全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
微生物转化制备活性维生素 D3的研究进展
冯海婷 陆凌霄 文鹏 陆群
(西南交通大学生命科学与工程学院,成都 610031 )
摘 要: 活性维生素 D类药物作为一类高效原料药,采用化学合成方法, 制备复杂, 限制了其广泛应用。采用微生物转
化法条件温和, 操作简单,对于活性维生素 D3的制备具有重要意义。从甾体羟化菌株, 生物转化制备不同活性维生素 D3、基
因工程在生物转化上的应用及转化率的影响因素等方面综述了其研究进展, 并对该领域的发展趋势进行了展望。
关键词: 微生物转化 活性维生素 D3 甾体 放线菌 转化率
Advances in Research of Preparing Active V itam in D3 by
M icrobial Transformation
FengH a iting Lu L ingx iao W en Peng Lu Qun
( School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031)
Abstrac:t A ctive v itam in D is a k ind of h igh perform ance ma teria lm ed ic ine. The chem ica l syn thesis of ac tive v itam in D is com
p lex, w hich has lim ited the w ide app lication, but prepa ring active v itam in D
3
by m icrob ial transforma tionin in m ild cond itions is opera
ted s imp le ly. The paper rev iew ed the prog ress o f the research from the type of stero id hydroxy la tion bac teria, b io transform ation to d iffe r
ent ac tive v itam in D3, genetic eng inee ring applications in the b io log ical transform ation and the influenc ing factors of transfo rm ation, then
look forw ard to the developm ent trends of this a rea in future.
Key words: M icrob ia l transform ation Ac tive v itam in D3 Ster ides Actinomyces Conversion
收稿日期: 20091207
作者简介:冯海婷,女,在读研究生,研究方向:生物转化; Em ai:l haibao. feng@ 163. com
通讯作者:陆群,男,副教授,硕士生导师, Em ai:l luqun1125@ 126. com
维生素 D3是固醇类衍生物,在人体内的主要作
用是促进骨质钙化, 调节钙、磷代谢及细胞生长分
化,还是一种良好的选择性免疫调节剂 [ 13]。其中
又以活性维生素 D3的生理作用最强,活性维生素 D3
有 25OH维生素 D3、1OH 维生素 D3和 1, 25二
羟维生素 D3三种形式。随着对维生素 D类药物生
理功能研究的深入, 其应用更加广泛, 需求量也更
多,目前以瑞士的罗氏公司产量最大 [ 2]。活性维生
素 D类药物作为一类高效原料药, 目前主要采用化
学合成法。化学合成法制备活性维生素 D3, 需进行
多步的基团保护和脱保护,经光照反应,开环和异构
化而得 [ 4]。合成步骤多, 分离纯化复杂,收率低,阻
碍了其广泛使用。而生物转化法能完成一些化学合
成难以进行的反应 [ 5] , 具有较强的区域选择性和立
体选择性 [ 6, 7] , 在温和均一的条件下容易实现自动
化和反应的重现性,且成本低,对环境的污染小。近
几年来对微生物转化法制备活性维生素 D3的研究
越来越多,尤其以日本研究最广。综述了近年来该
领域的研究成果。
1 具有甾体羟化能力的菌株
微生物转化是利用微生物的酶对底物的某一部
位进行特定的化学反应来获得一定的产物。目前为
止, 已发现 3 000余种具有催化作用的酶, 细胞色素
P450酶 ( cy tochrom e P450)能催化多种反应 [ 5, 8]。许
多丝状真菌及放线菌具有甾醇羟基化能力, 该生物
转化作用也是由 P450酶催化的。诺卡氏菌属 (N o
card ia)、分枝杆菌属 (Mycobacterium )、链霉菌属
( S trep tomyces)、无枝酸菌属 (Amycolata )、节杆菌属
(Arthrobacterium )、假诺卡式菌属 ( P seudonocard ia )
以及丝状真菌根霉属 ( Rhizopus )、弯孢属 ( Curvular
