全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (2): 173-180, www.chinbullbotany.com
.实验简报.
海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的 RAPD分析
史学群 1 , 宋海超 1 , 张欣 2 , 易克贤 3, 4*
1海南大学生命科学与农学院, 海口 570228; 2中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 儋州 571737
3中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室, 海口 571101; 4中国热带农业科学院南亚热带作物研究所, 湛江 524091
摘要 利用8个随机引物对来自海南、广东和广西的114个柱花草胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的菌株进
行了随机扩增多态性DNA(RAPD)分析, 扩增谱带大小0.2-3.0 kb。8个随机引物中以CW38114扩增的谱带重现性和稳定性
最好, 共扩增出786条谱带, 其中多态性谱带558条。供试菌株扩增图谱在260-650 bp处有3条明显的共同特征谱带, 在650-
3 000 bp之间的谱带显示较大的多态性差异。聚类结果表明: 供试菌株主要分为四大遗传类型, 其中第I类和第III类有两个亚
类; 三省区的菌株遗传多态性丰富程度依次为海南>广西>广东, 并表现出地区性分布差异。研究结果还表明柱花草炭疽菌株
表现出一定程度的专化寄生性。
关键词 胶孢炭疽菌, 随机扩增多态性DNA, 柱花草
史学群, 宋海超, 张欣, 易克贤 (2007). 海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的 RAPD分析. 植物学通报 24, 173-180.
收稿日期: 2006-06-21; 接受日期: 2006-11-20
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30160059)、海南省自然科学基金(No. 3005)和热带作物生物技术国家重点实验室开放研究基金
* 通讯作者。E-mail: yikexian@21cn.com
柱花草( S t y l o s a n t h e s s p p . )又名笔花豆
(penciflower),是全球热带地区栽培面积最大、应用最
广泛的优良豆科牧草, 除广泛用作牧草供放牧和生产优
质干草及草粉外, 还可作为绿肥和幼龄胶园、果园的覆
盖作物以及水土保持植物。
柱花草炭疽病(stylo anthracnose)是目前严重影响
柱花草生产和推广的主要病害, 在全球柱花草种植区均
有分布。该病主要由半知菌亚门刺盘孢属的胶孢炭疽
菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起。柱花草炭疽
病主要危害植株叶、茎并具有再侵染特性, 使牧草叶片
变黄、坏死并脱落, 茎、叶柄和顶芽枯萎, 花序败落
不结籽, 严重时能使幼苗和整个成株死亡, 造成牧草产
量和种子产量锐减, 甚至绝收。研究表明, 柱花草炭疽
菌具有丰富的生物多样性和遗传变异性, 许多抗病品种
使用几年之后便丧失原有抗性。国内外生产实践证明,
一个抗病的柱花草品种使用10年后就会变成感病品种,
即品种寿命一般只有 10年左右。因此深入进行柱花草
炭疽病病原生物学和遗传学研究, 加速培育柱花草抗炭
疽病品种已成为柱花草主要生产国的一项紧迫任务。
1962年我国开始从马来西亚系统引入柱花草。据
冯淑芬(1994)在 1987-1989年对海南、广东和广西 3
省区11个市县的主要柱花草种植区的调查结果显示, 各
地均有炭疽病分布。此后, 易克贤等(2001, 2003)对我
国广东、广西和海南 3省的 14个主要柱花草生产市县
再次进行了调查, 发现我国柱花草同时存在 A、B两种
专化型, 而在我国危害较大的是 B型胶孢炭疽菌。
由于不同柱花草胶孢炭疽菌株菌丝体和分生孢子表
型培养特征高度相近, 因此利用传统的形态标记和经典
遗传标记很难对其进行分类鉴定。而分子标记技术的
产生和发展为从基因组DNA分子水平上进行柱花草炭
疽病原菌株的遗传分析提供了便捷的手段。特别是
RAPD技术, 由于其简单易行, 成本低, 分析大量样本速
度快, 近年在研究植物病原真菌的群体遗传特别是种内
遗传分化上 ,显示了独特的优越性而得到广泛应用
(Munaut et al., 1998; 陈亮等, 2000; 易克贤等, 2003;
桂秀梅等, 2005; 郭宏波等, 2005)。
本研究是在易克贤等(2003)对少量中国柱花草炭疽
病原菌株基因组DNA进行RAPD分析的基础上, 通过在
174 植物学通报 24(2) 2007
海南、广东和广西3地更大范围和数量上收集柱花草炭
疽病原菌株, 进行DNA多态性分析, 以进一步确定我国
柱花草主要生产区(海南、广东和广西)的柱花草炭疽菌
的遗传多态性和病原遗传分化类型, 为我国柱花草抗炭
疽病育种工作中育种目标的制定、抗病材料的鉴定筛
选、抗病品种的培育、致病的分子机理和病害预测及
防治等提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病原菌材料
1997-2001年对海南、广东和广西主要柱花草种植区
15个市县进行了炭疽病全面调查并采集病样(病叶或病
茎), 在实验室进行单孢分离纯培养, 共获得单孢分离菌
株(isolate)661个, 从中选取代表性菌株114个(表1)进
行 RAPD 分析。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
炭疽病原菌基因组DNA的提取采用改良的SDS法进行
(Kelemu et al., 1997)。用 PDA液体培养基培养菌丝,
菌龄 48-72小时, 用灭菌纸吸干菌丝。取病株的菌丝
1 g置于研钵中, 加入液氮, 磨成粉末, 置于 5 mL离心
管中, 加 1.5 mL(65°C预热)细胞裂解液(即 DNA提取
液), 再加150 mL饱和酚, 1.5 mL氯仿(三氯甲烷)轻摇,
65°C保温30分钟(打开盖), 取出后加2 mL冷异丙醇和
0.1体积(400 mL) 3 mol.L-1 NaAc pH5.2, 在-20°C下
放置2小时, 然后10 000×g离心10分钟, 弃上清液, 保
留沉淀。用 70%冷乙醇洗涤 2次, 放超净工作台吹干
(或用吸水纸吸干), 接着加 2 mLTE(存于 4 °C), 10 mL
RNase摇匀, 常温放置 30分钟, 用等体积酚(2 mL)抽
提, 室温放置 5分钟, 10 000×g离心 10分钟, 取上清,
加氯仿 /异戊醇(24: 1)(2 mL), 室温放置 5分钟, 10
000×g离心10分钟, 取上清约1 mL, 转1.5 mL离心管,
加500 mL异丙醇, 150 mL 3 mol.L-1 NaAc, -20°C沉
淀 1小时, 12 000×g离心 10分钟, 弃上清。70%冷乙
醇洗涤 2 次 , 超净工作台吹干。溶于 100 mL 双蒸
水 -20°C 保存。用紫外分光光度计调模板浓度为
25 ng·µL-1。
1.2.2 PCR扩增
参考易克贤等(2003)的方法, 用8个含有10个碱基的随
机寡聚核苷酸 (表 2) 作为引物进行DNA的PCR扩增,
