全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
毕赤酵母碳源阻遏因子编码基因 PpM IG1
和 PpM IG2的克隆与序列分析
张平 周祥山 张元兴
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237 )
摘 要: 通过 M IG基因的同源性设计简并引物,采用 PCR方法从毕赤酵母 (P ichia pastoris )中成功克隆了两个 M IG同
源基因的核心片段, 同时利用 Genom eW alk ing的方法获得了基因的全长及其侧翼序列, 并分别命名为 PpM IG1和 PpM IG2。序
列分析显示, PpM IG1基因全长 1 335 bp, 编码 444个氨基酸; PpM IG2基因全长 1 365 bp, 编码 454个氨基酸。这个两个基因所
编码的蛋白质均与酿酒酵母碳源阻遏因子 ScM ig1同源, 在氨基末端具有两个典型的 C2H2锌指结构域, 该结构域能够与受葡
萄糖阻遏的许多基因的启动子相结合。PpM ig阻遏因子的获得为毕赤酵母碳源阻遏机制的研究奠定了基础。
关键词: 毕赤酵母 碳源阻遏因子 克隆
Cloning and Sequence Analysis of the Genes PpM IG1 and PpM IG2
Encoding Catabolite Repressors inP ichia pastoris
Zhang P ing Zhou X iangshan Zhang Yuanx ing
(S tateK ey Laboratory of B ioreactor Engineering, East China University of Science and T echnology, Shanghai 200237)
Abstrac:t In th is study, w e have c loned two M IG1 hom o logous genes in P ich ia patoris based on degenera te PCR and Genom e
W a lk ing m ethod. The tw o genes have been designated PpM IG1 and PpM IG2, respectiv ely. Sequence analysis o f the genes revealed a
1 335 bp open read ing fram e coding fo r 344 am ino acids in the case o f PpM IG1, and a 1 365 bp open reading frame fo r 354 am ino
acids in the case of PpM IG2. Bo th PpM IG genes encode pro tein hom o logous to the DNAb inding repressorM ig1 from Saccharom yces
cerevisiae ( ScM ig1), wh ich is a C2H 2 zinc finge r prote in and could bind to the promo ters o f m any genes repressed by g lucose. The
find ing of these two ca tabo lite repressors is the first step in e luc idating them echanism s of ca tabo lite repression in P. pastoris.
Key words: P ichia pastoris Catabolite repressor C lon ing
收稿日期: 20100504
基金项目:上海市重点学科建设项目 ( B505)
作者简介:张平,男,硕士,研究方向:酵母生物技术; Ema i:l zhangpingw@j gm ai.l com
通讯作者:周祥山,男,教授,博士生导师; Em ai:l xszhou@ ecu st. edu. cn
毕赤酵母和许多其它酵母一样都能够利用许多
的碳源生长繁殖,但是葡萄糖是它们最喜欢利用的
碳源。在葡萄糖存在下, 那些利用其它碳源 (譬如
半乳糖和甲醇等 )所需要的酶将受到抑制, 这些酶
的合成会在一个很低的水平甚至完全被抑制。以上
这种现象被称为碳源抑制或葡萄糖阻遏,碳源抑制的
调节机制在酿酒酵母中已经进行了许多的研究 [ 1, 2]。
M IG1 ( multicopy inhibitor o f GAL gene expres
sion)基因在葡萄糖阻遏中起着重要的作用。它编
码一个转录阻遏因子, 是在筛选酿酒酵母 GAL1启
动子转录抑制突变株的过程中第一次被鉴定出
来 [ 3]。M ig1是一个含有两个 C2H2锌指结构的蛋
