全 文 ：植物学通报 2006, 23 (2): 158~163
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-10-17; 接受日期: 2005-12-15
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: wd724@163.com
.实验简报.
芥菜型油菜与白菜正反杂交的胚胎学研究
王丹1* 王文和2 史滟氵预1
(1 天津农学院园艺系 天津 300384) (2 北京农学院园林系 北京 102206)
摘要 利用荧光技术对芥菜型油菜(Brassica juncea)与白菜(B. pekinesis)种间正反杂交后花粉萌发和花
粉管生长过程进行了观察。结果显示: 芥菜型油菜与白菜正交授粉后, 花粉在柱头上能正常萌发, 多数
花粉管沿花柱到达胚珠完成受精, 且受精方式有珠孔受精、合点受精和中部受精, 少量花粉管生长不正
常, 出现花粉管顶端膨大扭曲, 花粉管分支等异常现象; 反交授粉后, 花粉在柱头上萌发时柱头乳突细胞
产生强烈胼胝质反应, 影响花粉管生长, 只有少量花粉管通过花柱到达胚珠完成受精。用石蜡切片技术
观察了正反杂交后杂种的胚胎发育, 正交杂种胚胎发育较早, 胚和胚乳生长较正常, 杂种胚一般均能发
育至成熟; 反交杂种胚发育至心型期便不能继续发育, 胚乳也停滞在游离核阶段并最终败育。综合分析
表明, 芥菜型油菜与白菜正反杂交都存在一定程度的受精不亲和性。
关键词 白菜, 芥菜型油菜, 花粉管, 胚胎发育, 种间杂交
Embryologic Research into Reciprocal Crosses Between
Brassica juncea and B. pekinesis
Dan Wang1*, Wenhe Wang2, Yanyu Shi1
(1 Horticulture of Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384)
(2 Department of Landscape Architecture, Beijing Agricultural College, Beijing 102206)
Abstract We used fluorescence observation to examine pollen germination and growth following
reciprocal crosses between Brassica juncea and B. pekinesis. When B. juncea was used as the seed
parent, the pollen grains on the stigma could sprout as usual, and most of the pollen tubes could
reach the ovule through the style and finish fertilization. With fertilization type, porogamy, chalazogamy
and misogamy included, only a few pollen tubes grew poorly and gave rise to the end being swollen
and twisted as well as branched pollen tubes. With B. pekinesis used as a seed parent, the growth of
the pollen tube was restrained, so only a little tube could go into the ovule and fertilize the eggs
because of papilla cells with strong callose effects. The development of a hybrid embryo derived from
the reciprocal crosses was observed by means of the paraffin-cut section method. B. juncea and B.
pekinesis crossed embryos developed early and in general grew to maturity, and the growth of the
embryo and endosperm was relatively normal, whereas in the B. pekinesis and B. juncea hybrid
embryo, growth stopped at the heart-shaped stage as did growth of the endosperm at the dissoluble
nuclear stage, and finally disappeared in the seed. Thus, B. juncea and B. pekinesis and its crosses
are incompatible to some degree.
1592006 王丹 等: 芥菜型油菜与白菜正反杂交的胚胎学研究
芥菜型油菜和白菜分别是芸苔属中栽培面
积较大、种质资源较为丰富的油料作物和蔬
菜作物。虽然在起源上, 芥菜型油菜染色体组