筛选出清晰、多态性明显的引物作为扩增引物。PCR
反应体系为 25 µL体系。其中 25 ng.µL-1模板 1 µL,
5 pmol·µL-1引物1 µL, 2.5 mmol·L-1 4×dNTPs 2 µL,
25 mmol·L-1 MgCl2 3 µL, 10×buffer 2 µL, 3U·µL-1
TaqDNA聚合酶 0.4 µL, ddH2O 15.6 µL。
PCR反应程序为: 模板 DNA 94°C预变性 7分钟;
94°C 1分钟, 35.5°C 1分钟, 72°C 2分钟, 45个循环;
72°C延伸 10分钟, 降温至 4°C。
1.2.3 电泳检测和数据处理　
扩增反应结束后, 每管加入6×加样缓冲液4 µL, 混匀后
点样于含有溴化乙锭(EB)的 1.5%琼脂糖凝胶中, 在
50V电压下电泳16小时, 使DNA片段在含有溴化乙锭
的琼脂糖凝胶上按分子量大小分离。根据供试菌株
RAPD-PCR扩增条带的有无, 以 1和 0记数。统计稳
定、清晰出现的条带, 采用UPGMA分析软件进行聚类
分析。并建立树状图。
遗传距离= 1-相似系数
相似系数 = 2Mab/(Ma+Mb)
式中, Ma表示菌株 a谱带总和; Mb表示菌株 b谱带总
和; Mab表示菌株 a和 b共有谱带总和。
2 结果与分析
2 . 1　扩增片段及其大小
用8个不同的引物扩增柱花草炭疽菌株, 结果表明, 用引
物CW38114扩增出的条带多, 多态性好。用CW38114
对 114个菌株进行扩增, 共得到 786条谱带, 其中多态
性谱带有 558条, 扩增谱带大小 0.2-3.0 kb。
由图1和图2可见, 114个柱花草炭疽菌的扩增图谱
175史学群等: 海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的RAPD分析
表 1 用于 RAPD分析的海南、广东和广西三地柱花草炭疽病病原菌株
Table 1　Isolates of Colletotrichum gloeosporioides from Stylosanthes spp. from Hainan, Guangdong and Guangxi for RAPD analysis
Collecting Collecting
Isolate date Site Host Isolate date Site Host
CH001 1997-08-27 Danzhou,Hainan S.guianensis CH363 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis
CH005 1997-09-12 Dongfang,Hainan S.hamata CH363 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis
CH009 1997-09-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH365 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis
CH010 1997-09-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH366 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis
CH012 1997-09-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH368 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis
CH014 1997-09-12 Ledong,Hainan S.guianensis CH374 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH017 1997-09-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH375 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH027 1997-10-14 Changjiang,Hainan S.guianensis CH376 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH035 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH377 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH036 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH378 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH043 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH379 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH060 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH380 2001-10-09 Quli,Guangxi S.scabra
CH063 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH381 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH072 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH382 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH073 1999-12-03 Changjiang,Hainan S.scabra CH383 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH087 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.scabra CH389 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH089 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.scabra CH396 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH107 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH397 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH108 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH399 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH109 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.guianensis CH403 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH110 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.hamata CH405 2001-10-09 Quli,Guangxi S.guianensis
