATACTCATTGCT
RT73-2R GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA 108 ［19］
RT73-P FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-BHQ1
1． 5． 3 以标准分子为标准品对实际样品的检测
使用标准分子 DNA和转基因油菜基因组 DNA进行
PCR扩增时，两者之间的反应效率可能存在差异，
因此需要测定校正系数(Conversion factor，Cf)进行
校准。采用 400、200、100、50 和 25 ng纯合转基因油
菜 RT73 品系基因组 DNA 测定 Cf 值。设置 3 次平
行重复，试验重复 3 次。通过标准分子构建的标准
曲线分别计算 3 个片段拷贝数。
Cf = RT73 品系特异性序列拷贝数 /HMG 或
PEP片段拷贝数
将研磨好的纯合 RT73 油菜籽和非转基因油菜
籽干粉按照质量百分比进行混合，配制 4 个不同转基
因含量样品，包括 10%、5%、1%和 0． 5%(W/W)。测
试各样品转基因成分百分比，通过 Bias，SD和 RSD值
分析结果的准确度和精确度。
转基因成分含量(%)= RT73 品系特异性序列
拷贝数 /(HMG或 PEP片段拷贝数 × Cf)
2 结果与分析
2. 1 标准分子构建
为了构建适于转基因油菜 RT73 品系特异性检
测标准分子，将 RT73 3端侧翼序列(316 bp) ，油菜
内标准基因 PEP(307 bp)和 HMG(311 bp)3 个片段
克隆至 pEASY-T3 载体中，得到 pEASY-RT73(图
1) ，大小为 3 935 bp。3 次质粒全基因测序结果与
目标序列一致，表明质粒 pEASY-RT73 构建成功。
A．标准分子 pEASY-RT73 结构示意图:RT73 3． RT73 3端品
系特异性序列;HMG． 油菜内标准基因 HMG 片段;PEP． 油菜
内标准基因 PEP 片段;Spe I 和 Sac I． 分别对应的酶切位点;
AmpR ．氨苄青霉素抗性基因。B． 标准分子 pEASY-RT73 中插
入序列:RT73． 转基因油菜 RT73 品系 3端侧翼序列;PEP． 内
标准基因 PEP片段;HMG．内标准基因 HMG片段;斜体部分表
示标准分子构建中所用引物位置;下划线和双下划线分别表
示标准分子测试中普通 PCR和实时荧光 PCR 检测引物位置;
加灰部分表示普通 PCR和实时荧光 PCR检测引物共用序列
图 1 标准分子 pEASY-RT73 结构示意图和插入序列
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
2. 2 标准分子用于普通 PCR检测的适用性鉴定
2． 2． 1 特异性测试 采用 9 种转基因油菜品系特
异性检测引物对标准分子的特异性进行测试，结果
如图 2 所示。以标准分子 DNA为模板的扩增中，仅
可在 RT73 3端品系特异性序列和内标准基因
PEP、HMG扩增中得到明显目的条带(图 2-A) ;以
转基因油菜 T45、Oxy235、MS8、MS1、RF1、RF2、
RF3 和 Topas19 /2 品系特异性检测引物进行扩增
时无明显可见条带产生，而各检测体系对应的阳
性对照均有目的条带产生(图 2-B)。因此标准分
子 pEASY-RT73 高度特异于转基因油菜 RT73 品系
检测。
A．以标准分子 DNA 为模板进行的 PCR 扩增;B． 分别以对应
的转基因油菜品系 DNA为模板进行的扩增;1．空白对照;2 －
12．分别为内标准基因 HMG(219 bp)、PEP(248 bp)、油菜
RT73(204 bp)、MS1(194 bp)、MS8(159 bp)、RF1(200 bp)、
RF2(200 bp)、RF3(282 bp)、Oxy235(331 bp)、Topas19 /2(110
bp)和 T45(233 bp)品系特异性序列的扩增。C． RT73 品系特
异性片段扩增;D． PEP 片段扩增;E． HMG 片段扩增。1． 空白
对照;2 － 8．分别为 50 000、5 000、500、100、50、10 和 5 拷贝标
准分子 DNA的扩增;M为 DL2000 分子量标记
图 2 标准分子 pEASY-RT73 用于普通 PCR扩增的
特异性和灵敏度
2． 2． 2 检测灵敏度测试 本研究采用两种 PCR 体
系和 3 种不同型号 PCR仪进行普通 PCR扩增，并进
行了 3 位研究人员参与的实验室内部验证。结果表
明，无论采用哪种 PCR 体系和 PCR 扩增仪，可扩增
