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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
文蛤微卫星 DNA的筛选及其特性分析
陈淑吟 吉红九 许广平 张志伟 杨海平
(江苏省海洋水产研究所 ,南通 226007)
　　摘 　要 : 　采用磁珠富集分离法从文蛤 (M eretrix m eretrix)的基因组中筛选得到 49条微卫星 DNA序列 ,其中两碱基重复
有 3种类型 36个序列 ,四碱基重复有 14种类型 26个序列。重复次数在 5～30之间的序列占 7516% , 30次以上重复的序列占
2414% ,最高重复次数为 100。根据重复单元的排列特点 ,完美型、非完美型及混合型序列所占比例分别为 6112%、1415%和
2415%。本研究中构建的文蛤微卫星文库将在文蛤种质资源评价及分子遗传学研究中发挥作用。
关键词 : 　文蛤 微卫星 DNA 磁珠富集法 双壳类
M icrosatellite Enrichment by Magnetic Beads in M eretrix m eretrix
and Character istic Analysis
Chen Shuyin J i Hongjiu Xu Guangp ing Zhang Zhiwei Yang Haip ing
( J iangsu Institute of M arine F isheries, N antong 226007)
　　Abs trac t: 　The asiatic hard clam M eretrix m eretrix is of great commercial value for the marine cultivation industry in China1To as2
sist genetic studies in this species, we have reported the isolation and characteristic of m icrosatellite DNA inM 1m eretrix1Two 5′biotiny2
lated p robe ( CA ) 15 and ( GA ) 15 were used to hybridized, and hybridized fragments were cap tured by strep tavidin2coated magnetic
beads1The positive clones containing m icrosatellite sequences were screened by the PCR technique, and 49 cloneswere found contained
m icrosatellite repeat sequences with more than 5 repetitions1The m icrosatellite sequences could be categorized structurally as follows,
perfect(6112% ) , imperfect(1415% ) and compound (2415% ) 1Besides the motif of CA and GA contained in the oligop robe, we also
found a lot of four nuclotide repeats1Among the m icrosatellite repeats, relatively short arrays ( 5～30 repeats) were most abundant
(7516% ) , and the largest array contained 100 repeats1The (CA) n and ( GA) n enriched library created in this study would be useful re2
source for develop ing additional anonymous m icrosatellite markers ofM eretrix m eretrix in the future1
Key wo rds: 　M eretrix m eretrix Enrichment by magnetic beads M icrosatellite DNA B ivalve
