全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-/001-#""",$"!-!"#$-"&-#()
收稿日期$
!"#%,#!,!%
&修改稿收到日期$
!"#$,"),#&
基金项目$云南省农业生物技术重点实验室开放项目"
!"#%,"%
#&国家自然科学基金"
%"$)""#)
#&云南省烟草公司科技计划"
!"##23#"
#
作者简介$柯
!
学"
#(++*
#!男!博士!助理研究员!主要从事农作物逆境分子生理研究
4,56/7
$
89,:;9
!
<=>56/7-?=5
"
通信作者$龚
!
明!教授!博士生导师!主要从事植物逆境生物学研究
4,56/7
$
@/=?<95%#!
!
#)%-?=5
一氧化氮对盐胁迫下烟草细胞
渗透调节能力的影响
柯
!
学#!!程在全#!李军营%!马文广%!龚
!
明!"
"
#
云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所!云南省农业生物技术重点实验室!农业部西南作物基因资源与种质创制重点
实验室!昆明
)"!!%
&
!
云南师范大学 生命科学学院!云南省生物质能与环境生物技术重点实验室!生物能源持续开发利用教育
部工程研究中心!昆明
)""(!
&
%
云南省烟草农业科学研究院!云南玉溪
)%#""
#
摘
!
要$一氧化氮"
3A
#作为信号分子广泛参与植物的生长发育(逆境胁迫响应过程为了明确
3A
对细胞渗透调
节作用!该研究以
36B7
为盐胁迫因子!以烟草悬浮细胞为材料!研究了
3A
对盐胁迫下细胞渗透调节能力的影响
结果显示$"
#
#
36B7
胁迫能诱发烟草细胞内源
3A
的生成!且
#""55=7
)
C
*#
36B7
诱发了细胞内源
3A
的快速产
生!在
#<
达到峰值!
3A
产生量约为对照的
!
倍!之后
3A
产生量快速下降!直至
%<
才逐渐回升!并在
$&<
内维持
在较高水平"
!
#外源
3A
显著增强了烟草细胞的抗渗透胁迫能力!且
#"
"
5=7
)
C
*#
3A
供体硝普钠"
D3E
#处理
显著提高了
36B7
胁迫下细胞的活力和再生能力"提高幅度分别为
+&-)F
和
)%-!F
#!降低了细胞死亡率"降幅约
为
$&-F
#&
D3E
处理下的
36B7
胁迫细胞能更大程度降低渗透势!延缓水势的降低!维持细胞压力势"
%
#外源
3A
显著促进了
36B7
胁迫细胞中脯氨酸的合成和积累!且
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
处理将
36B7
胁迫细胞中的脯氨酸
含量提高
!-(F
&
D3E
处理也影响了脯氨酸代谢关键酶的活性和基因表达水平!即提高了谷氨酸脱氢酶"
GHI
#(
精氨酸酶和鸟氨酸转氨酶"
AJK
#的活性!降低了脯氨酸脱氢酶"
EHI
#的活性!同时使
!"#
(
$%&
和
"#
基因的
表达表现出与酶活性相似的变化趋势研究表明!
3A
参与了盐胁迫下烟草细胞的渗透调节!通过调控脯氨酸代谢
可能是
3A
参与渗透调节的重要机制
关键词$一氧化氮&渗透调节&脯氨酸&烟草悬浮细胞&耐渗透性
中图分类号$
L($-+&
文献标志码$
J
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0
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Z
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!
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Y=7/19
&
>=@6??=0;0
Z
910/=1?970
&
=05=>/?>=79Y61?9
!!
盐害对植物细胞的伤害首先体现在渗透胁
迫*#+!植物为此进化出的策略包括$合成脯氨酸和甜
菜碱等渗透调节物质&增强抗氧化酶活性&启动信号
调控途径!如
JWJ
诱导的脯氨酸积累途径&表达特
定蛋白!如水孔蛋白和胚胎发育晚期富集蛋白"
76>9
95@Y
S
=
T
9190/06@;1[61>
!
C96
#
*
!,$
+
这些对渗透胁
迫的响应与适应机制依赖于植物信号分子的功能!
一氧化氮"
1/>Y/?=:/[9
!
3A
#就是其中之一!它作为
植物信号分子广泛参与植物生长发育调控(生物和
非生物逆境胁迫响应过程*,)+尽管最近在藻类中
发现类似一氧化氮合酶"
1/>Y/?=:/[90
S
1><609
!
3AD
#的
H3J
序列信息!但植物中的
3AD
还未得
到证实*++!
3A
在植物中的研究瓶颈有待突破!但这
并不妨碍人们对它各种生物学功能的关注度
前人的研究间接地证明了渗透胁迫与
3A
有
关*&+例如!在盐和干旱导致的渗透胁迫条件下!外
源
3A
能诱导气孔关闭!增加小麦相对含水量和
C96
蛋白积累*(+&提高芦苇质膜
I
c
,JKE
酶活
性*#"+!以及大豆中抗坏血酸过氧化物酶"
JEN
#(谷
胱甘肽过氧化物酶"
GEN
#和过氧化氢酶"
BJK
#的
活性!从而减少丙二醛"
UHJ
#和
I
!
A
!
含量*##+&增
强胡椒中超氧化物歧化酶"
DAH
#和过氧化物酶
"
EAH
#的活性!减少脂质过氧化*#!+&增加谷胱甘肽
"
G0I
#(抗坏血酸"
J0J
#含量!缓解
36B7
对黄瓜下
胚轴和胚根生长的抑制*#%+上述这些实验基本只
是阐明
3A
在渗透胁迫中的抗氧化功能!但
3A
是
否能真正对植物细胞的渗透调节产生影响则缺乏直
接证据虽然在烟草中已检测到内源
3A
的产生和
3AD
活性!但
3A
参与细胞渗透调节的机制仍然不
完全清楚*#$+
植物细胞在渗透胁迫条件下会产生大量的渗透
调节物质!如甘露醇(盐和干旱胁迫促使水稻*#+(菊
苣*#)+和柽柳*#++中合成大量渗透调节物质!特别是脯
氨酸已有实验表明
3A
与脯氨酸代谢有关!如
3A
供体硝普钠"
D3E
#诱导脯氨酸在苜蓿中的积累
是由于
#
#
,
吡咯琳
,
羧酸合成酶"
#
#
,
ZS
YY=7/19,,
?6Y@=:
S
76>90
S
1><9>609
!
EBD
#活性提高所致*#&+&干
旱诱导了水稻内源
3A
和脯氨酸的积累*#(+&在冷(
冰冻进程中!
3A
通过提高香蕉和拟南芥中
EBD
活性!降低脯氨酸脱氢酶"
Z
Y=7/19[9<
S
[Y=
T
91609
!
EHI
#的活性来影响脯氨酸的积累*!",!#+&在
36B7
胁
迫下!卷心菜(黄瓜中脯氨酸的积累是
EHI
活性受
抑制!而
EBD
和鸟氨酸转氨酶"
=Y1/>=>Y610\9Y609
!
AJK
#活性受激活的结果*!!,!%+然而!
先前关于渗透胁迫下
3A
诱导脯氨酸积累机制的研
究!基本仅集中在
D3E
对脯氨酸代谢途径中
EBD
和
EHI
两个酶的影响上!缺乏系统性研究众所
周知!高等植物中脯氨酸代谢受