白, 能够与受葡萄糖阻遏的许多基因的启动子相结
合, 来行使其转录阻遏的作用。在真菌中发现了
M ig的同系物 C reA, 它和 M ig一样在氨基末端具有
典型的两个 C2H2锌指结构域 [ 4]。M ig的结合除了
需要一个保守序列为 ( G /C ) ( C /T ) GGGG的 GC盒
外, 还需要靠近 GC盒 5 端的富含 AT碱基区域。推
测 M ig1的第一个锌指识别 G ( G /A ) G三联体, 第 2
个锌指识别 ( G /C ) ( C /T ) G三联体。富含 AT的区
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
域可能起到稳定结合的作用,因为它能够弯曲 DNA
链从而帮助蛋白 DNA之间的结合 [ 5]。
在酿酒酵母中, 没有葡萄糖的情况下, M ig1定
位于细胞质中,一旦加入葡萄糖, M ig1从胞质转运
到细胞核中 [ 6]。M ig1的这种转运机制,主要是取决
于该蛋白磷酸化 /去磷酸化, M ig1这种磷酸基团的
转移, 主要受到 Sn f1的调控, Snf1的活性是葡萄糖
抑制基因脱阻遏所必需的, 也就是说如果 SNF1基
因的突变或者敲除, 葡萄糖相关基因即使在葡萄糖
去除的条件下也将处于抑制状。近年来, M ig1的这
种转运机制有了深入的研究, 研究者发现 Hxk2(己
糖激酶 2)也参与了 M ig1的转运。M ig1第 311位的
丝氨酸残基起了关键的作用, Snf1能够磷酸化该氨
基酸残基,使 M ig1定位在细胞质中。在高浓度葡萄
糖中, Hxk2存在于细胞核中, 并且与 M ig1和 Hxk2
结合形成复合体, Hxk2与 M ig1的结合位点正好在
M ig1的 311位丝氨酸位点,从而阻止了 Snf1对该位
点的磷酸化, 使得 M ig1定位于核中,作为一个转录
阻遏因子抑制葡萄糖抑制相关基因的转录。在低葡
萄糖浓度下, Hxk2不与 M ig1结合,但是仍旧与 Snf1
结合。Hxk2与 M ig1结合的丢失促进了 Snf1对
M ig1的磷酸化,使得 M ig1被转运出细胞核, 相关基
因又开始转录 [ 7]。
本研究通过简并引物 PCR以及 GenomeW a lk
ing的方法,在毕赤酵母中克隆出了两个 M ig同系物
编码基因,分别命名为 PpM ig1(P ichia pastorisM ig1)
和 PpM ig2(P ichia pastoris M ig2)。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与质粒 大肠杆菌 TOP10, 毕赤酵母
GS115购自 Invitrogen公司, 质粒 pMD19T 购自宝
生物工程 (大连 )有限公司。
1. 1. 2 培养基 LB ( 1%蛋白胨, 0. 5%酵母提取
物, 1%氯化钠 ), YPD ( 2% 蛋白胨, 1% 酵母提取
物, 1%葡萄糖 )。固体培养基为上述成分再加入
2%琼脂粉。
1. 1. 3 主要试剂和仪器 G enome Wa lk ing K it购
自宝生物工程 (大连 )有限公司; P rem ix Taq、Marker
!、P lasm id K it、G el Extraction K it、TIAN amp Yeast
DNA K it购自上海天根生物工程有限公司; 氨苄青
霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 核
酸定量仪 ND1000购自 NanoD rop公司; Agarose购
自 Gene Tech公司; PCR仪购自 B ioRad公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 培养条件 大肠杆菌在 37∀ LBAmp icilin
平板培养或 LBAmp icilin液体培养基中 200 r/m in
振荡培养。毕赤酵母在 30∀ YPD培养基中 200 r /
m in振荡培养。
1. 2. 2 M IG简并引物的设计 利用酿酒酵母 M ig1
氨基酸序列 ( Saccharomyces cerevisiae, P27705)在
GenBank中检索来源于汉逊酵母 (H ansenu la Poly
morpha, EF523343)、乳酸克鲁维斯酵母 ( K luyvero
myces lactis, P50898)、马克斯克鲁维酵母 (K luyvero
myces marx ianus, P52288)、树干毕赤酵母 (P ich ia
stip itis, XM _001385145)、德巴利酵母 (D ebaryomyces
occiden tali s, CAD10675)等生物的 M ig1同系物序
列, 并用 GeneDoc软件进行比对, 找到氨基酸保守区
FHRLEHQTRH IR、LSSLQRMTP、KRSRPNSP和 LPP