3 个目标片段的最低标准分子 DNA为 10 拷贝(2 拷
贝 /μL，5 μL模板)。3 位研究人员检测结果一致。
10 拷贝标准分子 DNA 相当于 100 ng 油菜基因组
DNA 中含有约 0． 01% RT73 成分。TaKaRa 公司
PCR试剂在 Eppendorf仪器上的扩增电泳结果如图
2-C －2-E。
2． 3 标准分子用于实时荧光 PCR 检测的适用性
鉴定
2． 3． 1 标准曲线的制作 以梯度稀释的标准分
子 DNA 为模板，对 3 个目标片段进行实时荧光
PCR扩增，制作标准曲线。如图 3 所示，3 个目的
片段的标准曲线斜率分别为 － 3． 27，－ 3． 38 和 －
3． 43，反应效率分别为 1． 02、0． 98 和 0． 96，R2均大
于0． 999。因此，标准曲线适于对样品进行进一步
定量分析。
2． 3． 2 LOD和 LOQ测试 以 50 拷贝 DNA为模板
的 25 次扩增中，RT73、PEP和 HMG 3 个目标片段均
有 25 次得到扩增曲线，RSD 值分别为 2． 04%、
3． 06%和 1． 70%;以 25 拷贝 DNA为模板，3 个目的
片段均有 24 次(96%)得到扩增曲线;以 10 拷贝
DNA为模板，3 个目的片段分别有 23(92%)、22
(88%)和 21(84%)次得到扩增曲线。因此，针对 3
个目标片段的 LOD 均为 25 拷贝标准分子 DNA(检
出率≥95%)。而为了得到稳定的定量结果(检出
率为 100%，RSD≤25%) ，3 个检测体系均需要至少
50 拷贝标准分子 DNA，因此 LOQ为 50 拷贝标准分
子 DNA。
2． 3． 3 Cf 值测定 采用 5 个浓度纯合转基因油菜
RT73 品系 DNA测定 Cf值。标准分子 pEASY-RT73
中包含两个油菜内标准基因(PEP和 HMG) ，因此对
两套体系均进行了 Cf 值测定。结果如表 4 和表 5
所示，以 PEP和 HMG为内标准基因的平均 Cf 值分
别为 1． 24 和 1． 03，SD 值分别为 0． 09 和 0． 06，RSD
值分别为 7． 25%和 6． 08%，所有偏差值均在可接受
范围内［20］。
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2011 年第 4 期 李俊毅等:适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定
A － C． RT73 3端品系特异性序列，内标准基因 PEP 片段以及内标准基因 HMG 片段实时荧光 PCR 检测结果;
A － C． RT73 3端品系特异性序列，内标准基因 PEP片段以及内标准基因 HMG片段 s标准曲线
图 3 以标准分子为标准品制作的标准曲线
表 4 以 PEP为内标准基因采用纯合转基因油菜
RT73 品系基因组 DNA测试 Cf值结果
基因组
DNA(ng)
平均 RT73
片段拷贝数
平均内源
片段拷贝数
Cf
平均
Cf
SD RSD(%)
25 3488． 36 2709． 14 1． 29
50 6902． 36 5618． 28 1． 23
100 14001． 21 12636． 56 1． 11 1． 24 0． 09 7． 25
200 28523． 28 21273． 12 1． 34
400 57331． 79 46556． 23 1． 23
表 5 以 HMG为内标准基因采用纯合转基因油菜
RT73 品系基因组 DNA测试 Cf值结果
基因组
DNA(ng)
平均 RT73
片段拷贝数
平均内源
片段拷贝数
Cf
平均
Cf
SD RSD(%)
25 3488． 36 3465． 25 1． 01
50 6902． 36 7393． 21 0． 93
100 14001． 21 12792． 12 1． 09 1． 03 0． 06 6． 08
200 28523． 28 26850． 43 1． 06
400 57331． 79 54325． 96 1． 06
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
2． 4 以标准分子为标准品的盲样测试
为了鉴定以标准分子为标准品建立的定量检测
体系的准确性和精确性，采用 0，0． 5%，1，5% 和
10%含量转基因油菜样品进行测试。准确性采用
Bias衡量，精确性采用 SD 和 RSD 衡量。以 PEP 为
内标准基因时，测出 5 个样品的转基因成分含量
分别为 0，0 ． 43%，1 ． 07%，4 ． 32% 和 9 ． 97%，