个关键酶的控制!
有两条合成途径和一条降解途径合成途径中一条
是由 谷 氨 酸 脱 氢 酶 "
T
7;>656>9[9<
S
[Y=
T
91609
!
GHI
#和
EBD
调控的谷氨酸途径!另一条是由精
氨酸酶和
AJK
调控的鸟氨酸途径!降解途径由
+(#
&
期
!!!!!!!!!!!
柯
!
学!等$一氧化氮对盐胁迫下烟草细胞渗透调节能力的影响
EHI
调控*!$,!+另外!由于导致渗透胁迫的环境因
素复杂多样(难于控制!给研究工作带来了困难!因
此!
3A
对脯氨酸代谢的影响效应及调控机制需要
系统研究
本研究以
36B7
为胁迫因子!对
36B7
胁迫下
3A
参与的烟草细胞渗透调节及其可能机制进行了
初探!试图探明
3A
是否参与渗透胁迫!
3A
是否影
响细胞的渗透调节能力!以及
3A
对脯氨酸积累的
影响效应
#
!
材料和方法
<-<
!
材料培养
烟草"
,(-+.(/)/.+0/-12 C-
#悬浮细胞的培养
参见李忠光等*!)+的方法!生长
#!
周的烟草植株取
茎髓于
UD
培养基上暗培养
$
周!取白色疏松愈伤
组织进行暗条件悬浮培养"
!d
!
##"Y
%
5/1
#!
+[
后继代!继代后培养
$[
的细胞用于实验
<-=
!
材料处理
利用
36B7
作渗透胁迫因子!利用
3A
释放剂
D3E
和
3A
清除剂
?EKQA
"
!,
"
$,?6Y@=:
SZ
<91
S
7
#
,$
!
$
!

!
,>9>Y6,59><
S
7/5/[6a=7/19,#,=:
S
7,%,=:/[9
#调节
细胞外源
3A
的含量依据
36B7
对细胞活力(细
胞死亡率和细胞再生能力
%
个生理指标的影响程度
来确定它的使用浓度!以
D3E
和
?EKQA
对细胞活
力的影响程度确定
3A
释放剂和清除剂的使用浓
度上述
%
个生理指标以相对百分率表示!即处理
细胞的测定值与未加任何药品的培养细胞测定值之
比根据
+[
的继代周期!继代后需培养
$[
增加细
胞数量!
36B7
胁迫时间确定为
$&<
细胞经不同浓
度
36B7
"
)"
(
&"
(
#""
(
#!"
(
#$"55=7
)
C
*#
#处理
$&
<
!发现
#""55=7
)
C
*#
36B7
处理下细胞的上述
%
个生理指标约为对照的
"F
!相当于,半致死剂
量-!因此确定
36B7
的胁迫浓度为
#""55=7
)
C
*#
在此胁迫条件下!不同浓度的
D3E
"
"
(
"
(
#""
(
#"
(
!""
(
%""
"
5=7
)
C
*#
#和
?EKQA
"(
!"
(
$"
(
)"
(
&"
(
#""
"
5=7
)
C
*#
#对细胞活力有影响!
#"
"
5=7
)
C
*#的
D3E
能使细胞活力得到很好的恢复!
&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
能基本消除
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
对细胞活力的影响!因此在后续实验中确定
D3E
的使用浓度为
#"
"
5=7
)
C
*#
!
?EKQA
的使用
浓度为
&"
"
5=7
)
C
*#