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
ia)、镰刀菌属 ( Fusarium )、曲霉属 (A sp erg illus )、毛
霉菌属 (M ucor)等 [ 1, 8- 12]微生物都具有甾体药物羟
基化能力。另外,甾体不同部位的羟基化可以由不
同菌种来完成 [ 8, 12]。
活性维生素 D3属于甾醇类维生素。目前已报
道的可用于转化制备活性维生素 D3的菌株以放线
菌居多。郑东虎等 [ 3]用活性放线菌菌株将维生素
D3转化为 25OH维生素 D3。Sasaki等 [ 13]及 Takeda
等 [ 14]都成功的利用自养无枝酸菌 ( Amycolata au
totrophica )将维生素 D3转化为活性维生素 D3。
Sasaki等 [ 7]研究发现菌核链霉菌 (S trep tomyces sclero
tialus) FERM BP1370和玫瑰孢链霉菌 (S trep tomyces
roseosp orus) FERM BP1574分别以 25OH 维生素
D3和 1OH维生素 D3为底物,可转化生成 1, 25
二羟维生素 D3。K ang等 [ 10]利用自养假诺卡式菌
(P seudonocard ia auto trophica) ID 9302将 1, 25二羟
维生素 D3的转化条件给予优化。 Ke iko等 [ 15]与
Sug imoto等 [ 16]都对浅灰链霉菌 ( S trep tomyces griseo
lus)做了基因工程改造,其具有 25位羟基化能力。
2 微生物转化制备活性维生素 D3
目前生物制备活性维生素 D3,其羟基化作用主
要发生在 1位和 25位。基因工程技术在活性维生
素 D3的应用方面也起到了至关重要的作用。
2. 1 1, 25二羟维生素 D3的制备
目前转化制备 1, 25二羟维生素 D3的研究较
多。Sasaki等 [ 7 ]筛选出两株活性菌株 菌核链霉菌
(S trep tomyces sclerotialus ) FERM BP1370和玫瑰孢
链霉菌 ( Strep tomyces roseosporus) FERM BP1574, 其
分别以 25OH 维生素 D3和 1OH维生素 D3为底
物,转化生成 1, 25二羟维生素 D3。两株菌的 1
羟基化的平均反应速率分别为 7. 0 g /L m in和
6. 9 g /L m in, 转化率均为 10. 2%左右。 Sasaki
等 [ 13]筛选出 12株具有将维生素 D3转化为 1, 25
二羟维生素 D3能力的菌株。首先在 25位羟基化生
成 25OH维生素 D3 (转化率为 8. 3mg /L ),随后 1
羟基化进而生成 1, 25二羟维生素 D3 (转化率为
0. 17mg /L)。利用 CO差光谱检测到了自养无枝酸
菌 (Amycolata autotrophica ) FERM BP1573中的细胞
色素 P450。
经过诱变处理,可获得具有高活性维生素 D3羟
化酶的突变型。突变株不仅具有更高的酶活,并且对
底物的反应活性位点具有高度的选择性。Keiko
等 [ 15]对浅灰链霉菌 ( S trep tomyces griseolus )中的
CYP105A1上的两个关键残基 Arg73和 A rg84进行了
定向诱变。研究发现 CYP105A1的反应活性位点和
构象发生了改变, 酶对底物的选择更倾向于 1OH
维生素 D3,得到的突变株对 1OH维生素 D3的 25
位羟基化作用更强, 而对 25OH维生素 D3的 1位羟
基化相对较弱。
2. 2 25OH维生素 D3的制备
我国已有学者对 25OH维生素 D3的生物制备
进行了研究。郑东虎等 [ 3]用暂命名为 TN955的活
性放线菌菌株将维生素 D3转化为 25OH 维生素
D3。发酵培养基的主要成分为 1% 淀粉、1% 麦
芽糖。
具有转化活性的野生型菌株,其转化能力较弱。
而对菌株进行诱变处理,获得的突变株具有较野生型
更高的羟化酶活性。 Fujii等 [ 1]从自养假诺卡式菌
(P seudonocard ia autotrophica ) NBRC 12743中分离得
到特异的维生素 D3羟化酶 ( v itam in D3 hydroxy lase)基
因 vdh。经随机诱变将 4个氨基酸替换整合获得 vdh
K1突变菌株,其含有的羟化酶比野生型菌株活性更
高。将 vdh基因整入红平红球菌 (Rhodococcus ery th
rop olis)基因组中, vdh基因成功表达, 将维生素 D3转
化为活性维生素 D3。
甾醇的微生物转化实际上是利用微生物的酶对
甾醇的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的
产物, 加入酶抑制剂后, 抑制剂与酶活性有关的部
位结合改变了酶活性中心的结构 (构象 )与性质, 从
而引起酶活力下降。CO、SKF525A和美替拉酮是
细胞色素 P450的抑制剂, 可抑制 1OH 维生素
D3、25OH维生素 D3的羟基化作用 [ 7 ]。在以维生素
