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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 8期
三株芸豆叶际拮抗细菌的筛选与鉴定
路晓萌1
姚良同1
宋洪宁 1
丁延芹 1
侯启会 1
杜秉海 1, 2
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018; 2山东农业大学农业微生物重点实验室,泰安 271018)


摘
要:
以芸豆锈病病原菌 [Uromyces app endiculatus( P ers. ) Ung. ]为指示菌,从芸豆叶际中筛选到 3株具有明显拮抗效
果的细菌, 编号为 SS2, L14b, NEW2。经过形态学观察, 生理生化测定, 16S rDNA序列及系统发育分析, 初步鉴定 SS2为短短
芽孢杆菌 (B revibacillus brevis ), L14b与 NEW 2为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。SS2, L14b, NEW 2的 16S rDNA序列的 Gen

Bank登录号分别为 EU771078、EU771076和 EU771079。
关键词:
芸豆锈病
拮抗菌
叶际
筛选
鉴定
Screening and Identification of Three Antagonistic Bacteria
from K idney Bean Phyllosphere
Lu X iaom eng
1
Yao L iangtong1
SongH ongning1
Ding Yanqin1
Hou Q ihui1
Du B inghai1, 2
(
1
College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, T ai
an 271018; 2 K ey
Laboratory of AgriculturalM icrob io logy, Shandong Agricultural University, T ai
an 271018)


Abstrac:t
W ith Uromyces app end icula tus ( Pers. ) Ung. as indicator, three antagonistic bac teria w ere screened from the phy llo

sphere o f K idney bean and nam ed as SS2, L14b, NEW2, respec tive ly. B ased on the m orpho log ic characteristics, phys io log ica l and b io

chem ica l properties and phy log enetic analysis o f 16S rDNA, SS2 w as prelim inary iden tified as Brevibacillus brev is, and L14b and NEW 2
w ere pre lim inary identified as Bacillus subtilis. The sequences of 16S rDNA obta ined in this study have been subm itted to GenBank and
the access ion numbers a re SS2 as EU771078, L14b as EU771076, and NEW2 as EU771079, respectively.
Key words:
Uromyces app endiculatus( Pe rs. )Ung.
Antagon istic bacte ria
Phy llo sphere
Screen ing
Iden tification
收稿日期: 2010
02
08
基金项目:山东省优秀中青年科研奖励基金 ( 2006BS06012)
作者简介:路晓萌, 女,在读硕士,研究方向:分子微生物学; E
m ai:l lux iaom engsdau@ 126. com
通讯作者:杜秉海,教授,主要从事植物根际促生细菌的研究; E
m ai:l bhdu@ sd au. edu. cn
芸豆 (Phaseolus vulgaris ), 又名菜豆,为豆科菜
豆属一年生草本植物。在芸豆种植过程中常遇到一
些病害影响芸豆的生长、产量和品质,严重者将导致
芸豆绝产。芸豆病害主要有炭疽病、锈病、灰霉病、
根腐病、细菌性疫病等 [ 1, 2]。据美国
农业研究
报
道,芸豆锈病病原菌为疣顶单胞锈菌 [ Uromyces ap

p endiculatus(Pers. ) Ung. ] ,为担子菌亚门真菌属,是
气传性真菌病害, 一般夏秋两季发生。本病主要发
生在叶片上,也危害叶柄、茎和豆荚。
当前从抗病育种、化学防治和农业措施等方面
做了大量工作,初见防病效果, 但筛选抗病品种周期
长,使用化学农药会带来环境污染和诱导植株产生
抗药性。因而,开发利用新的生防菌被认为是最具
发展潜力的防治方法之一。
以芸豆锈病病原菌为指示菌,拟从芸豆叶际筛
选到对芸豆锈病有拮抗作用的细菌, 并对它们进行
初步鉴定,旨在为农业生防用菌贮备菌种资源。
1
材料与方法
1. 1
材料
1. 1. 1
试验材料
采用通用引物 27F /1495R (正向
引物: 5

agag tttgatcctggtcagaacgaacgct
3
; 反向引物:
5

tacggg taccttgttacgacttcacccc
3
)进行 16S rDNA的
PCR扩增 [ 11, 12]。芸豆健康植株, 锈病植株。取样时
保留芸豆根际周围直径 10 cm的土壤,以保持植株
的生长状态。
1. 1. 2
试剂
DNA提取缓冲液: 0. 15mo l/L N aC ,l
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 8期
0. 1 mo l/L EDTA ( pH8. 0 ); SDS缓冲液: 4% SDS,
0
1mo l/L NaC ,l 100
g /mL蛋白酶 K; Tris饱和酚