( S) I( L ) RSL,并以此为模板,利用 Pr imer Prem ier 5
在保守区段设计简并引物扩增核心片段, 如表 1所
示。引物均由 Inv itrogen公司合成。
表 1 试验中所用引物
引物名称 序列 ( 5 - 3 )
M IGU p1 TTYCAYCGDCTRGAACATCAGACNAGACAC
M IGU p2 TTYCAYCGDCTRGAACATCAGAC
M IGD1 GGCGTCATKCTYTGYAANGABGAYAA
M IGD2 GGGGGARYTDGGYCKVGATTTYTT
M IGD3 YAARVWBCTDAKBGRHGGBRG
M 1_3 GSP1 GCCAGGTGTTGTCCCCAAGAAGA
M 1_3 GSP2 CAGTTTTACGGCAGTGATGACGCTT
M 1_3 GSP3 TCAACCCTCTAAGAAGTGCGTCTAC
M 1_5 GSP1 CACTTCTTAGAGGGTTGAACTTGGC
M 1_5 GSP2 AAGCGTCATCACTGCCGTAAAACTG
M 1_5 GSP3 AGTCTTCTTGGGGACAACACCTGGC
M 2_3 GSP1 AACCACAACCACTTCAACCACAACC
M 2_3 GSP2 AGCACAGATTCTCCCCACCATTTTC
M 2_3 GSP3 ATCACTCCAATCAGGACTCCAAGCA
M 2_5 GSP1 TTGAGAAGTCCCTGCCATCACCTGT
M 2_5 GSP2 GCAGCACCAGATGGAACCCAATAAA
M 2_5 GSP3 TGTTCTTCGTCCTTCCGCTTCTTCT
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2010年第 11期 张平等:毕赤酵母碳源阻遏因子编码基因 PpM IG1和 PpM IG2的克隆与序列分析
1. 2. 3 简并 PCR获得核心片段 优化 PCR反应条
件, 以毕赤酵母 GS115基因组 DNA为模板,分别用 6
对简并引物进行温度梯度 PCR (M IGUp1 /M IGD1、
M IGUp1 /M IGD2、M IGUp1 /M IGD3、M IGUp2 /M IGD1、
M IGUp2 /M IGD2和 M IGUp2 /M IGD3)。 PCR反应体
系 ( 15 L): 2 # Taq PreM ix 7. 5 L;引物 ( 100 pmo l/
L)各 0. 5 L; 模板 100 ng; 双蒸水补足至 15 L。
PCR反应程序: 94∀ 4m in; 94∀ 30 s, 40- 55∀ 40 s,
72∀ 2m in,循环 30次; 72∀ 10m in。将目标大小条
带回收,连接载体 pMD19T克隆后送 Inv itrogen公司
测序,最后通过将测序结果在 GenBank中利用 blast
进行比对来验证是否为 M IG基因的同系物片段。
1. 2. 4 运用 GenomeWa lk ing获得基因全长以及侧
翼序列 根据简并引物 PCR获得的核心序列设计 3
个特异引物 GSP(表 1), 设计方向为需要扩增的未
知区域方向, 引物 GSP2的位置设计在 GSP1的内
侧, GSP3位于 GSP2的内测, 每个引物之间距离为
100 bp左右。分别用 3对引物 AP /GSP1、AP /GSP2
和 AP /GSP3进行 3轮巢式 PCR,最终获得所需正确
的W alk ing扩增片段 ( AP为 K it中提供的简并引
物, 用于和未知区域序列随即结合; 3轮巢式 PCR
的模板分别为 GS115基因组 DNA、第一轮巢式
PCR产物、第二轮巢式 PCR产物 )。最后将 3 和 5
端W alking获得的序列与已知序列比对拼接, 并利
用 ORF Finder在线分析序列的 ORF ( http: / /www.
ncb.i n lm. n ih. gov /gorf/gor.f htm l)。
1. 2. 5 基因序列分析和进化树的构建 将通过简
并 PCR和 GenomeWa lk ing获得的毕赤酵母 M IG基
因翻译成氨基酸序列,并运用 C lusta lX进行同源性
分析。利用 MEGA 3. 1并通过邻接法 ( Ne ighbor -
Jo in ing) 进行进化关系分析和系统树的构建 [ 8] , 系
统树各分支的置信度 ( Bootstrap) 均进行 1 000次的
重复检验。
2 结果
2. 1 毕赤酵母 M IG基因简并引物的设计
不同物种中 M IG基因的氨基酸序列差别很大,
通过生物学软件 GeneDoc比对发现, 除了上游一个
含有两个 C2H 2锌指结构的序列相对保守外 (图 1
a) ,下游没有保守序列。但是设计简并引物至少需
要上下游各有一个保守区域, 且两个保守区域相距
50- 400个氨基酸为宜, 使得 PCR产物在 150 -
1 200 bp之间,最重要的是每一个保守区域至少有 6
个氨基酸残基, 因为每条引物至少 18 bp左右。所