收稿日期 : 2009208220
作者简介 :陈淑吟 (19662) ,女 ,广东省汕尾人 ,博士 ,研究员 ,主要研究方向水产生物种质资源与增养殖技术 ; E2mail: shuyinchen89@163. com文蛤 (M eretrix m eretrix L11785 )属瓣鳃纲 ( la2mellibranchia)的帘蛤科 ( veneridae) ,为中国南北沿海常见的大型底栖双壳类 ( bivalve)。其肉细味美、营养丰富 ,素有“天下第一鲜 ”之美称 ,是滩涂养殖的重要经济贝类 ,也是中国鲜活水产品出口的重要品种之一。加强对文蛤自然资源及不同地理群体的遗传多样性研究与保护 ,对于该贝类资源的可持续利用具有重要意义。分子标记的应用为文蛤的遗传学研究提供了新型高效的技术手段及基础理论依据 ,如应用 RAPD、ISSR技术研究不同地理群体的遗传多样性差异等 情况 [ 1, 2 ]。微卫星 DNA (m icrosatellite DNA) ,称简单序列重复 ( simp le sequence repeats, SSR ) ,不仅具有极高的个体特异性、可重复性 ,而且能够提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度等遗传信息 ,是反映多态性最有效的分子标记之一 [ 3, 4 ]。在海洋双壳类中 ,微卫星标记是近几年才得到较快发展的研究方法 ,主要应用于牡蛎和扇贝的遗传图谱及群体遗传多样性研究 ,并已取得大量的研究成果 ,如栉孔扇贝 ( Ch lam ys farreri) [ 5～7 ]、虾夷扇贝 ( Pa tinopect2en yessoensis ) [ 8, 9 ]、东方牡蛎 ( C rossaster virg in ica )[ 10, 11 ]及长牡蛎 (C rassostrea g igas) [ 12～15 ]等。
2009年第 12期 陈淑吟等 :文蛤微卫星 DNA的筛选及其特性分析
有关文蛤微卫星 DNA的分离与筛选目前未见
相关报道 , Chen[ 16 ]首次用毛蚶的 7对微卫星引物在
文蛤基因组中得到扩增产物。本研究利用磁珠富集
方法构建了文蛤的基因组微卫星富集文库 ,并设计
筛选获得了 12对多态生微卫星引物 ,为该物种的分
子遗传学研究提供了基础依据。
1　材料与方法
111　样本采集及基因组总 DNA提取
文蛤采自江苏省启东海区 ,样品壳长为 318～
518 cm ,取活体样品闭壳肌 ,按 DNA 提取试剂盒
(Axygen)说明书要求提取了样品的基因组总 DNA,
最后洗脱定溶于 TE ( 100 ng/μl)溶液后 , 4℃保存
备用。
112 DNA模板酶切与连接
酶切与连接反应一步完成 ,反应体系为 20μl,
其中 T4连接酶 1 U (NEB) , 10 ×buffer(NEB ) 2μl,酶
切纯化产物 200 ng,M se I酶 (NEB ) 5 U, M se I接头
10 pM , M se I接头由两条寡聚核苷酸组成 , O ligo
1: 5′2TAC TCA GGA CTC AT23′和 O ligo 2: 5′2GAC
GAT GAG TCC TGA G23′,等摩尔混合后 ,经 95℃变
性 5 m in,再以 2℃ /m in的速度缓慢降温至 25℃所
制备得到。反应于 37℃温育 4 h。
113 连接 PCR与切胶纯化
PCR反应总体积为 20μl,含有 100 mM Tris, pH
813, 500 mM KCl, 013μl连接液作为模板 , 115 mM
MgCl2 , dNTP终浓度为 200μM ,引物为 O liog 1,其终
浓度为 10 pM , 2 U Taq DNA聚合酶 ( TaKaRa)。PCR
扩增参数 : 94℃ 5 m in; 94℃ 30 s, 53℃ 60 s, 72℃ 60
s,运行 23个循环 ;最后 72℃延伸 8 m in。
连接 PCR产物在 2%琼脂糖凝胶中进行电泳 ,
溴化乙锭 ( ethidium brom ide, EB )染色 ,凝胶成像系
统 (UVP)检测。6 V /cm电泳 2 h后进行切胶 ,切胶
范围为 300～800 bp。产物经纯化后 ,最终定容于
100 ng/μl。
114　磁珠吸附富集及接头 PCR
使用探针序列为 (CA ) 15与 ( GA ) 15 ,磁珠 ( Pro2
mega)上包被有链霉亲和素 ( Strep tavidin) ,可与探针
