全 文 ：植物学通报 2005, 22 (5): 555~559
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金项目(39970166)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: zhang-gy@mail.tsinghua.edu.cn
收稿日期: 2004-10-20 接受日期: 2005-01-13 责任编辑: 孙冬花
实 验 简 报
低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞
精氨酸脱羧酶活性的影响①
张贵友②　李 萍　戴尧仁
(清华大学生物科学与技术系　北京　100084)
摘要 研究了褪黑激素对烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞在低温胁迫下精氨酸脱羧酶活性及细胞
生存率的影响。发现褪黑激素可以明显提高低温胁迫下烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶的活性, 并明显提
高细胞的生存率。表明褪黑激素可能在低温条件下通过调节植物细胞内多胺的合成而提高抵御冷害的
能力。
关键词 褪黑激素, 烟草悬浮细胞, 精氨酸脱羧酶
Arginine Decarboxylase Activity is Increased in Tobacco
(Nicotiana tabacum) Suspension Cells by Exogenous
Melatonin During Cold Stress
ZHANG Gui-You② LI Ping DAI Yao-Ren
(Department of Biological Sciences and Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084)
Abstract The effect of melatonin on the activity of arginine decarboxylase and cell viability was
examined in tobacco suspension cells during cold stress. Melatonin could increase the activity
of arginine decarboxylase and decrease the rate of cell death. Melatonin could enhance the
resistance to chilling injury by regulating the synthesis of polyamine in plant cells.
Key words Melatonin, Tobacco (Nicotiana tabacum) suspension cells, Arginine decarboxylase
近年来人们在许多植物中陆续发现褪黑
激素, 但是关于褪黑激素在植物细胞中的作用
还不十分清楚, 许多观点都是根据褪黑激素在
动物体内的功能推测而来。有实验表明, 对
短日照植物红叶藜(Chenopodium rubrum)在
黑暗期前１小时施以外源褪黑激素可以减少
开花(Kolar et al., 1999)。有些学者提出褪黑
激素可能参与种子休眠的调节(van Tassel and
O’Neill, 2001)。有趣的是在一些植物中存在
褪黑激素合成的昼夜节律性(Kolar et al., 1995,
1997), 暗示着褪黑激素可能参与植物光周期的
调节。当人们发现褪黑激素可以在化学体系
中抑制活性氧自由基以后(Tan et al., 1993), 越
来越多的实验证据表明褪黑激素在植物体内
556 22(5)
的重要功能是起抗氧化剂的作用(Dubbels et
al. ,1995; Manchester et al., 2000)。但是
褪黑激素在植物中作用的详细机制还需进一
步研究。
精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,
EC 4.1.1.19, ADC)是植物体内催化游离态多
胺合成的一种关键酶(Watson and Malmb-
erg,1996)。它以精氨酸为底物催化形成鲱
精胺和二氧化碳, 鲱精胺在鲱精胺尿素水解
酶的作用下进一步生成腐胺。而腐胺是生
物体内源多胺合成途径的中心物质(汪沛洪,
1990)。在高等植物中, 多胺代谢对各种胁迫
条件是十分敏感的。当植物处于水分胁迫
( W a n g a n d S t e f f e n s , 1 9 8 5 )、紫外辐射
(Kramer et al.,1991)、缺氧(Reggiani et al.,
1990)、低温(Serrano et al.,1997)及机械损
伤(Valero et al.,1998)等状况时, 体内会积累
大量的腐胺。尽管其详尽的生理功能并不
清楚, 但是很可能与植物对逆境的防卫反应