后续试验处理共包括对照(
36B7
处理(
D3E
处
理(
36B7cD3E
处理(
36B7cD3Ec?EKQA
处理共

类处理方法为$向悬浮培养基中加入
36B7
进行
渗透胁迫处理&
D3E
和
?EKQA
于渗透胁迫处理前
#5/1
加入悬浮培养基!同时向对照样品中加入相
等体积或重量的液体培养基收集各处理下不同时
间点的悬浮培养细胞进行过滤清洗后用于实验
<->
!
测定指标及方法
?<
!
细胞
*,
含量
!
烟草细胞经
#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫
"
$
$&<
后!参照
E761?<9>
等*!++的方
法采用
3A
荧光探针
HJb,!HJ
"
\7;=Y=,
Z
<=Y9$
!
,
[/65/1=\7;=Y90?9/1,![/6?9>6>9
#!以及
e/>9?98
等*!&+
的方法采用改进的重氮化法"
GY/900
#测定细胞
3A
含量
!
#
"荧光法
!
收集胁迫处理的细胞
"-#
T
与
#"
"
5=7
)
C
*#
HJb,!HJ
温浴
#5/1
后!于荧光分光
光度计"
_b,%""EB
&
D!
M
S
=>=
!
R6
Z
61
#上测
定荧光强度!以未加
HJb,!HJ
染料的细胞样品的
荧光强度作为背景值!削除背景值的荧光强度代表
细胞内的
3A
含量
!"重氮化法
!
参照
e/>9?98
等*!&+的方法自制
装置!测定细胞培养气相中的
3A
气泵将细胞悬
浮培养三角瓶内的湿润空气以
$"5C
)
5/1
*#的流
速泵入第一个试管!与其中的
GY/900
试剂反应除去
气相中的
I3A
!
!气流继续通过装载强氧化剂
BYA
%
的玻璃柱!气相中的
3A
被全部氧化成
3A
!
!
3A
!
在流经第二个试管时被其中的
GY/900
试剂吸收!测
定第二个试管中
GY/900
试剂的吸光度
AH
$"
值!根
据制作的
3A
!
标准曲线换算成
3A
含量此方法
可通过更换新的
GY/900
试剂进行连续测定
<->-=
!
细胞耐渗透胁迫能力
!
通过测定经
#""
55=7
)
C
*#
36B7
胁迫及
D3E
和
?EKQA
预处理后
36B7
胁迫
$&<
的烟草细胞活力(死亡率和再生能
力来考察其耐渗透胁迫能力其中!细胞活力的测
定参照
D>9
Z
=18;0
等*!(+的方法采用
KKB
"
!
!
%
!
,
KY/,
Z
<91
S
7>9>Y6a=7/;5?<7=Y/[9
#染色测定&细胞死
亡率参照
26565=>=
等*%"+的方法采用
4]61
.
0
染色
测定&细胞再生能力采用
Q0等*%#+的方法略
作修改!胁迫处理的细胞用
UD
液体培养基清洗

次后于
UD
固体培养基上生长!培养
+[
后收集细
胞称鲜重细胞的活力(死亡率和再生能力
%
个指
标最终均表示为对照样品的百分比
<->->
!
细胞水势(渗透势和压力势
!
细胞水势
"
!
^
#用露点水势测定仪"
E0
SZ
Y=H9^ E=/1>U/?Y=,
]=7>,59>9Y
!
V90?=Y
!
D`J
#测定!收集处理后的新鲜
细胞迅速置于样品室"
B,!
!
V90?=Y
!
D`J
#!平衡
%"
5/1
后读取记录数值细胞渗透势"
!
0
#用渗透仪
&(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"bU,(R
!上海医科大学!中国#测定!收集处理后的
新鲜细胞研磨后离心!取上清测定渗透势细胞压
力势"
!
Z
#由公式
!
^
f
!
0
c
!
Z
计算得出
<->-@
!
脯氨酸含量和酶活性
!
脯氨酸含量和酶活
性均采用分光光度法测定!其中胞内脯氨酸含量的
测定按照
W6>90
等*%!+的方法!
GHI
活性测定按照
_=@/10=1
等*%%+的方法!
EBD
活性测定采用
G6Y?/6,
_/=0
等*%$+的方法!精氨酸酶的活性 测 定 按 照
J76@6[g
等*%+的方法!对于
AJK
!其酶提取按
C;>>0
等*%)+的方法!其活性测定按
B<6Y90>
等*%++的方法!
EHI
的活性测定按
Dh1?<9a
等*%&+的方法其中涉
及的蛋白质含量测定按照
WY6[\=Y[
*
%(
+的方法
?A
!
B4CD6B
!
按照试剂盒说明书进行细胞总
_3J
提取"
K_QOAC
!
Q1]/>Y=
T
91
#和
_K,EB_
"
EB_
M/>
"
JUe
#
e9Y-%-"
!
K6M6_6
#
EB_
程序为$首先
($d5/1
!接着
($d%"0
!
"d
"
!"#
#*
$d
"
$%&
#!
!d
"
"#
#!
d
"
%3&4,
#+
%"0
!
+!d
#5/1
!循环
%"
次!之后
+!d5/1
并保持于
#
d

EB_
产物琼脂糖凝胶电泳后其条带亮度用
L;61>/>
S
A19
软件"
W/=,_6[
#分析!条带相对强度
"
Y6>/==\@61[/1>910/>
S
!
_WQ
#为
!"#
(
$%&
和
"#
与
%3&4,
的比值引物设计见表
#