以根据物种的亲缘关系, 选择亲缘相近的物种进行
2次或者 3次比对,分别发现了下游 3个保守序列,
并分别设计了 3个下游简并引物 (图 1b, 1c, 1
d)。
a. N端锌指结构域,划线标记两个锌指结构 ( ZnF) ,星号标记 ZnF中半胱氨酸和组氨酸残基; b, d.酵母 M ig蛋白 C端高度保守结
构域; c. M ig与霉菌 C reA抑制因子的高度保守结构域; 物种缩写: S c, Saccharom yces cerevisia e; H p, H an senula polymorpha; K ,l
K luyverom yce s lactis; Km, K luyverom yces ma rx ianu s; Ps, P ichia stip itis; Do, Deba ryomyces occid en ta li s; An, A sperg illus n idu lan s; N c,
N eu rospora cra ssa; Pv, P enici llium verru cu losum; Ao, A sperg illus oryzae
图 1 M ig同源蛋白多序列比对结果
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
2. 2 PpM IG1, PpM IG2基因核心片段的克隆
采用 T IAN ampYeast DNA试剂盒,获得的毕赤酵
母基因组 DNA,用核酸定量仪 ND1000检测 DNA浓
度和纯度。然后以基因组 DNA为模板,分别用上游 2
个引物 ( M IGUp1与 M IGUp2 )和下游 3个引物
(M IGD1、M IGD2与 M IGD3)组成 6对简并引物,并以
4个不同的退火温度对基因组 DNA进行 PCR, 结果
如图 2所示。利用 M IGU p1/M IGD2 和 M IGUp2/
M IGD2 2对引物能够得到明亮且大小正确的 PCR条
带,其余 4对引物均没有 PCR产物或产物极少且大
小不正确, 可能为错配的结果。运用 M IGUp1/
M IGD2在退火温度较低的情况下可以得到 2条大
小相近的 PCR条带, 且均在预测大小范围之内, 对
其进行回收并测序,发现均属于酿酒酵母 M ig1蛋白
的同系物。将其分别命名为 PpM IG1和 PpM IG2
基因。
M. Mark er! ; 1 - 4.利用引物 M IGU p1 /M IGD1分别以
40∀ 、45∀ 、50∀ 和 55∀ 为退火温度进行 PCR; 5-
8. 利用引物 M IGUp1 /M IGD2 分别以 40∀ 、45∀ 、
50∀ 和 55∀ 为退火温度进行 PCR; 9- 12. 利用引物
M IGU p1 /M IGD3分别以 40∀ 、45∀ , 50∀ 和 55∀ 为
退火温度进行 PCR; 13 - 16. 利用引物 M IGU p2 /
M IGD1分别以 40∀ 、45∀ 、50∀ 和 55∀ 为退火温度
进行 PCR; 17- 20. 利用引物 M IGUp2 /M IGD 2分别以
40∀ 、45∀ 、50∀ 和 55∀ 为退火温度进行 PCR; 21-
24. 利用引物 M IGUp2 /M IGD3分别以 40∀ 、45∀ 、
50∀ 和 55∀ 为退火温度进行 PCR
图 2M ig简并 PCR扩增产物
2. 3 PpM IG1, PpM IG2基因全长以及侧翼序列的
获得
利用 GenomeW alking的方法以及根据核心片
段设计 GSP引物,分别对毕赤酵母的 2个 M ig同系
物基因的 3 端和 5 端进行了 3轮巢式 PCR, 如图 3,
图 4所示。 PpM IG1核心片段通过 3 端 Walk ing延
伸了 3 000 bp左右,通过 5 端W alking延伸了 2 000
bp左右; PpM IG2核心片段通过 3 端 W alking延伸
了 1 500 bp左右, 通过 5 端 W alk ing延伸了 800 bp
左右。分别对延伸的片段进行了测序和拼接, 最后
得到了 PpM IG1和 PpM IG2基因的全长及其测序序
列, 为以后的功能研究奠定了基础。
M. M arker!; 1. 3 端第一轮巢式 PCR; 2. 3 端第二轮巢
式 PCR; 3. 3 端第三轮巢式 PCR; 4. 5 端第一轮巢式
PCR; 5. 5 端第二轮巢式 PCR; 6. 5 端第三轮巢式 PCR
图 3 PpM IG1基因两端染色体走读结果
M. Marker! ; 1. 3 端第一轮巢式 PCR; 2. 3 端第二轮
巢式 PCR; 3. 3 端第三轮巢式 PCR; 4. 5 端第一轮巢式
PCR; 5. 5 端第二轮巢式 PCR; 6. 5 端第三轮巢式 PCR
图 4 PpM IG2基因两端染色体走读结果
2. 4 毕赤酵母 M IG基因序列分析
利用 ORF F inder在线分析序列的 ORF, 发现