上的生物素 ( biotin)结合 ,从而通过磁力将探针连同
所需的微卫星序列一同分离出来。
探针杂交体系为 50μl,其中连接 PCR纯化产
物 800 μl,标记 biotin 的探针 10 pmol, 20 ×SSC
15μl, 10% SDS 015μl。杂交液于 95℃变性 5 m in,
再 65℃充分杂交 1 h。将杂交完毕的杂交液加入平
衡好的磁珠中 , 25℃温育 20 m in,并轻轻摇动 ,使生
物素和链霉亲和素充分结合。温育后将离心管放置
到磁力架上 ,去除溶液。用 5 ×SSC冲洗 3次 ,并
移入 56℃100μl的杂交溶液 ( 015 mol/L NaCl, 4%
聚乙二醇 8000)。模板 DNA (20μl)与 80μl的杂交
溶液混合 ,于 95℃加热 5 m in使其变性后 ,迅速添加
至磁珠悬液 ,并于 56℃温育 20 m in,然后在室温用
200μl 2 ×SSC冲洗磁珠 4次 , 30℃ 200μl 1 ×SSC
冲洗 4次。室温下加入 50μl 0115 mol/L NaOH,放置
20 m in,从磁珠上洗脱固定的 DNA片段。除去磁珠 ,
加入 515μl 10 ×TE、3125μl 1125 mol/L乙酸中和上
清液。用 PCR产物纯化试剂盒 (Q IAquick PCR purifi2
cation kit)纯化 DNA,并溶于 50μl TE缓冲液中。
115 双链恢复 PCR
PCR反应总体积为 50μl,含有 100 mM Tris, pH
813, 500 mM KCl, 8μl富集产物作为模板 , 115 mM
MgCl2 , dNTP终浓度为 200μM ,引物为 O ligo 1,其终
浓度为 5 pM , 215 U Taq DNA 聚合酶 ( TaKaRa)。
PCR扩增参数 : 94℃ 5 m in ; 94℃ 30 s, 53℃ 30 s,
72℃ 45 s,运行 35个循环 ;最后 72℃延伸 8 m in。
PCR产物用 115 %的琼脂糖凝胶进行电泳。
116 克隆与测序
克隆用 T2easy Vector克隆试剂盒 ( Promega)进
行反应。载体连接反应体系为 10μl: T4连接酶 1 U,
2 ×buffer 5μl, DNA 150 ng, T2easy载体 25 ng。16℃
反应 1 h。将全部连接产物加入 100μl的 JM109感
受态细胞 ( TaKaRa)进行转化 ,把已转化的感受态细
胞涂布于添加 IPTG ( 100μl 10 mmol/L溶液 )和 X2
Gal( 100 μl 2%溶液 )的氨苄青霉素 LB 平板上 ,
37℃培养 16 h。挑选单一菌落至含有 450μl的 LB
培养液中培养 , 37℃震荡培养至对数生长期。
菌落 PCR 验证。反应总体积为 20 μl,含有
100 mM Tris, pH813, 500 mM KCl, 1μl菌液为模板 ,
115 mM MgCl2 , dNTP终浓度为 200μM ,引物为 M13
(5′2TGT AAA ACG ACG GCC AGT23′)和 M132Rev
(5′2CAG GAA ACA GCT ATG AC23′) ,终浓度为 10
pmol, 1 U Taq DNA聚合酶 ( TaKaRa)。PCR扩增参
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
数 : 94℃ 5 m in; 94℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 30 s,运行
30个循环 ;最后 72℃延伸 8 m in。
PCR产物用 115%琼脂糖凝胶进行电泳 ,产生
两条或两条以上扩增带的插入片段可以推测为含有
微卫星序列的阳性克隆。选择阳性克隆送英俊公司
( Invitrogen)进行双向测序 ,序列测序在 AB I3700全
自动测序仪上完成。
117 序列处理与引物筛选
利用 DNA star软件 ( http: / /www1dnastar1com / )
编辑序列 ,先去除载体序列 ,得到所要的基因组序
列 ;利用 ClustalX 1181比对所得序列 ,以去除相同
的序列 ;利用 SSRhunter选取含有微卫星的序列。
2 结果与分析
211 克隆与测序结果
通过文蛤基因组 DNA酶切、探针杂交、磁珠亲
和捕捉、载体连接及转化 ,构建了文蛤基因组微卫星
富集文库。从文库中挑选了 75个阳性克隆进行直
接测序鉴定 ,结果发现有 67个克隆中含有微卫星序