!
!
结果与分析
=?<
!
*362
胁迫对烟草细胞内
*,
产生的影响
为了证实
36B7
胁迫中是否有
3A
的参与!试
验分别用荧光法和改良重氮化法检测了烟草胞内
3A
产生情况图
#
中的荧光强度和
3A
含量均显
示!
36B7
胁迫能诱导烟草细胞内
3A
的快速产生!
并在
%<
内有一个明显的产生峰!在
#<
峰值处
3A
的荧光强度"图
#
!
J
#和含量"图
#
!
W
#分别是对照的
#-(
和
!-
倍&在
36B7
胁迫条件下!
%<
后细胞
3A
产生量持续上升!直到
$&<
都维持在一个较高水
平!而对照则无显著变化可见!
36B7
胁迫诱导了
表
<
!
基因及所用引物信息
K6@79#
!
G919061[><9
Z
Y/59Y0;09[/1_K,EB_
基因
G919
引物序列
EY/59Y
产物大小
KY610?Y/
Z
>
!"#
i,KGJJKGBBKKJGBJBJGB,%i
i,GBJJBJJKBKKBBBJBBK,%i
$)%@
Z
$%&
i,JGGBKBJJJBGBKBJBKB,%i
i,BJJGGGBJJBJGBJKBKB,%i
%%)@
Z
"#
i,KKKKJBGGBGKKBBKJBB,%i
i,KKBBBJKBKBJGBJJJKBJB,%i
$%!@
Z
%3&4,
i,BGJKKGJJBJBGGBJKJG,%i
i,JBBKBJGGJBJGBGGJJB,%i
!$@
Z
烟草细胞内源
3A
的产生
=?=
!
7*D
对烟草细胞耐渗透胁迫能力的影响
36B7
的胁迫强度是依据不同浓度
36B7
对烟
草细胞的细胞活力(细胞死亡率和细胞再生能力的
影响确定的如图
!
!
J
显示!
)"
$
#$"55=7
)
C
*#
36B7
处理烟草细胞
$&<
后!随着
36B7
浓度的增
加!细胞活力"以
KKB
还原力表示#和细胞再生能
力逐渐降低!细胞死亡率逐渐上升在
#""55=7
)
C
*#
36B7
处理下!上述
%
个生理指标的值均约为对
照的
"F
!
#""55=7
)
C
*#
36B7
相当于,半致死剂
量-!是一个较合适的处理剂量因此!后续实验使
用
#""55=7
)
C
*#的
36B7
作为胁迫强度!研究
D3E
(
图
#
!
#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫诱导的
烟草细胞
3A
产生的动态变化
J-
荧光法检测!
3A
荧光探针
HJb,!HJ
使用浓度为
#"
"
5=7
)
C
*#
!箭头显示
"
$
%<
内荧光强度的变化&
W-
修改的重氮化法检测!箭头显示
"
$
)<
内
3A
含量的
变化&图中数值代表均值
j
标准差!
1
#
)
&下同
b/
T
-#
!
K/59?=;Y090=\3A/1>=@6??=?;7>;Y9[
?970/1[;?9[@
S
#""55=7
)
C
*#
36B70>Y900
J-K<9?<61
T
9=\3A5960;Y9[@
S
#"
"
5=7
)
C
*#
3A0910/>/]9
[9>9?>=YHJb,!HJ
!
61[><96YY=^ 0<=^ 0><9?<61
T
9 /^>=
%<
&
W-K<9?<61
T
9=\3A[9>9?>9[@
S
5=[/\/9[GY/90059><=[
!
61[><96YY=^ 0<=^ 0><9?<61
T
9 /^>=)<-46?<@6Y
Y9
Z
Y9091>059610jD4=\6>7960>0/:5960;Y9591>0
/1>^ =/1[9
Z
91[91>9:
Z
9Y/591>0
&
K<9065960@97=^
((#
&
期
!!!!!!!!!!!
柯
!
学!等$一氧化氮对盐胁迫下烟草细胞渗透调节能力的影响
?EKQA
及其复合处理的效应"图
!
!
W
$
H
#在此胁
迫强度下!
"
$
!""
"
5=7
)
C
*#
3A
供体
D3E
均能
显著提高烟草细胞的细胞活力!并以
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
效果最好!并显著高于其余处理"图
!
!
W
#&
此时!细胞活力和再生能力分别比对照显著增加
+&-)F
和
)%-!F
!细胞死亡率降低
$&-F
"图
!
!
H
#&
"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
能显著消除
D3E
的效应
"图
!
!
B
#!使
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
预处理的细胞活
力(再生能力(细胞死亡率均与对照无显著差异"图
!
!
H
#基于以上原因!在后续实验中!
D3E
的使用
浓度确定为
#"
"
5=7
)
C
*#
!
?EKQA
的使用浓度确
定为
&"
"
5=7
)
C
*#
实验结果显示!外源
3A
能够
提高盐胁迫下烟草细胞的细胞活力(细胞再生能力!
降低细胞死亡率!这表明外源
3A
有助于提高烟草
细胞的耐渗透胁迫能力
=?>
!
7*D
对细胞渗透调节的影响
水势(渗透势和压力势是度量细胞渗透调节的
%
个重要生理指标!为了证实
3A
是否影响烟草细
胞的渗透调节能力!我们对
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
预
处理细胞的水势(渗透势和压力势进行测定!结果如
图
%
所示在正常培养条件下!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
处理能使烟草细胞的水势和渗透势降低!而压
力势基本维持不变!处理时间与细胞水势"
5
! 为
"-(%(&
#和渗透势"
5
! 为
"-($$%
#的变化呈明显正
相关!与压力势"
5
! 为
"-!!#!
#的变化无明显相关
性"图
%
!
J
$
B
#这说明外源
3A
能影响烟草细胞
的渗透调节在
#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫下!细
胞水势(渗透势和压力势均随胁迫时间的延长逐渐
降低!而
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
预处理的细胞在胁迫
#!<
以后比
36B7
胁迫细胞渗透势有更大幅度的降
图
!
!
D3E
和
?EKQA
预处理对
#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫
$&<
后烟草细胞活力(死亡率和再生能力的影响
相对百分率为各处理样品与对照样品的百分比!细胞活力以
KKB
还原力表示&
J-
不同浓度
36B7
处理&
W-
不同浓度
D3E
预处理&
B-
不同浓度
?EKQA
和
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
处理!
"i
表示无
D3E
处理"
#""55=7
)
C
*#
36B7
单独处理#&
H-#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
和
&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
处理$
%
-36B7
&
&
-36B7cD3E
&