(AABB)中的A染色体来自白菜, 但以芥菜作为
母本较易获得杂交种, 反交却较困难(刘后利,
1985)。目前尚不清楚这种可交配性差异的原
因, 对白菜与芥菜型油菜杂交不育的胚胎学特征
缺乏较详细的报道。本试验通过荧光显微技
术观察种间杂交受精前生殖隔离发生时期和作
用部位, 用石蜡切片法对受精后杂种胚胎发育各
个阶段进行了观察并与子房培养的杂种胚发育
相比较, 以期找出种间杂交胚胎败育发生的时期
和原因, 并为了解白菜与芥菜型油菜不可交配性
的机理提供基础资料。
1 材料与方法
供试材料为芥菜型油菜(Brassica juncea)品
种宏达雪里蕻和白菜(B. pekinesis)品种大白圆
叶白菜。以 2种材料分别作父、母本进行正
反杂交, 方法与常规育种相同。分别取授粉后
4天的杂种子房先消毒, 然后在无菌条件下接种
于MS+1.0 mg.L-1 IAA+0.5 mg.L-1 KT培养基
中, 附加8%蔗糖和0.8%的琼脂。在光周期12
小时, 温度(25±1)℃条件下培养。剩余杂种子
房留在大田中自然生长。
1.1 材料的固定
分别取正反交授粉后 0.5、1、2、3、4、
6、8、12、18、24和 48小时的雌蕊, 每处
理各取5枚雌蕊, 以卡诺液(无水乙醇:冰醋酸=3:
1, V/V)固定后保存于70%乙醇中用于花粉管的
观察。分别取授粉后 4、6、8、1 0、1 2、
14、16、20和 22天的大田材料的子房和授粉
后 6、8、10、12、14和 20天的培养子房。
大田材料每处理各取5个子房, 培养材料每处理
取 4个子房。作为大田材料的对照, 培养材料
是田间授粉 4天后取回进行离体培养的子房。
以FPA(70%乙醇90 mL:丙酸5 mL:甲醛5 mL)为
固定液固定, 24小时后转入70%乙醇溶液置4℃
冰箱中备用。
1.2 制样与观察
1.2.1 花粉管的观察 将固定的雌蕊材料取
出, 水洗后以6 mol.L-1 NaOH透明软化12小时,
再充分水洗, 然后用0.1%水溶性苯胺兰溶液
(0.15 mol.L-1 K2HPO4缓冲液中, pH8.2)染色过
夜。经压片在OLYMPUS落式荧光显微镜下观
察花粉的萌发、柱头乳突细胞的胼胝质反应
及花粉管生长情况(王幼平等, 1997)。
1.2.2 胚胎发育的观察——石蜡切片法 将
固定的材料用常规石蜡制片法制片染色, 制成永
久切片。用OLYMPUS BH-2型显微镜观察胚
胎发育过程。
2 观察结果
2.1 芥菜型油菜与白菜正反交授粉后花粉
管生长过程的荧光观察
以芥菜型油菜品种宏达雪里蕻与白菜品种
大白圆叶白菜配置的杂交组合, 观察比较正反交
授粉受精过程及胚胎学差异。芥菜型油菜作
母本时称正交, 反之称反交。正交、反交授粉
后, 花粉均能在柱头上萌发, 花粉管沿花柱道向
下生长。授粉后 0.5小时, 正交、反交的花粉
均有部分萌发(图1A, B), 只是反交花粉萌发的
速度快于正交, 且有 2处萌发的花粉管。3小
时后, 花粉管伸长, 在反交柱头的乳突细胞上有
胼胝质生成(图1C)。6小时后乳突细胞有强烈
的胼胝质反应, 胼胝质在荧光显微镜下发出黄绿
色荧光, 且有不正常花粉管顶端膨大扭曲, 但仍
有少数花粉管穿过柱头进入花柱(图1D)。在正
交中, 花粉管生长较慢, 有不正常的花粉管, 如
花粉管顶端膨大扭曲(图 1E)、中部膨大(图
Key words Brassia pekinesis, pollen tube, Brassica juncea, embryonic development,
interspecific cross
160 23(2)
图 1 芥菜型油菜和白菜正反交授粉后花粉萌发及花粉管生长
A．授粉后 0.5小时正交花粉萌发; B. 授粉后 0.5小时反交花粉萌发; C. 授粉后 3小时反交柱头上有胼胝
质反应; D. 反交花粉管伸长; E. 正交花粉管顶端膨大; F. 正交花粉管中部膨大; G. 正交花粉管有分支; H.
授粉后18小时正交柱头; I. 授粉后24小时正交珠孔受精; J. 授粉后24小时正交合点受精; K. 授粉后24小
时正交中部受精; L. 授粉后24小时反交珠孔受精 (A~H. Bar=50 mm; I~L. Bar=100 mm)
Fig.1 The pollen germination and growth following on reciprocal crosses between of Brassica juncea and B.
pekinesis
A. B. juncea× B. pekinesis, 0.5 h after pollination, pollen germinate; B. B. pekinesis× B. juncea, 0.5 h after
pollination, pollen germinate; C. B. pekinesis× B. juncea, 3 h after pollination, callose reaction at styles; D. B.
pekinesis× B. juncea, pollen tubes growing; E. B. juncea×B. pekinesis, top of pollen tubes swelled; F. B. juncea
× B. pekinesis, middle of pollen tubes swelling; G. B. juncea× B. pekinesis, pollen tubes with branch; H. B.