有关(Galston and Kour-Sawhney, 1990)。
低温导致细胞膜结构损伤可能是产生冷害的
根本原因, 而多胺能够起到对细胞膜的稳定
和保护作用(Mager,1959), 因此多胺在植物的
低温保护研究中受到广泛关注。此外, 多胺
作为质子来源, 可以有效地清除超氧离子自
由基(Drolet et al.,1986), 从而降低膜的损伤
和冷害的发生。我们曾发现褪黑激素可以
抑制低温诱导的胡萝卜(Daucus carota)悬浮
细胞的凋亡, 但是在此过程中并未引起细胞
内活性氧自由基含量的明显改变, 表明褪黑
激素并非通过直接清除自由基而起到保护作
用。但是褪黑激素的预处理可以明显提高
胡萝卜细胞内多胺的含量水平(Lei et al . ,
2004)。本实验旨在检测低温胁迫下褪黑激
素对烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞精氨
酸脱羧酶合成的影响, 从而为阐明褪黑激素
抵御冷害的机理提供依据。
1 材料和方法
1.1 烟草悬浮细胞的培养及处理
烟草(Nicotiana tabacum, BY-2)悬浮细胞
接种于含有0.6 mg.L-1 2,4-D的 MS基本培养
基中, 在26 ℃,130 r.min-1 条件下培养, 每5天
以1:6传代1次,取对数生长期的烟草悬浮细胞
进行实验。悬浮细胞的低温处理在 2~4 ℃,
130 r.min-1条件下进行。每隔48小时进行取
样, 在26 ℃正常培养条件下恢复2~3小时后进
行检测和分析。每个样品平行处理３份, 每
个实验至少重复３次, 计算平均值。
1.2 细胞死亡率的测定
在载玻片上滴一滴细胞悬液, 用 0.5%
台盘兰(溶于PBS中)染色1分钟后在显微镜
下观察。死细胞被染成蓝色 , 活细胞不着
色。分别统计视野中死细胞和活细胞的数
目, 计算出细胞死亡率, 每个处理至少统计
1 000 个细胞。
1.3 精氨酸脱羧酶的提取和检测
精氨酸脱羧酶的提取及检测参照赵福庚
和刘友良(2000)建立的方法,并略作修改。离
心收集细胞,加入预冷的提取缓冲液,于冰浴中
充分研磨, 4层纱布过滤后, 取 40%饱和度的
(NH4)2SO4进行沉淀。2 000 g离心 15分钟后
在获得的上清液中加入60%(NH4)2SO4, 充分溶
解后以 3 000 g离心 15分钟获得沉淀。把沉
淀溶于10 mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH6.3)中,
对此溶液透析(4 ℃过夜)。加入 2 倍体积
的-15 ℃的丙酮, 于0 ℃下振荡 5分钟后, 以
5 000 g离心4分钟(4 ℃), 沉淀溶于10 mmol.
L-1磷酸缓冲液中, 透析过夜。以 15 000 g离
心 15分钟后, 取上清液用于检测酶活。反应
体系包括1 mL反应缓冲液(100 mmol.L-1 Tris-
HCl, 5 mmol.L-1 EDTA-Na, 40 µmol.L-1
Pyridoxal, 5 mmol.L-1 DTT), 0.5 mL精氨酸脱
羧酶提取液,在37 ℃水浴中放置2分钟后, 加
5572005 张贵友等: 低温胁迫下褪黑激素对烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶活性的影响
入0.2 mL 25 mmol.L-1的L-Arg,调pH至7.5,
37 ℃下反应60分钟, 加入高氯酸至终浓度5%
终止反应, 对照在开始时即加入高氯酸。反
应结束后, 3 000 g离心10分钟, 取0.5 mL上清
液加入1 mL 2 mol.L-1的NaOH,混合后加入10
μL苯甲酰氯, 漩涡振荡20秒, 25 ℃下反应60
分钟后, 加入 2 mL饱和NaCl。混合后加入 2
mL乙醚, 振荡后1 500 g离心5分钟, 收集1 mL
醚相, 于50 ℃下蒸干, 将沉淀溶于1 mL重蒸甲
醇中, 在紫外分光光度计上检测254 nm处的吸
光值。酶活以mol(Agm).g-1(FW).h-1表示。
2 结果与讨论
2.1 低温胁迫对烟草细胞成活率的影响
在低温诱导前用10和20 ng.mL-1的褪黑
激素处理烟草悬浮细胞5天, 其生长状况与未
经预处理的对照细胞没有明显差别。但是在
低温条件下经褪黑激素预处理的细胞明显降
低了细胞的死亡率(图 1)。台盘兰染色发现,
细胞的成活率随着褪黑激素的预处理浓度的
增加而提高。当用 20 ng.mL-1的褪黑激素预
处理时, 随着诱导时间的延长, 细胞成活率只
有小幅度下降, 而对照细胞的存活率则发生明
显变化。当培养到第6天时, 对照细胞的存活
率从 94.5%下降到 50.4%。
2.2 褪黑激素对精氨酸脱羧酶的影响
烟草悬浮细胞经过低温诱导 24小时后,
精氨酸脱羧酶的活性在褪黑激素预处理组和
对照组之间没有明显的差异。在低温诱导第
4~6天时, 经褪黑激素预处理的烟草悬浮细胞
其精氨酸脱羧酶的活性明显提高, 并呈现出剂
量效应(图 2)。与此同时, 在低温处理第 6天
时,对照细胞的死亡率为49.6%,而经过10 ng.