D3为底物转化制备 1, 25二羟维生素 D3的过程中,
25OH维生素 D3将作为转化过程中的中间产物。
若适当减少转化时间, 加入 1位的酶抑制剂, 摸索
出合适的反应条件即可获得以 25OH维生素 D3为
主要产物的转化路线。
2. 3 1OH维生素 D3的制备
1OH维生素 D3的研究报道较少,日本专利于
56
2010年第 4期 冯海婷等:微生物转化制备活性维生素 D3的研究进展
2005年公布了 1OH 维生素 D3的生物转化方
法 [ 17]。发酵培养基: 1. 5%葡萄糖, 1. 5%黄豆饼粉,
0. 5%玉米浆, 0. 5% NaC ,l 0. 2% CaCO3, pH7。活性
菌株为无枝酸菌 (Amycolata ), 以维生素 D3为底物生
成 1OH维生素 D3。底物经过 环糊精的包埋处
理,获得了较好的效果。目前, 本实验室也在做这方
面的研究。
2. 4 维生素 D3同类药物的转化
维生素 D2与维生素 D3同属甾体药物,研究还发
现某些具有维生素 D 3转化能力的菌株还可以以维
生素 D2为底物, 转化生成 25OH维生素 D2。Natsu
m i等 [ 18]通过基因克隆,在大肠杆菌中成功表达链霉
菌 P450SU1。该蛋白除了可以将维生素 D3转化为
1, 25二羟维生素 D3外,还对维生素 D2具有 25位羟
基化作用。在其催化下, 主要产物为 25OH 维生素
D2、24OH维生素 D2、27OH维生素 D2
3 基因工程技术在生物转化中的应用
近年来,关于 P450酶结构与功能的研究越来越
多,为其表达基因的相关研究奠定了基础,从而使基
因工程技术在生物转化中的应用更加广泛。
CYP27B1是 25OH 维生素 D3的 1羟化酶, 催化
1, 25二羟维生素 D3的合成。 20世纪 90年代,日
本就成功地将人和小鼠的 CYP27B1基因克隆在大
肠杆菌中 [ 19~ 21]。随后, Uch idaa等 [ 22]等将大肠杆菌
的分子监控蛋白 GroEL /ES过表达,发现 CYP27B1的
表达水平远高于野生型。而缺少该分子监控蛋白时,
CYP27B1发生折叠导致表达水平降低。 CYP105A2
对维生素 D3具有 25位羟化作用。K awauchi等 [ 23]将
自养无 枝酸菌 ( Amycolata autotrophica )中编 码
CYP105A2的基因克隆成功。目前已有学者利用基
因工程方法改造 P450酶特异调节基因从而构建具有
高度专一性和高转化率的基因工程菌, Sug imoto
等 [ 16]通过对浅灰链霉菌 (S trep tomyces griseolus)的定
向诱 变得 到 R84A 突 变株。通过对 R84A 的
CYP105A1的结构分析, 提出了活性维生素 D3的两
步羟基化的反应机理, 发现其 25羟基化作用是野
生型的 32倍。
4 转化率的影响因素
4. 1 发酵液中维生素 D3的溶解度
底物在发酵液中的溶解度限制了维生素 D3的
转化。维生素 D3是脂溶性化合物, 在发酵液中的溶
解度很低,导致转化率很难达到工业生产水平。将
维生素 D3溶解于乙醇后再加入发酵液中已成为常
用的添加方式。提高维生素 D3在发酵液中的溶解
度的方法,主要是向底物中添加表面活性剂或对维
生素 D3进行包埋处理增加其水溶性,常用的增溶剂
有 环糊精和部分甲基化的环糊精 [ 14, 17, 24 ]。Take
da等 [ 14]通过向底物中添加部分甲基化的 环糊精
的包埋方式, 利用自养无枝酸菌 ( Amycolata au
to trophica)将 25OH 维生素 D3的转化率 ( 8. 3 g /
mL)提高到 16 g /mL, 将 1, 25二羟维生素 D3的
转化率 ( 0. 17 g /mL)提高到 2 g /mL。
4. 2 培养基
培养基的组成对菌株的生长状况有一定影响,
菌丝体数量越大转化效果越好,因此,对培养基进行
优化有助于提高维生素 D 3的转化率。Kang等 [ 10 ]通
过考察培养基碳源、氮源、金属离子浓度、初始 pH
值、温度等影响因素, 将维生素 D3转化生成 1, 25
二羟维生素 D3的培养条件给予优化。确立了自养
假诺卡式菌 (P seudonocard ia auto trophica ) ID 9302
的最佳转化条件: 0. 4%酵母浸提液、1%葡萄糖、3
%淀粉、1%鱼粉、0. 2% N aC l、0. 01% K2HPO4、0. 2
% CaCO3、0. 01% NaF, pH值 7. 0, 转化温度 28! 。
使用 75 L发酵罐,最大转化率可达 10. 4mg /L- 1。
5 展望
随着对维生素 D类药物生理功能研究的深入,
近年来对微生物转化维生素 D 3的研究快速发展。
但是较低的转化率仍是需要解决的关键。 P450酶
的作用特点、基因工程技术在生物转化方面的应用、
如何更有效地提高底物与酶的相互作用将是未来转
化制备活性维生素 D 3的研究重点。相信随着生物
技术的快速发展,活性维生素 D3的生物制备将会有
新的突破。
参 考 文 献
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