列 ( SSR) ,阳性克隆率为 89%。把测序列效果不理
想及重复出现的序列去除后 ,参照高焕与孔杰 [ 17 ]的
重复序列统计方法 ,本研究获得具有侧翼序列、重复
次数大于 6 次或四碱基重复的核心序列长度为
15 bp以上的 SSR序列 49个。
212 微卫星 DNA 序列及其分类
全部 SSR中 ,重复次数 10次以下的有 11个 ;重
复次数在 10～30次的序列最多 ,有 26个 ;大于 30
次的有 11个。其中 ,两碱基重复的拷贝次数多为
5～30次 ,大于 30次的序列共有 7个 ,重复最多为
52次 [ (CA ) 52 (CGCA ) 10 (CA ) 6 ];四碱基类型的重
复多在 15次以下 ,大于 30次重复的有 4个序列 ,其
中 50 次重复以上的序列有 : W G679、W G681 和
W G642 (图 1,表 1)。
根据 W eber[ 18 ]提出的标准 ,按照微卫星核心序
列排列方式的差异 ,将微卫星序列分为完美型 (per2
fect)、非完美型 ( imperfect)和混合型 ( compound)。
在 49个序列中 ,完美型的微卫星序列共 30个 ,约占
6112% ,两碱基 SSR 多为完美型序列 ;不完美的 7
个 ,约占 1415% ,两碱基重复 ( GT) n的 3个序列及
四碱基重复的 ( GTGA) n的 2个序列均为此类型 ;混
合型的有 12个 ,约占 2415% ,多为两碱基重复与四
碱基重复混合组成 (表 2,表 3)。
所得的 49个微卫星序列中只有两碱基重复及
四碱基重复类型。两碱基重复的 SSR序列共有 36
个 ,占总数的 7315% ,其中以含 (CA ) n或 ( GT) n类
型最多 ,有 23个序列 , ( GA ) n或 (CT) n类型序列有
13个 ,而 ( GC) n重复最少 ,仅有 1个 ;含四碱基重复
的 SSR序列共有 14种类型 26个序列 ,除了 ( GT2
GA) n有 6个序列外 ,各重复类型所占比率不大 ,多
为 1～3个序列 (表 3)。
表 1 文蛤 ( CA) n及 ( GA) n富集文库微卫星克隆特性
编号 位点 核心重复序列 (5′23′) 分类
1 W G3073 (CA) 17 P
2 W G3123 ( TG) 8 P
3 W G3233 ( GT) 27 P
4 W G3353 (CA) 17 P
5 W G3373 ( GT) 35 P
6 W G3473 ( GCGT) 8 ( GT) 25 C
7 W G6043 ( TC) 8 G( TC) 22 I
8 W G6073 ( GA) 14 P
9 W G6093 ( TACC) 7 P
10 W G6103 (CT) 23 P
11 W G6473 (CT) 10 P
12 W G3393 (CA) 7 P
13 W G341 (CA) 34 P
14 W G346 (CA) 6 P
15 W G395 ( GT) 24 ( GTGC) 7 C
16 W G363 ( GT) 10 GA ( GT) 38 I
17 W G334
(GTAT) 6 (GCGT) 6 (ATGT) 8
(GT) 7A (GT) 38
C
18 W G377 ( GT) 14 GA ( GT) 16 I
19 W G329 (GT) 22AT(GT) 12AT(GT) 24 I
20 W G381 ( GT) 35 ( GA) 15 C
21 W G325 (GT) 8 (GC) 5 (GTGC) 6 (GT) 7 C
22 W G688 ( GTCT) 11 &(CT) 24 P
23 W G618 ( GA) 17 (CAGA) 10 C
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2009年第 12期 陈淑吟等 :文蛤微卫星 DNA的筛选及其特性分析
续表
编号 位点 核心重复序列 (5′23′) 分类
24 W G645 ( GTGA) 3ATAA ( GTGA) 38 I
25 W G635 ( GT) 9 &( GAGT) 6 P
26 W G669 ( GACA) 4 P
27 W G633
(CTGT) 6 &(CT) 8 GT
(CT) 17 (CTAC) 4
C
28 W G634 ( GAGT) 16 P
29 W G642 ( TACA) 100 P
30 W G660 ( GT) 22 P
31 W G653 ( GT) 37 P