氯仿
异戊醇 ( P
C
I) : 按体积比 25
24
1配制混匀,
4
保存;氯仿
异戊醇 ( C
I) :按体积比 24
1配制混
匀, 4
保存; TE缓冲液: T ris
HC ,l 10 mmo l/L; ED

TA ( pH8. 0) , 1 mmol /L。DNA聚合酶等分子生物学
试剂购于宝生物大连有限公司 ( TaKaRa B iotechno l

ogy( D alian ) Co. , L td. ) , 试剂配制方法参阅文献
[ 3]。
1. 1. 3
培养基
细菌分离用牛肉膏蛋白胨固体培
养基 (NA ) ,病原菌培养和拮抗菌筛选用 PDA固体
培养基,细菌培养用 LB培养基。
1. 2
病原菌分离及纯化
取锈病植株叶片 1 - 2片, 先用无菌水漂洗,
以去除表面灰尘浮土; 然后浸入 75%的乙醇溶液
消毒 30- 60 s;再用无菌水漂洗数次,洗去叶面残
留乙醇。待叶面水分晾干后, 用消毒的解剖刀切
取黄豆大小病变组织, 置于 PDA平板培养基上,
28
恒温培养, 待真菌菌落长出, 观察菌落特征及
显微观察真菌孢子形态, 经多次纯化 [ 4 - 6 ] , 得到锈
病病原菌。
1. 3
拮抗细菌的筛选
通过梯度稀释法,从芸豆健康叶子中分离细菌,
并采用传统的平板对峙方法进行拮抗试验, 筛选出
对芸豆锈病具拮抗能力的细菌,记录其编号,并分别
转接到 LB斜面上保存备用。
1. 4
形态特征及生理生化特征测定
对拮抗细菌的菌落形态,菌体细胞形态及部分
生理生化性状进行测定 [ 7- 9]。
1. 5
模板的制备和 PCR扩增
模板的制备方法参照文献 [ 10]。PCR反应体
系 ( 25
L) : Taq酶 ( 5 U /
L ) 0. 5
L, 10
Buffer
(M g
2+
) 2. 5
L, dNTPs( 10mmo l/L each) 0. 5
L,引
物各 1
L,模板 1
L, DepcH 2O 18. 5
L。
PCR反应程序为 95
预变性 5 m in, 94
变性
1 m in, 56
退火 1 m in, 72
延伸 1. 5 m in, 共 30个
循环, 72
延伸 10 m in; 4
保存。 PCR产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测, 溴化乙锭染色后, 在 UVP
紫外凝胶成像系统上观察照相。
目的片段用申能博彩 DNA小量快速纯化试剂
盒 ( 3S Spin A garose Ge lDNA purification k it)回收纯
化, 经 pMD18
T V ector(购自宝生物大连有限公司 )
连接,转化大肠杆菌 ( E scherichia coli) DH5
感受态
细胞,挑取阳性克隆 PCR验证后,送样测序,测序工
作由上海英骏生物技术有限公司完成。
1. 6
16S rDNA序列测定及分析
测序结果用 NCB I数据库中的 BLAST进行相似
性分析,采用 DNAMAN 6. 0程序进行多序列同源性
分析。
使用 MEGA4. 0( M o lecular Evo lut ionary G enet

icsA na lysis So ftw areV ersion 4. 0)程序包, 构建 Inte

rio r B ranch Test o f Phy logeny中的 N eighbor
Jo in ing
T ree,进化距离采用 Jukes
Cantor算法, 系统树各分
枝的置信度经重抽样法 ( Bootstrap) 1 000次重复
检测。
2
结果与分析
2. 1
芸豆锈病拮抗细菌的筛选
梯度稀释法从健康芸豆植株叶片中分离出 117
株细菌。通过对峙试验, 共筛选出 3株具有良好拮
抗效果的细菌,记为 SS2, L14b, NEW 2。
图 1
拮抗菌对芸豆锈病病原菌的拮抗作用
2. 2
拮抗菌的菌落特征及菌体形态
NEW2在 LB平板上培养 24 h后呈菌落灰白
色, 边缘不规则突起,不透明, 有粘性。菌体细胞大
小为 ( 0. 5- 2. 5)
m
( 1. 2- 10)
m。产芽孢, G + ,
细胞杆状。
SS2在 LB平板上培养 24 h后呈光滑,湿润, 不
透明,乳白色, 圆形,边缘不齐,菌落较平。菌体细胞
大小为 ( 0. 6- 0. 8)
m
( 4- 5)
m。产芽孢, G - ,
细胞杆状。
L14b在 LB平板上培养 24 h后呈菌落乳白色,
164
2010年第 5期 路晓萌等 :三株芸豆叶际拮抗细菌的筛选与鉴定
边缘环状突起, 中心褶皱,不透明,有黏性。菌体细
胞大小为 ( 0. 5- 2. 5)
m
( 1. 2- 10)
m。产芽
孢, G + , 细胞直杆状。 3株菌的菌体形态如图 2
所示。
SS2, L14b, NEW2的主要生理生化特征见表 1。
SS2与 Brevibacillus brevis的模式种在大多数生理生
图 2
三株拮抗细菌的菌体形态 ( 400
)
2. 3
拮抗菌的生理生化特征
表 2
三株菌与模式菌生理生化特征比较