-36B7cD3Ec?EKQA

"
或不同字母标识表示处理与对照相比差异显著"

$
"-"
#
b/
T
-!
!
4\\9?>0=\D3E61[?EKQA
Z
Y9>Y96>591>=1><9]/>67/>
S
!
[96><61[Y9
T
Y=^><=>=@6??=?970;1[9Y#""55=7
)
C
*#
36B70>Y900\=Y$&<
_976>/]9
Z
9Y?91>6
T
9 6^0><9Y6>/==\]67;90=\>Y96>591>065
Z
79>=?=1>Y=7065
Z
79
"
><9]67;960#""F
#
-K<9]/>67/>
S
=\?9700<=^ 9[
60KKB
"
!
!
%
!
,KY/
Z
<91
S
7>9>Y6a=7/;5?<7=Y/[9
#
Y9[;?>/=1
&
J-4\\9?>0=\36B7
&
W-4\\9?>0=\3A[=1=Y0=[/;51/>Y=
Z
Y;00/[9
"
D3E
#&
B-4\\9?>0=\3A0?6]91
T
/1
T
6
T
91>?EKQA
"
!,
"
$,?6Y@=:
SZ
<91
S
7
#
,$
!
$
!

!
,>9>Y6,59><
S
7/5/[6a=7/19,#,=:
S
7,%,=:/[9
#
/1#"
"
5=7
)
C
*#
D3E>Y96>591>?970
!
"i59610>Y96>591> /^><=;>D3E
"
#""55=7
)
C
*#
36B7=17
S
#&
H-4\\9?>0=\#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
61[&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
$
%
-36B7
&
&
-36B7cD3E
&

-36B7cD3Ec?EKQA
&
"
=Y[/\\9Y91>79>>9Y0/1[/?6>9
0/
T
1/\/?61>[/\\9Y91?9@9>^991>Y96>591>061[><9?=1>Y=7
"

$
"-"
#
"")#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
和
&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
对烟草细胞水势(渗透势和压力势的影响
J
$
B-
正常培养&
H
$
b-#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫
b/
T
-%
!
4\\9?>0=\#"
"
5=7
)
C
*#
D3E61[&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
Z
Y9>Y96>591>0=1 6^>9Y
Z
=>91>/67
!
0=7;>9
Z
=>91>/6761[
Z
Y900;Y9
Z
=>91>/67=\>=@6??=?;7>;Y9[?970
V6>9Y
Z
=>91>/67
"
!
^
!
J61[H
#!
0=7;>9
Z
=>91>/67
"
!
0
!
W61[4
#
61[
Z
Y900;Y9
Z
=>91>/67
"
!
Z
!
B61[b
#
=\>=@6??=?;7>;Y9[
?970;1[9Y1=Y567?;7>;Y9?=1[/>/=1
"
79\>
Z
6Y>=\><9\/
T
;Y9
#
61[#""55=7
)
C
*#
36B70>Y900
"
Y/
T
<>
Z
6Y>=\><9\/
T
;Y9
#
低!延缓了水势降低!压力势得到了保持&
D3E
影响
烟草细胞渗透调节的效应能被
&"
"
5=7
)
C
*#
?E,
KQA
消除"图
%
!
H
$
b
#实验表明!外源
3A
能提
高烟草细胞在盐胁迫下的渗透调节能力
=?@
!
7*D
对细胞脯氨酸积累的影响
脯氨酸是重要的渗透调节物质!基于
D3E
能影
响烟草细胞的渗透调节!我们对胞内脯氨酸含量进
行了测定结果显示!正常培养条件下!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
促使烟草细胞渗透势的降低与胞内脯氨酸
浓度增加呈正相关"
5
! 为
"-(&"%
#"图
$
!
J
#在
36B7
胁迫下!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
预处理能显著提
高烟草细胞脯氨酸积累量!
$&<
时较未经
D3E
处理
的
36B7
胁迫细胞高出
!-(F

?EKQA
能消除
D3E
对细胞脯氨酸积累的增强效应"图
$
!
W
#以上
结果说明!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
预处理诱导了烟草
细胞内脯氨酸的积累!这和细胞渗透势的降低密切
相关!即增加胞内脯氨酸的积累是
3A
参与烟草细
胞渗透调节的重要途径
=?A
!
7*D
对脯氨酸代谢关键酶活性的影响
脯氨酸代谢受控于