juncea×B. pekinesis, 18 h after pollination, styles; I. B. juncea×B. pekinesis, 24 h after pollination, porogamy;
J. B. juncea×B. pekinesis, 24 h after pollination, chalazogamy; K. B. juncea×B. pekinesis, 24 h after pollination,
misogamy; L. B. pekinesis× B. juncea, 24 h after pollination, porogamy (A-H. Bar=50 mm; I-L. Bar=100 mm)
1612006 王丹 等: 芥菜型油菜与白菜正反杂交的胚胎学研究
1F)、花粉管有分支(图 1G)。授粉后 18小时,
柱头乳突细胞也出现胼胝质反应, 但仍有大量的
花粉管穿越柱头进入花柱(图 1H)。24小时后,
正反交的花粉管均能到达胚珠。正交受精方
式以珠孔受精为主, 另有合点受精和中部受精现
象(图1 I, J, K), 而反交中只见珠孔受精一种方
式(图 1L)。
2.2 芥菜型油菜与白菜正反交种间杂种的
胚胎发育
白菜×芥菜型油菜人工授粉2天后已基本
完成双受精作用, 在胚囊中有游离的胚乳核形
成, 呈彩带状分布于胚囊的边缘。同时发现, 当
初生胚乳核分裂后, 受精卵中雌雄核仁尚未合并
(图 2A)。授粉 4~6天后, 受精卵开始分裂, 形
图 2
Fig. 2
162 23(2)
图 2 芥菜型油菜和白菜正反交的胚胎发育
A. 反交 2天后胚胎发育; B. 反交 4天后胚的发育; C. 反交 6天后基细胞先分裂; D. 反交 8天球型胚; E. 反
交 12天早心型胚; F. 反交 14天胚体开始退化; G. 正交 2天的 2细胞原胚; H. 正交 3天基细胞开始分裂; I.
正交4天形成四分体原胚; J. 正交8天球型胚形成; K. 正交10天鱼雷型胚形成; L. 正交16天成熟胚(A~J.
Bar=50 mm; K. Bar=100 mm; L. Bar=250 mm)
Fig.2 The embryonic development on reciprocal crosses between of Brassica juncea and B. pekinesis
A. B. pekinesis× B. juncea, 2 d after pollination, embryo development; B. B. pekinesis× B. juncea, 4 d after
pollination, embryo development; C. B. pekinesis× B. juncea, 6 d after pollination, basal cell fission; D. B.
pekinesis× B. juncea, 8 d after pollination, globe-shaped embryo; E. B. pekinesis× B. juncea, 12 d after
pollination, early heart-shaped embryo; F. B. pekinesis×B. juncea, 14 d after pollination, endosperm degeneration;
G. B. juncea×B. pekinesis, 2 d after pollination, 2-cell proembry; H. B. juncea×B. pekinesis, 3 d after pollination,
basal cell split; I. B. juncea×B. pekinesis, 4 d after pollination, 4-cell embryo proper; J. B. juncea×B. pekinesis,
8 d after pollination, globe-shaped embryo; K. B. juncea×B. pekinesis, 10 d after pollination, torpedo-shaped
embryo; L. B. juncea×B. pekinesis, 16 d after pollination, mature embryo (A-J. Bar=50 mm; K. Bar=100 mm;
L. Bar=250 mm)
成 2细胞的原胚; 少数顶细胞开始分裂, 形成
2~4细胞的原胚; 有的顶细胞未分裂, 基细胞已
分裂至 2~4细胞(图 2B, C)。授粉 8天后, 受精
卵已发育至球型胚时期, 有少量的游离胚乳产生
(图2D)。授粉10~12天后杂种胚虽已从球型胚