32 W G681 (CA) 52 (CGCA) 10 (CA) 6 C
33 W G627 ( GTAG) 7 P
34 W G611 ( GA) 12 P
35 W G695 ( GA) 14 CA ( GA) 2 CA ( GA) 8 I
36 W G648
( GATA) 4 ( GA) 15
(CAGA) 13 ( GA) 7
C
37 W G617 ( GAGT) 10 P
38 W G624 ( GAGT) 4 GC ( GAGT) 40 I
39 W G618 (CTGT) 4 P
40 W G654 ( GTGA) 19 P
41 W G632 ( GTCT) 7 &(CT) 9 P
42 W G615 ( GTAG) 7 P
43 W G609 (CTGT) 6 &(CT) 18 P
44 W G619
(CGTT) 15 CTCG( TTCA) 9
( TTCG) 25 &( TTCA) 13
C
45 W G673 (CT) 8 P
46 W G679 ( TACA) 73 TGCG( GT) 5 C
47 W G612 ( GT) 22 P
48 W G641
( GTCA) 26 CAGA ( GTCA) 22
(CTCA) 2 ( GTCA) 9
C
49 W G627 ( GT) 18 P
　　注 : P1完美型 ; I1非完美型 ; C1混合型 ; 3 1呈多态性位点并已
登录 GenBank位点
表 2 文蛤微卫星序列的分类情况
分类标准 类别 序列数目
百分比
( % )
两碱基
类型
四碱基
类型
W eber
(1990)
Perfect 30 6112 21 13
Imperfect 7 1415 6 2
Compound 12 2415 12 11
图 1　不同重复次数与对应的重复位点数
表 3 文蛤微卫星的重复类型及相对丰度
编号 重复序列类型 重复单位 序列数目 重复单位拷贝数
1 两碱基重复 CA /GT 23 6～52
2 GA /CT 13 12～25
3 GC 1 5
4 四碱基重复 TACC 1 7
5 GCGT 2 6～7
6 GTAT 2 6～8
7 GTGC 1 6
8 GTCT 4 4～11
9 CAGA 3 10～16
10 GTGA 6 6～40
11 TACA 2 73～100
12 CGCA 1 10
13 GTAG 2 7
14 TAGA 1 4
15 CATT 3 3～13
16 CGTT 2 15～25
17 GTCA 3 9～26
3　讨论
311　磁珠富集微卫星序列文库的特性
微卫星标记以其多态性高、随机分布、共显性遗
传及重复性好等特点在分子遗传学研究中得到广泛
的应用。使用 SSR标记技术的前提是需要知道重
复序列两翼的 DNA序列信息。微卫星序列的获得
主要有两种途径 :一是从已知的核苷酸序列中进行
731
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
检索 [ 19 ] ,或者利用近缘物种的微卫星引物进行扩增
筛选 [ 16 ] ,但是可利用的资源相对有限 ;二是构建富
含有微卫星位点的基因组文库 ,通过杂交筛选出含
有微卫星序列的阳性克隆 ,经测序后进行引物的设
计与筛选。磁珠吸附法分离微卫星序列的方法较为
简便、高效 ,一次可获得大量的微卫星序列 ,已在一
些水生物种研究中得到较好效果 [ 20 ]。磁珠的吸附
洗涤与总 DNA质量对试验结果影响较大。本研究
采用新鲜样本进行总 DNA提取 ,并检测、选择出一
个较好的 DNA模板进行酶切及连接反应 ,试验步骤
也经过多次优化筛选 ,因而取得了较好效果。
本研究首次进行文蛤的 SSR富集 DNA文库构
建 , 75个阳性克隆中得到 67个有 SSR序列 ,表明用
磁珠富集方法筛选 SSR具有较高的富集效率。采
用 (CA ) n及 ( GA ) n重复的寡核苷酸探针 ,这是因
为在所有动物种类中 , CA ) n的微卫星序列的含量
最丰富 ,其次是 (CT) n重复 [ 21 ]。不同物种的微卫星
序列的含量、分布及重复类型的丰度等各不相同。
在真核生物基因组中 ,两碱基 SSR最为丰富 ,三碱基
SSR的含量比两碱基的大约低 10倍 ,而四碱基的相
对更少 [ 22 ]。从文蛤基因组获得的两碱基重复有 3种
类型 ,约有 6316%为 ( CA ) n / ( GT) n,有 3611%为
(GA) n / (CT) n类型的重复 , ( GC) n类型只有 1个 ,
占 013%。同时 ,本研究还获得了 14种类型 26个四