CH111 1999-12-12 Dongfang,Hainan S.hamata CH411 2001-10-10 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH113 1999-12-12 Changjiang,Hainan S.guianensis CH412 2001-10-10 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH114 1999-12-12 Changjiang,Hainan S.guianensis CH415 2001-10-10 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH116 1999-12-12 Changjiang,Hainan S.guianensis CH426 2001-10-10 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH119 1999-12-12 Changjiang,Hainan S.guianensis CH451 2001-11-23 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH151 1999-12-26 Ledong,Hainan S.guianensis CH455 2001-11-23 Quanj iang,Guangxi S.guianensis
CH157 1999-12-26 Ledong,Hainan S.guianensis CH461 2001-11-26 Dianbai,Guangdon S.guianensis
CH188 2000-09-20 Qiongzhong,Hainan S.guianensis CH476 2001-11-26 Dianbai,Guangdon S.guianensis
CH189 2000-09-20 Qiongzhong,Hainan S.guianensis CH477 2001-11-26 Dianbai,Guangdon S.guianensis
CH242 2001-01-12 Danzhou,Hainan S.seabrana CH478 2001-11-26 Dianbai,Guangdon S.guianensis
CH243 2001-01-12 Danzhou,Hainan S.seabrana CH483 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH247 2001-01-12 Danzhou,Hainan S.scabra CH484 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH251 2000-12-09 Wenchang,Hainan S.guianensis CH485 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH255 2000-12-09 Wenchang,Hainan S.guianensis CH492 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH260 2000-10-25 Dongfang,Hainan S.hamata CH493 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH261 2000-10-25 Dongfang,Hainan S.scabra CH496 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH262 2000-12-09 Wenchang,Hainan S.guianensis CH497 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH288 2000-10-25 Danzhou,Hainan S.scabra CH498 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH295 2001-01-15 Danzhou,Hainan S.scabra CH499 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.guianensis
CH311 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.seabrana CH501 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.scabra
CH312 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.seabrana CH504 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.scabra
CH321 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.scabra CH506 2001-11-27 Xingning,Guangdong S.scabra
CH343 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.scabra CH518 2001-11-28 Meisian,Guangdong S.guianensis
CH344 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.scabra CH519 2001-11-28 Meisian,Guangdong S.guianensis
CH345 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.scabra CH526 2001-11-28 Meisian,Guangdong S.guianensis
CH347 2001-11-03 Danzhou,Hainan S.scabra CH541 2001-11-29 Fengshun,Guangdong S.guianensis
CH350 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH545 2001-11-29 Fengshun,Guangdong S.guianensis
CH351 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH616 2001-11-30 Punin,Guangdong S.guianensis