特征 B reviba cillu s brevis SS2 Bac illu s subtili s L14b NEW 2

葡萄糖产酸 + + + + +

葡萄糖产气 - - - -

蔗糖 - ND ND

乳糖 - ND ND

木糖 - - + + +

阿拉伯糖 - + + + +

3
酮基乳糖 - - -

甘露醇 + + + + +

肌醇 - ND ND

柠檬酸盐利用 V + + + +

硝酸盐还原 V + + + +

反硝化 - ND ND

硫酸盐还原 - - -

M. R(甲基红 ) - - -

V. P测定 - - + + +

H2 S + ND ND

淀粉水解 - - + + +

明胶液化 + + + + +

牛奶分解 酸凝 产酸,胨化 产酸,胨化

接触酶 + + + +

脂酶 ( Tw een
80) + ND ND

卵磷脂酶 ND - - -

脲酶 - + +

苯丙氨酸脱氨酶 ND - - -

氧化酶 + + - -

运动性 + + +

生长需 2% NaC l V + + + +

10% NaC l - + +

吲哚 - - - -

甘油 - ND ND

固体油脂 - ND ND
+ .阳性; - .阴性; ND.未测定; V.菌株间不稳定的反应
165
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 8期
化指标上具有相同的特征, 少数指标如阿拉伯糖存
在差异。原因可能是不同菌株间确实存在差异,也
可能是生长环境影响了菌的生理特征。 L14b,
NEW 2与 Bacillus subtilis的模式种生理生化指标
相同。
2. 4
16S rDNA序列分析
16S rDNA纯化产物的 1%琼脂糖凝胶电泳见
图 3。将 SS2, L14b, NEW 2的 16S rDNA序列提交
GenBank, 所得收录号分别为 EU 771078、EU771076
和 EU 771079。系统进化树构建结果见图 4。
如图 4所示, SS2与 B revibacillus brevis同处于一
个最小的分支, 进化距离最接近,其 16S rDNA序列
与 B. brevis ( EU 812754)的相似性达 99%, 将 SS2鉴
定为短短芽孢杆菌 (B revibacillus brevis); L14b, NEW2
与 Bacillus subtilis同处于一个最小的分支,进化距离
最接近,其 16S rDNA序列与 B. subtilis ( EU257446)的
相似性达 100%,将 L14b, NEW2鉴定为枯草芽孢杆
菌 (Bacillus subtilis)。
1. SS2; 2. L14b; 3. NEW2; M. DL2000
图 3
16S rDNA扩增产物电泳图
图 4
基于 16S rDNA的系统发育树
3
讨论
将芸豆叶际中分离得到 117株细菌分离物,通
过对峙芸豆锈病病原菌 [ Uromyces append icu latus
(P ers. U ng. ) ] , 筛选到 3株细菌 SS2, L14b, NEW 2
具有较好拮抗效果。通过对其进行形态学观察,生
理生化测定, 16S rDNA序列及系统发育分析,初步
鉴定 SS2为短短芽孢杆菌 ( B revibacillus brevis ) ,
L14b, NEW 2为枯草芽孢杆菌 (Bacillus sub tilis) [ 13]。
短短芽孢杆菌在生物防治领域的应用国内外均
有报道,该菌的抑菌机理主要是其可以产生短杆菌
肽和几丁质酶等活性物质 [ 14- 16]。枯草芽孢杆菌由
于其安全性和能产生多种抗菌物质的特性, 已被广
泛应用于农业生产中 [ 17- 19 ]。针对从芸豆叶际筛选
到的锈病拮抗菌,应用于芸豆的生物防治,在生产中
应具有易定殖的优势,同时为农业生防用菌贮备了
菌种资源。
166
2010年第 5期 路晓萌等 :三株芸豆叶际拮抗细菌的筛选与鉴定
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(上接第 162页 )
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