mL-1和20 ng.mL-1褪黑激素预处理的细胞死
亡率分别下降至 28%和 21.7%, 差异十分显
著。表明褪黑激素在低温胁迫下提高烟草悬
浮细胞生存率与精氨酸脱羧酶活性的增强可
图1 褪黑激素预处理对低温诱导下烟草悬浮细胞
成活率的影响
在低温诱导之前, 悬浮细胞分别用10和20 ng.mL-1
的褪黑激素预培养 5天
Fig. 1 The effect of melatonin on cell viability during
cold stress
Tobacco cells were incubated with 10 and 20 ng.mL-1
melatonin before 5 days of cold treatment
图2 烟草悬浮细胞精氨酸脱羧酶(ADC)活性的检
测
烟草悬浮细胞在低温 2~4 ℃, 135 r.min-1处理 1~6
天, 26 ℃恢复 2~3小时后提取ADC并进行活性检
测
Fig.2 Determination of arginine decarboxylase activ-
ity in tobacco suspension cells
Cold stress was induced by transfer of suspension cul-
ture to a cold room (2-4 ℃) under constant shaking
(135 r.min-1). ADC was assayed after 2-3 hours un-
der 26 ℃ for recovery
558 22(5)
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能存在着内在联系, 即通过调节细胞内多胺的
含量来增强抵御冷害的能力。
与传统的抗氧化剂相比, 褪黑激素有许多
特殊的化学特性, 如富含电子的吲哚环5碳位
置上的甲基对于自由基的清除具有重要作用
(Tan et al., 2000)。但是我们曾发现褪黑激素
在抑制冷诱导的细胞凋亡过程中并未出现
ROS水平的明显改变(Lei et al., 2004), 说明褪
黑激素对冷害的抑制作用并非通过直接清除
自由基而实现的。同时我们还发现在低温胁
迫下褪黑激素可以提高植物细胞内多胺的合
成, 用0.5 mmol.L-1的多胺预处理细胞可以明
显抑制冷诱导出现的 DNA降解(Lei et al. ,
2004)。有学者认为, 在生理pH条件下多胺以
多聚阳离子的状态存在, 因此可与细胞膜上的
阴离子成分如磷脂相互结合而加固细胞膜的
双分子层结构(Ballas et al., 1983)。高水平的
内源多胺参与植物对生物及非生物胁迫的抗
性(Bouchereau et al., 1999), 特别是植物对冷
害的抗性(Kim et al., 2002)。当然, 褪黑激素
本身也可以对细胞膜起到保护作用, 它可以插
入细胞膜内不饱和脂肪酸的两极之间以减少
过氧化反应并保持细胞膜良好的流动状态
(Garcia et al., 1997; Ceraulo et al., 1999)。此
外, 褪黑激素还可以激发其他一些抗氧化酶的
活性 , 如谷胱甘肽过氧化物酶和还原酶
(Barlow-Walden et al.,1995; Pablos et al.,
1998)。所以, 褪黑激素对细胞的保护作用机
制是十分复杂的。但是有关褪黑激素与多
胺代谢的关系还少有报道。我们的实验表
明, 外源褪黑激素可以提高烟草悬浮细胞精
氨酸脱羧酶的活性, 其详细的调节机制还有
待深入探讨。推测在低温胁迫下褪黑激素
通过激活多胺合成酶基因的表达, 使细胞内
多胺的含量增加, 从而起到对生物膜和生物
大分子的保护作用。
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