Bias 介于 － 14． 13% － 7． 06%，SD 值小于 0． 15，
RSD值小于 11． 0%(表 6)。以 HMG 为内标准基因
时，5 个样品的转基因成分含量分别为 0，0． 56%，
1. 14%，5． 30%和10． 53%，Bias 在5． 28% － 14． 29%
范围内，SD值小于 0． 20，RSD值小于 18． 0%(表 7) ，
所有偏差值均在可接受范围内［20］。因此，本研究构
建的标准分子 pEASY-RT73 适于用作转基因油菜
RT73 品系的定量检测。
3 结论与讨论
目前，转基因作物及其产品检测所需的标准物
质主要来源于植物原材料，但是其来源十分有限，生
产标准物质的过程复杂且成本较高，制备和贮存条
件苛刻，而且已商品化标准物质涵盖的作物品系只
有不足 30 种，给转基因产品检测带来很大困难，同
时也制约了转基因作物检测技术的发展。近年来发
展起来的标准分子作为解决这一难题的有效途径之
一，已被越来越多的研究者接受。
表 6 以 PEP为内标准基因的盲样测试结果
准确性 精确性
设定值(%) Cf值
平均 RT73
片段拷贝数
平均内源
片段拷贝数
测量值(%) Bias(%) SD RSD(%)
0 0． 00 2030． 85 0 0 — —
0． 5 1004． 06 1885． 97 0． 43 － 14． 13 0． 01 2． 33
1 1． 24 2741． 11 2064． 74 1． 07 7． 06 0． 11 10． 37
5 11373． 23 2121． 75 4． 32 － 13． 54 0． 06 1． 39
10 25733． 94 2081． 90 9． 97 － 0． 32 0． 02 0． 24
表 7 以 HMG为内标准基因的盲样测试结果
准确性 精确性
设定值(%) Cf值
平均 RT73
片段拷贝数
平均内源
片段拷贝数
测量值(%) Bias(%) SD RSD(%)
0 0． 00 2030． 85 0 0 — —
0． 5 1092． 49 1885． 97 0． 56 12． 48 0． 09 16． 85
1 1． 03 2430． 63 2064． 74 1． 14 14． 29 0． 19 17． 94
5 11579． 06 2121． 75 5． 30 5． 97 0． 17 3． 12
10 22575． 69 2081． 90 10． 53 5． 28 0． 13 1． 25
基于此，本研究构建了适于全世界种植量最大
的转基因油菜品系 RT73 品系特异性检测的标准分
子 pEASY-RT73，其包含一段 RT73 3端品系特异性
序列及油菜内标准基因 PEP 和 HMG 各一段序列，
各段序列均涵盖了我国现行的国家标准和行业标准
以及国际公开刊物发表的检测区域范围。经实验室
内部验证，标准分子 pEASY-RT73 高度特异于转基
因油菜 RT73 品系。以标准分子为标准品的普通
PCR扩增中，3 个目标片段的检测下限均为 10 拷贝
标准分子 DNA，相当于含有约 0． 01%转基因油菜
RT73 成分(100 ng基因组 DNA)。对 3 个目标序列
进行实时荧光 PCR 检测的 LOD 均为 25 拷贝，LOQ
均为 50 拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲
线反应效率在 0． 96 － 1． 02 之间，R2均大于 0． 999。
28
2011 年第 4 期 李俊毅等:适于转基因油菜 RT73 品系特异性检测的标准分子构建及其适用性鉴定
分别以 PEP和 HMG为内标准基因对 5 个盲样检测
结果显示，Bias 介于 － 14． 13% － 14． 29%间，SD 值
小于 0． 20，RSD 值小于 18． 0%。因此，标准分子
pEASY-RT73 可较好地替代植物来源的阳性标准品
用于转基因油菜 RT73 及其来源产品品系特异性定
性和定量检测。
参 考 文 献
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GT73% 2C + RT73＆hstIDXCode = ＆gType = ＆AbbrCode = ＆at
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= Submit．
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(责任编辑 李楠)
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