个关键酶!即
GHI
(
EBD
(
精氨酸酶(
AJK
和
EHI
*
!$
+
对于谷氨酸合成途径
中的两个关键酶"
GHI
和
EBD
#!在
36B7
胁迫下!
GHI
活性快速上升!
(<
达到峰值&
D3E
预处理能
显著提高
GHI
活性!
(<
时较未经
D3E
处理的受
胁迫细胞高
!"-F
&
?EKQA
对
D3E
诱导的
GHI
活
性有抑制作用"图

!
J
#同时!
36B7
胁迫促使
EBD
活性的增加!但
D3E
和
?EKQA
预处理对其活
性没有显著影响"

%
"-"
#"图

!
W
#对于鸟氨酸
合成途径中的两个关键酶"精氨酸酶和
AJK
#活性
都能被
36B7
和
D3E
诱导!但在
"
$
#!<
内变化不
显著!特别是
AJK
活性&但
#!<
后!两个酶的活性
大幅上升!在
$&<
时精氨酸酶和
AJK
活性较未经
D3E
处理的受胁迫细胞分别高出
%#-&F
和
#-(F
&
36B7
胁迫下受
D3E
增强的这两个酶的活性能被
?EKQA
消除"图

!
B
(
H
#另外!对于脯氨酸降解途
径的关键酶"
EHI
#!
36B7
胁迫下
EHI
的活性在
"
#")#
&
期
!!!!!!!!!!!
柯
!
学!等$一氧化氮对盐胁迫下烟草细胞渗透调节能力的影响
$#!<
内有一个小幅上升的过程!但在
#!
$
$&<
一
直呈下降的趋势&值得注意的是!
D3E
处理的未胁
迫细胞的
EHI
活性在
"
$
$&<
内均呈下降趋势&
36B7
胁迫下受
D3E
加强的
EHI
活性降低也能够
被
?EKQA
消除"图

!
4
#以上结果说明!外源
3A
影响了烟草细胞脯氨酸代谢关键酶活性!除了
EBD
外!总体上是提高合成酶活性!抑制降解酶活
性&并且从被激活的酶活时序变化看!外源
3A
先后
激活了谷氨酸合成途径和鸟氨酸合成途径!
3A
通
过对脯氨酸代谢酶活性的影响!进而促进盐胁迫下
烟草细胞中脯氨酸的积累
=?E
!
7*D
对脯氨酸代谢关键酶基因表达的影响
基于
D3E
对脯氨酸代谢关键酶活性的影响!为
了进一步明确
D3E
是否对酶基因表达有影响!我们
作了
_K,EB_
分析!结果如图
)
所示在
36B7
胁
迫下!
"#
的表达量在胁迫前期高后期低!
$%&
的
图
$
!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
和
&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
对
烟草细胞脯氨酸积累的影响
J-
正常培养条件&
W-#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫条件
b/
T
-$
!
4\\9?>=\#"
"
5=7
)
C
*#
D3E61[&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
Z
Y9>Y96>591>=1
Z
Y=7/196??;5;76>/=1=\>=@6??=
?970;1[9Y1=Y567?;7>;Y9?=1[/>/=161[
#""55=7
)
C
*#
36B70>Y900
J-K<9
Z
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Z
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Z
Y=7/196??;5;76>/=1;1[9Y1=Y567?;7>;Y9
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"
5=7
)
C
*#
?EKQA
Z
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Z
Y=7/196??;5;76>/=1/1?970;1[9Y
#""55=7
)
C
*#
36B70>Y900
图

!
#"55=7
)
C
*#
D3E
和
&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
对
#""55=7
)
C
*#
36B7
胁迫下烟草
细胞脯氨酸代谢关键酶活性的影响
GHI-
谷氨酸脱氢酶&
EBD-
吡咯啉
,,
羧酸合成酶&
AJK-
鸟氨酸转氨酶&
EHI-
脯氨酸脱氢酶
b/
T
-
!
4\\9?>0=\#"55=7
)
C
*#
D3E61[&"
"
5=7
)
C
*#
?EKQA
Z
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S
=Z
Y=7/1959>6@=7/?
91a
S
590/1>=@6??=?;7>;Y9[?970;1[9Y#""
55=7
)
C
*#
36B70>Y900
GHI-G7;>656>9[9<
S
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T
91609
&
EBD-
#
#
,
ZS
YY=7/19,,
?6Y@=:
S
76>90
S
1><9>609
&
AJK-=Y1/>Y610\9Y609
&
EHI-EY=7/19[9<
S
[Y=
T
91609
!")#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
)
!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
和
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C
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对烟草细胞
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(
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和
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基因表达的影响
左边部分为
$
个基因"包括
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基因#在正常培养条件和
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)
C
*#
36B7
胁迫条件下的表达产物
U-U6Y89Y
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(
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处理时间"
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预处理
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和
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预处理
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右边部分为
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电泳条带相对亮度"
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和
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产物亮度的比值
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表达量前期低后期高!
"#
的表达量呈下降趋势!
这与它们的酶活性变化趋势相吻合"图