向早心型胚过渡, 但游离的胚乳核在未形成胚乳
细胞前已解体(图2E)。授粉14天后, 胚体开始
退化, 不再继续发育, 杂种胚细胞松散、结构
不紧密, 且珠心组织已消失, 珠被结构也开始退
化(图 2F)。离体子房培养的材料, 对应天数下
杂种胚的发育基本与大田相同。只是在授粉
后12天时, 球型胚已开始解体, 在此之后, 切片
中均未见到有胚的胚珠。
芥菜型油菜×白菜的双受精要早于反交,
授粉 1天后基本完成双受精。2天后能形成 2
细胞原胚, 伴有彩带状的游离胚乳核出现(图
2G)。授粉后3天, 基细胞开始分裂为2~3细胞
胚柄(图2H)。4天后顶细胞形成2~4细胞原胚,
游离胚乳核分布于胚囊的边缘(图 2 I)。授粉
6~8天后, 胚体继续发育, 从球型胚向心型胚发
育, 游离胚乳核在珠孔端产生细胞壁, 形成胚乳
细胞包围着杂种胚(图2 J)。授粉10天后, 此时
胚呈鱼雷型, 初步分化形成了胚芽、胚轴、胚
根和2片子叶(图2K)。随着胚体完成发育过程,
胚柄也逐渐退化消失。当授粉16天后, 胚不再
纵向伸长, 子叶弯曲, 对折, 并包住胚根和胚轴
(图2L)。而室内子房培养条件下的胚发育在授
粉6天后, 顶细胞开始分裂形成2细胞原胚, 基
细胞此时未分裂。授粉 8天后, 胚的发育速度
基本与大田相似。
3 讨论
本试验表明, 芥菜型油菜与白菜无论正反
交都存在一定程度的受精不亲和性。其中芥
菜型油菜与白菜反交表现出弱的亲和性, 授粉8
小时后产生强烈的胼胝质反应, 且花粉管中胼胝
质有不规则沉积的现象。而芥菜型油菜与白
菜正交时, 花粉粒在柱头上萌发的时间虽晚于反
交,花粉形态上也有一些不正常的变化,但仍有
大量的花粉管能够正常生长完成受精作用。
大量资料证明: 花粉具有高度的生理活性, 能分
泌植物激素、酶及其他生理活性物质, 通过与
雌蕊的作用, 对受精及其结果发生一定的影响。
杨弘远和周嫦(1975)通过对芝麻限量授粉的方
法证明, 授1粒花粉的处理在良好条件下有相当
高的结实率, 并且限量授粉产生的后代是完全正
常的, 说明受精作用基本上可以按“一对一”
的方式进行。但同时也承认“多余”花粉的
作用, 认为“多余”花粉管可能进入胚囊, 甚
至多精入卵, 这对受精和胚胎早期发育有一定作
1632006 王丹 等: 芥菜型油菜与白菜正反杂交的胚胎学研究
用。因而, 在柱头上大量花粉的作用不仅限于
保证精卵相遇的机会和提供最适合的雄配子, 而
且还在于创造一个有利于受精和早期胚胎发育
的生理环境, 在合子亲和交配时更为重要。因
此, 在白菜和芥菜型油菜杂交时少量花粉管
进入柱头是其不能获得种间杂交种子的原因
之一。
芥菜型油菜和白菜正反交的差异, 不仅反
映在花粉和柱头的相互作用上, 还强烈地表现在
杂种胚和胚乳的发育中。孟金陵等(1995)认为
在不亲和的杂交中, 胚乳发育不正常是杂种胚败
育的主要原因, 胚乳发育不正常表现在游离胚乳
核时期就开始退化或胚乳细胞不能形成。本
试验在芥菜型油菜与白菜正反交的胚胎学观察
中亦看到胚乳的提前退化现象, 尤其是反交, 在
胚乳核尚未形成胚乳细胞之前就已解体退化, 显
然这与胚胎的发育受阻或败育有关。但胚乳
的异常退化并非是造成反交中胚胎败育的唯一
因素。观察中我们看到, 伴随着胚乳的衰退, 内
珠被细胞迅速坏死。内珠被细胞的坏死不仅
使胚胎发育失去了一个重要的营养物质来源, 而
且坏死的细胞组织也可能阻塞营养物质的运输
通道。这种现象, 在张成合等(2001)关于菜薹
异倍体间杂交实验中也曾见到。因此, 我们
认为内珠被细胞的坏死也可能是导致反交中
胚胎败育的重要因素。与反交相比, 正交时
胚和胚乳的发育基本正常。这种正反交的显
著差异在甘蓝和白菜以及棉属的种间杂交中
都有过报道(Hakansson, 1956; Pundir, 1972)。
所以我们认为胚乳的异常退化及内珠被细胞
的坏死是反交不易获得杂种的主要原因。本
试验还通过子房培养的方法, 克服该原因引起
的胚败育, 获得芥菜型油菜与白菜正反交的杂
种种子。
在烟草、番茄、曼陀罗、落花生、棉
和月见草等属的种间杂交中, 曾报道过由于胚珠
母体组织过度生长而抑制胚和胚乳发育的现象,
这种不能结实的类型称为体质不育(Cooper and
Brink,1940;Raghavan,1976;胡文发等, 1992)。曾
有报道对体质不育发生的生理学机制作过种种
推测, 但对这一现象的遗传学研究尚未见报道,
因而也未能提出解决这一难题的措施。我们
在芥菜型油菜与白菜反交中发现母体胚珠组织
过度生长, 而未获得有胚的杂交种子, 但正交中
未见此现象。我们推测体质不育可能是影响
杂交后胚及胚乳生长发育的原因。
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(责任编辑: 白羽红)