PpM IG1基因全长 1 335 bp, 编码 444个氨基酸 (图
5); PpM IG2基因全长 1 365 bp, 编码 454个氨基酸
(图 6)。
酿酒酵母中 ScM IG1基因的缺失作图研究发现
了它可能的作用域和调节域 [ 9 ]。 ScM ig1羧基末端
的 24个氨基酸融合 DNA结合域已经足够抑制其它
基因,并发现了其作用域的氨基酸保守序列 LP
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2010年第 11期 张平等:毕赤酵母碳源阻遏因子编码基因 PpM IG1和 PpM IG2的克隆与序列分析
PIRSL。抑制的强度会随着葡萄糖浓度的减小而缓
解,在这个过程中又发现了 M ig1的两个内部元件也
参与了抑制作用, 其中一个是两个保守的 RXXS基
序,是蛋白激酶可能的作用位点; 另外是 3 端靠近
锌指的一个碱性结构域,它可能参与 M ig1的细胞核
定位。
通过对毕赤酵母 PpM ig1和 PpM ig2氨基酸序列
的分析,发现在这两个蛋白因子中均含有 M ig特有
的作用域保守序列。其中 PpM ig1的序列与 ScM ig1
一样均为 LPPIRSL; PpM ig2有几个氨基酸残基不
同, 其序列为 LPSLSSL (图 7a)。在羧基末端还发
现了另外一个氨基酸保守序列 KKSRPNSP (图 7
b), 该序列的功能尚未有研究报道。此外, 还发现
PpM ig2氨基酸序列第 159到 203位之间存在一个
富含谷氨酰胺的区域, 并且掺有少许的天冬氨酸
(图 7c) ,许多真核生物转录调控因子中均含有类
似序列,有报道称含有这种结构的蛋白可以调控其
它基因的表达 [ 10]。
间隔线标记 C2H2锌指结构;实线标记羧基末端高度保守序列 KKSRPNSP;虚线标记 M ig羧基末端功能域
图 5 毕赤酵母 PpM IG1基因及其编码序列
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
间隔线标记 C
2
H
2
锌指结构;实线标记羧基末端高度保守序列 KKSRPNSP;虚线标记 M ig羧基末端功能域
图 6 毕赤酵母 PpM IG2基因及其编码序列
图 7 毕赤酵母 PpM ig1、PpM ig2功能作用域分析
利用毕赤酵母 PpM ig1氨基酸序列作参照, 在
GenBank中查找到了 19个同源序列,用 C lusta lX软
件进行序列多重比对分析,并利用 MEGA 3. 1根据
分析结果进行了进化树的构建, 结果如图 8所示。
PpM ig1与汉逊酵母 M ig1同源性最高, PpM ig2与汉
逊酵母 M ig2的同源性最高。原因可能由于毕赤酵
母 (P ichia pastoris)和汉逊酵母 (H ansenula polymor
pha,又名 P ichia angusta )均属于毕赤酵母属, 并同
为甲醇利用型酵母。
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2010年第 11期 张平等:毕赤酵母碳源阻遏因子编码基因 PpM IG1和 PpM IG2的克隆与序列分析
Ne ighbor join ing进化树利用软件 CLUSTAL X和 MEGA
3. 1构建得到;括弧中的数字为各蛋白氨基酸序列的
GenBank登录号;标尺刻度表示了 10%的序列差异
图 8 基于 N eighborJoining方法构建的
M ig同系物进化树
3 讨论
毕赤酵母已被开发成为一种高效的真核生物外
源蛋白表达系统,许多蛋白通过该系统成功表达,这
些蛋白来源于整个生物界,包括病毒、细菌、真菌、植
物、昆虫和脊椎动物 [ 11]。毕赤酵母表达系统的应用
基于一个强效的 AOX1启动子, 但是该启动子受甲
醇的严格调控,它的启动表达离不开甲醇的诱导,并
且受到其它碳源的抑制 [ 12]。甲醇有毒、易燃、强耗
氧,给发酵过程带了诸多困难, 并且不适于食品或者
添加剂的生产。通过研究酵母碳源阻遏的信号调控
通路, 找到控制碳源阻遏的关键因子;通过对其功能
的研究开发,毕赤酵母非甲醇诱导表达系统具有重
要的意义。
碳源阻遏因子 M ig是一个大家族, 不同家族成
员编码的氨基酸序列差异很大,但仍有一些高度保
守的区域存在,这些高度保守的残基可能与该蛋白
的结合和功能有关。本研究在毕赤酵母中克隆得到
的两个 M ig的类似物的氨基末端均具有两个典型的
C2H 2锌指结构域。在羧基末端发现了一个由 8个
氨基酸残基组成的高度保守域 KRSRPNSP (图 1
c) ,并且这个结构域只在毕赤酵母属 (P ichia stip itis、
H ansenula Polymorpha )和霉菌中存在, 在酿酒酵母
等其它酵母中均没有发现, 但是这个保守残基在
M ig发挥功能中所起的作用有待于进一步的研究。
参 考 文 献
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