!
J
(
H
(
4
#
D3E
预处理对脯氨酸代谢关键酶的基因表达有影
响!增强受胁迫细胞
!"#
和
$%&
的表达量!减少
"#
的表达量!而
?EKQA
能抑制
D3E
对这
%
个基
因表达的影响效应实验结果表明!外源
3A
对脯
氨酸积累的影响是通过调控脯氨酸代谢关键酶活性
及基因表达实现的
%
!
讨
!
论
>?<
!
盐胁迫下烟草细胞内源
*,
的产生特征
作为信号分子!应具备在需要时能迅速产生!在
不需要时能迅速清除的特性!从而起到信号传递的
作用
3A
的
%
个生化特性恰好满足作为信号分子
的条件!一是产生途径的多样性!有酶催化途径和非
酶途径&二是半衰期小于
)0
!其直接作用的范围仅
限于产生细胞及邻近部位*$"+&三是高反应活性!由
于有
#
个未配对电子!易与其它物质发生氧化反应
形成氮氧化物!因此!
3A
又可间接地以氮氧化物形
式作用于
H3J
(蛋白质和脂膜*$#+本实验结果显
示!在
36B7
胁迫早期烟草细胞有一小的
3A
产生
峰!约为正常培养细胞的
!
倍&随着胁迫时间的延
长!出现第二个产生峰!一直到
$&<
都保持较高水
平"图
#
#这与已有文献报道的不同植物在不同逆
境胁迫下
3A
的产生时间从几分钟到几小时*$!+!甚
至数小时*$%+的结果相吻合这反映在不同环境刺
激下!
3A
的产生表现出时序多样性特征!通过这种
多样性特征使植物体能识别不同的环境信号!进而
采取相应的策略
植物中
3A
的来源可以分为两类!精氨酸依赖
途径和亚硝酸依赖途径*$$,$+两类途径存在多条途
径!多种调控酶!甚至无酶催化!因此
3A
在植物中
的产生方式远比动物中复杂得多在精氨酸依赖途
径中!至今还未分离到植物的
3AD
*
+
+
而且近年来
的研究又发现!在精氨酸依赖途径中!很可能还存在
一条多胺途径*&+例如!精胺(亚精胺能诱导拟南芥
幼苗迅速产生
3A
!合成部位在根尖的伸长区和初
生叶!特别是叶脉和毛状体上!腐胺对
3A
产生的影
响很小*$)+&而另外的实验结果表明腐胺能诱导南洋
杉胚性细胞
3A
的合成!对悬浮细胞影响很小&不管
是胚性细胞还是悬浮细胞!精胺和亚精胺均抑制
3A
的生成*$++本实验中虽然证实了
36B7
胁迫下
能诱导烟草细胞内源性
3A
的产生!但未对其中可
能的途径和机制做进一步的研究前人的研究表
%")#
&
期
!!!!!!!!!!!
柯
!
学!等$一氧化氮对盐胁迫下烟草细胞渗透调节能力的影响
明!烟草叶肉细胞经高渗及盐胁迫处理诱发了
3A
生成*$&+!植物抗盐性的形成与
3A
合酶
3AD
有
关*$(+!由此推测精氨酸依赖途径中的
3AD
催化途
径可能是盐胁迫下
3A
产生的重要机制但
3A
的
产生可能是一个多途径的结果!只是在某种条件下
某一途径占优势大多数情况下!
3AD
活性主要与
抗病反应相关!亚硝酸依赖途径主要与非生物胁迫
相关!但亚硝酸依赖途径中的硝酸还原酶活性有时
也会与抗病反应相关因此!要弄清楚盐胁迫下
3A
的产生机制还有待系统性的研究
3A
具有双重作用*"+!少量对植物起信号分子
的作用!过量则有毒害作用本实验结果显示
36B7
胁迫下烟草细胞内源
3A
的产生呈现,双峰-模式
这一现象与早先本实验室关于
B[
!c 胁迫诱导的
I
!
A
!
产生模式相类似*#+
I
!
A
!
产生的,双峰-模
式已被公认!但在植物中
3A
的产生是否具有典型
的,双峰-模式还未见报道!这可能与先前研究中所
关注的
3A
产生要么是短时间跨度!要么是长时间
跨度有关!本实验结果还需要进一步证实我们推
测第一个产生峰可能与
3A
的信号功能有关!第二
个产生峰可能代表随着
36B7
胁迫时间延长产生氧
化胁迫而导致的
3A
积累!两个产生峰可看作是
3A
双重作用的具体体现
>?=
!
外源
*,
对烟草细胞渗透胁迫伤害的缓解
作用
由于至今未分离到植物源
3AD
!生物样品中
3A
的检测也较为困难!对植物
3A
功能的研究主
要通过外施
3A
的手段*++!
D3E
常作为外源
3A
的
良好释放剂*!+植物中
3A
有促进生长和抗衰老
的作用!还能影响离子转运!如阻断细胞外向
M
c通
道*%+!加强
b9
向叶绿体的转运!合成叶绿素
&
!削
除玉米
b9
缺乏症但是在高浓度的
b9
离子胁迫
下!
3A
通过调控转铁蛋白使
b9
区域化在线粒体和
液泡中!以此来减轻
b9
积累带来的氧化胁迫*$+
本研究结果显示!
D3E
预处理能显著提高烟草细胞
活力和再生能力!降低细胞死亡率!缓解由
36B7
导
致的胁迫伤害!
D3E
的这种影响效应能被
3A
专一
清除剂
?EKQA
清除"图
!
#!这表明外源
3A
能增加
细胞的渗透胁迫耐性!结果与前人报道的
3A
能减
轻盐胁迫对植物的氧化性损伤结果相吻合*#"+
D3E
一方面具有很好的抗氧化功能!在逆境胁迫下
能提高植物体内的抗氧酶活性*##,#!+!增加体内的抗
氧化剂含量*#%+!从而增强细胞的抗氧化能力&另一
方面!在本实验中!
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E
显著影响了
烟草细胞的渗透势和水势!表明
D3E
确实参与了盐
胁迫导致的细胞渗透调节!这与我们之前的实验结
果相一致*+
D3E
处理导致了细胞更低的渗透势!
缓解细胞水势降低!这有利于细胞的膨压得到一定
程度的保持以减轻渗透胁迫引发的质壁分离"图
%
#这表明烟草细胞的渗透胁迫耐性与其渗透调节
能力的增强有关
>?>
!
渗透胁迫下
*,
对细胞脯氨酸代谢的调控
脯氨酸在植物细胞中是一个主要的渗透调节物
质它一方面能够防止细胞失水!保持膨压&另一方
面能在蛋白质周围形成水化层!防止功能蛋白的氧
化降解&此外在胁迫条件下也作为底物供给氮代谢
多个研究表明脯氨酸参与植物渗透胁迫响应!而
3A
对脯氨酸代谢有调控作用*),&+!本实验结果与
之一致但在
N/=1
T
等*#(+的实验中!虽然干旱诱导
了水稻内源
3A
和脯氨酸的积累!但
D3E
和
?EKQA
处理不会影响脯氨酸积累!实验未证明
3A
与脯氨
酸积累的必然性联系!但这也有可能是他们在进行
D3E
和
?EKQA
处理时采取叶面喷施的方式!叶片的
吸收效率影响了药剂功效的发挥&
Ck
Z
9a,?6YY/k1
等*!!+也报道
D3E
和
36B7
处理导致蕃茄叶片脯氨
酸含量的减少而本实验结果表明!
D3E
处理能使
烟草细胞增加
!"F
的脯氨酸积累!同时
?EKQA
能清
除
D3E
的作用"图
$
#!与上述报道不一致这有可
能是
D3E
处理浓度不同所致!
Ck
Z
9a,?6YY/k1
等*!!+
的
D3E
使用浓度"
!"
$
#"""
"
5=7
)
C
*#
#远高于
本实验!事实上!本实验中的
!""
$
%""
"
5=7
)
C
*#
D3E
对烟草细胞活力"图
!
!
W
#和脯氨酸积累"结果
未显示#的促进作用就不如
#"
"
5=7
)
C
*#
D3E