碱基重复的微卫星序列 ,即有一半以上的 SSR含有四
碱基重复 ,这表现了文蛤 SSR的显著特性。
312 文蛤微卫星序列与分子标记的应用前景
从不同双壳类物种中获得的微卫星序列特征各
不相同。太平洋牡蛎的微卫星序列中混合型的占
2412% ,微卫星平均长度为 2419次重复 ,最长为 60
次重复 [ 13 ] ;在虾夷扇贝 Patinopecten (M izuhopecten )
yessoensis的微卫星序列中 ,赵莹莹等 [ 8 ]研究得出 ,
混合型的只占 611% ,重复次数主要集中在 20～60,
最高达 133次重复 ;李春艳等 [ 9 ]研究表明 ,完美型、
非完美型及混合型分别为 42169%、46120%和
11111% , 10次以上的重复占 86155% ,又以 21～50
次为最多 ,占 36136% ,重复次数最高为 168。战爱
斌等 [ 23 ]筛选出的海湾扇贝 A rgopecten irrad ians ( la2
m arck)微卫星序列中 ,复合型的占 2415%。本试验所
得的文蛤 SSR中 ,混合型的微卫星序列占 2415%;重
复次数主要集中在 30次以下 ,重复次数超 30次的有
11个 ,最多的重复为 100次。这些不同研究结果反映
了各物种的基因组微卫星序列特性 ,其差异是否与研
究方法或检测到不同的微卫星区域相关 ,有待于进一
步研究。
微卫星 DNA长度的变化是微卫星多态性的基
础。核苷酸的重复数在同一物种的不同基因型间差
别很大 ,具有丰富的多态性。W eber[ 24 ]认为 ,只有在
两碱基重复序列重复次数 ( n)大于 12次时 ,微卫星
标记才有可能表现出较高的多态性信息含量值
( P IC) ;当 n≥16时 ,可提供的 P IC在 015以上才可
以进行相应的多态性分析。Smulders[ 25 ]认为重复次
数多的微卫星 DNA既能在种间又能在种内产生多
态性 ,但重复次数少的微卫星 ,仅能在种间产生多态
性。本研究获得的这些 SSR序列中 ,重复次数高于
10次的共有 37个序列 ,占全部 SSR的 7515%。此
外 ,还有较大比例的四碱基重复类型 ,这些 SSR用
于开发微卫星标记时具更高可靠性 ,更有利于获得
多态信息含量高的分子标记 ,将在文蛤的种群遗传
结构研究及遗传图谱构建等方面发挥重要作用。
参 考 文 献
1　沈怀舜 ,朱建一 ,丁亚平 ,等 1海洋学报 , 2003, 25 (5) : 97～1021
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3　 Boudry P, Heurtebise S, Lapepigue S1Aquaculture, 2003, 228: 15～
251　
4　 Zanatta DT,Murphy RW1Conserv Genet, 2007, 8: 1393～14041
5　李红蕾 ,宋林生 ,王玲玲 ,等 1高技术通讯 , 2003, 12: 72～751
6　 Zhan AB, Bao ZM, Hui M, et al1Annales Zoologici Fennici, 2007,
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3851
(下转第 143页 )
831
2009年第 12期 　冯莹颖等 : GFP用于单核细胞增生李斯特菌 PrfA调控毒力基因 actA转录表达的研究
表达水平较低 ,但如果转移到 MEM 培养基中 , prfA
基因和大多数 PrfA蛋白调控的毒力基因的转录水
平就可以得到诱导 [ 8 ]。因此 ,本试验在对 GFP进行
荧光强度检测前 ,把携带有融合载体 pLSV162PactA2
gfp的 3种菌株从液体培养基 BH I中转移到 MEM
中孵育 30 m in, GFP在 PrfA蛋白高表达突变株 P14a
和 prfA基因等位缺失突变株 A42中的表达与在野
生株 P14中的表达相比均有显著差异 (图 5,图 6) ,
使得毒力基因 actA依赖于 PrfA蛋白转录调控的程
度能直接表现在 GFP的荧光强度上 ,从而较好地体
现了在 PrfA蛋白的不同表达水平下 , actA启动子依
赖于 PrfA的不同转录水平。
参 考 文 献
1　丁建英 ,韩剑众. 食品研究与开发 , 2008, 29 (12) : 171～174.
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