所以!
D3E
增强细胞的抗渗透胁迫能力与脯氨酸积
累有重要关系
多个环境因子!如盐(干旱等导致的渗透胁迫会
影响脯氨酸代谢酶活性和基因的表达水平
D3E
或者
3A
如何影响脯氨酸积累!情况较为复杂!原因
是植物脯氨酸代谢由多条途径控制先前的研究工
作很少对代谢途径进行综合的分析和评价!有的表
明
D3E
处理可同时提高
EBD
活性和降低
EHI
活
性*!",!#!%+!有的表明
D3E
处理仅影响
EBD
活性*#&+
或
36
基因表达*#+!
Ck
Z
9a,?6YY/k1
等*!!+报道由
D3E
和
36B7
处理引起的脯氨酸含量降低是
EHI
活性受抑制而
EBD
和
AJK
活性受激活的结果
本试验在
D3E
对脯氨酸代谢酶影响方面的结果与
上述研究一致!但还发现
D3E
对
36B7
胁迫下烟草
细胞
GHI
(精氨酸酶活性也有促进作用本实验中
$")#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
D3E
处理能提高
!"F
的
GHI
活性(
"F
的精氨酸
酶活性和
%"F
的
AJK
活性!降低
"F
的
EHI
活
性!而对
EBD
活性几乎无影响!同时其对
!"#
(
$%&
和
"#
基因表达的影响结果与酶活性表现
相一致并且本实验还发现!
D3E
是顺序激活合成
途径关键酶!谷氨酸合成途径在胁迫前期起作用!鸟
氨酸合成途径在胁迫后期起作用!这与我们先前在
烟草和玉米中的实验结果相类似*!(+
D3E
诱导
的脯氨酸积累可能是顺序激活合成途径关键酶!包
括谷氨酸途径的
GHI
!鸟氨酸途径的精氨酸酶和
AJK
!以及抑制降解途径的
EHI
活性的综合结果
3A
对脯氨酸积累的促进作用初步表明是通过调控
代谢关键酶的基因表达实现的!但本实验中只对酶
的体外活性做了分析!并未对相关的酶在蛋白表达
水平上做检测!已有实验证明干旱等渗透胁迫处理
能诱导
C96
蛋白(水孔蛋白(组氨酸蛋白激酶的表
达*)"+蛋白质组分析表明!盐胁迫下离子通道蛋白
大幅增加*)#+因此!下一步值得分析
3A
对脯氨酸
代谢关键酶蛋白表达的影响!进一步阐释
3A
对酶
的调控是否有翻译后调控!或者比较基因水平调控
和蛋白水平调控的侧重点和差异性
综上所述!本研究揭示了
3A
通过影响烟草细
胞的渗透调节能力来应对
36B7
诱导的渗透胁迫!
3A
对脯氨酸代谢的调控可能是烟草细胞应答和适
应渗透胁迫的重要机制将来的研究需要阐明
3A
调控脯氨酸代谢的信号传导途径!包括
3A
与渗透
胁迫信号受体的相互作用等
参考文献!
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