CH353 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH625 2001-11-30 Punin,Guangdong S.guianensis
CH354 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH633 2001-11-30 Punin,Guangdong S.guianensis
CH355 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH635 2001-11-30 Punin,Guangdong S.guianensis
CH356 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH653 2001-11-30 Chaoyang,Guangdong S.guianensis
CH358 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH655 2001-11-30 Chaoyang,Guangdong S.guianensis
CH359 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH657 2001-11-30 Chaoyang,Guangdong S.guianensis
CH360 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH658 2001-11-30 Chaoyang,Guangdong S.guianensis
CH362 2001-05-23 Baisha,Hainan S.guianensis CH660 2001-11-30 Chaoyang,Guangdong S.guianensis
176 植物学通报 24(2) 2007
在260-650 bp处有3条明显共同特征谱带, 而在650-
3 000 bp间谱带丰富。许多菌株扩增谱带有12-15条,
如广西渠黎菌株(11、20、23号泳道)和海南昌江菌株
(3、6、22、33-38号泳道)都表现出了丰富的遗传多
态性位点。海南白沙的菌株( 5、3 0、5 5、6 2、6 4
号泳道)也扩增出较多条带, 且存在多态性差异。海南
东方、儋州的菌株间多态性差异也较大。广东兴宁菌
株(88、89、92、114号泳道)扩增谱带多且整齐, 但
此地其它菌株(67、68、99、112号泳道等)谱带差异
较大。各省(区)其它菌株亦存在不同程度的多态性差
异 。
2.2 聚类结果与分析
114个材料的RAPD扩增图谱聚类分析如图3。在遗传
距离0.45处分成4类, 其中第 I类最大, 含菌株41个, 包
含了所有调查采样地点的菌株; 第 II类含菌株18个, 主
表 2 用于 PCR扩增的 8个随机引物代码及碱基序列
Table 2　Code and sequence of eight selected primers for PCR
Code Sequence No.of bands Size range(kb)
CW38110 5-CCTGGAGCTT-3 12 0.3-2.6
CW38111 5-CTGTGTGCTC-3 9 0.4-2.5
CW38112 5-GTCCATGCAG-3 8 0.2-2.5
CW38113 5-GAGAGCCAAC-3 11 0.4-2.8
CW38114 5-GAGCGCCTTG-3 18 0.2-3.0
CW38115 5-TCGCCCAGTC-3 6 0.4-3.0
CW38116 5-CCGACAAACC-3 8 0.3-2.5
CW38117 5-TCGGAGGTTC-3 12 0.2-2.6
图 1 柱花草胶孢炭疽菌菌株用引物 CW38114扩增后的多态性图谱
Figure 1 Polymorphisms in gels for 58 isolates determined by random amplified polymorphic DNA analysis with the arbitrary
primer CW38114
1: CH107; 2: CH108; 3: CH113; 4: CH362; 5: CH354; 6: CH114; 7: CH001; 8: CH378; 9: CH017; 10: CH321; 11: CH377; 12: CH364;
13: CH087; 14: CH035; 15: CH247; 16: CH379; 17: CH380; 18: CH151; 19: CH389; 20: CH375; 21: CH383; 22: CH119; 23: CH376; 24:
CH343; 25: CH344; 26: CH365; 27: CH345; 28: CH014; 29: CH255; 30: CH359; 31: CH312; 32: CH157; 33: CH036; 34: CH027; 35:
CH060; 36: CH063; 37: CH072; 38: CH073; 39: CH089; 40: CH009; 41: CH012; 42: CH043; 43: CH111; 44: CH366; 45: CH368; 46:
CH381; 47: CH109; 48: CH189; 49: CH116; 50: CH360; 51: CH110; 52: CH251; 53: CH005; 54: CH350; 55: CH351; 56: CH356; 57:
CH353; 58: CH010; M: marker 100-3 000 bp
177史学群等: 海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的RAPD分析
要是海南菌株, 菌株来源地 7个, 占所有采集点数的
47%; 第 III类含菌株 37个, 菌株来源于 3省区共 11个
点, 占所有采集点数的74%; 第 IV类含菌株17个, 主要
来自海南和广西, 菌株来源地 9个, 占所有采集点数的
60%。在遗传距离0.39处, 第 I类和 III类还可分别再分
为两个亚类, 说明我国海南、广东和广西3省区柱花草
炭疽菌株存在着种内遗传分化。
表 3的分析结果表明海南及广西两省区菌株遗传
多态性表现丰富, 在4个类型中均有分布, 但广西菌株
以第 III类较为集中, 而广东菌株仅分布在第 I、III和 IV
类中, 其中以第 I类最为集中。因此 3省区的菌株遗传
多态性丰富程度依次为海南>广西>广东, 并表现出地区
性分布差异。
由表3可知, 同一省区内不同地方的菌株亦表现出
不同的遗传多态性差异和地区分布差异。海南菌株以
东方、儋州、白沙菌株遗传多态性最为丰富, 但儋州
菌株主要为第IV类, 东方菌株主要为第I和II类, 白沙菌
株为第 II和 III类, 昌江菌株主要为第 III类。广西渠黎
菌株为第III类, 广东兴宁菌株为第I和III类, 其它地方的
菌株主要为第 I 类。
从菌株侵染寄主的种类看(表4), 不同类型的菌株表
现出一定的专化寄生性。第 I和 IV两类菌株侵染圭亚
那、西布拉和西卡 3个品种, 而第 II、III类菌株侵染圭
亚那、有钩和西卡。四类菌株均侵染圭亚那柱花草和
西卡柱花草, 其中侵染圭亚那柱花草菌株以 I、III类为
主, 侵染西卡柱花草的菌株以第 III类为主; 而侵染有钩
柱花草的仅有第II和III两类; 侵染西布拉柱花草的仅有
第 I 和 IV 两类。
3 结论与讨论
3.1 柱花草炭疽菌DNA存在显著的多态性
本文采用 8个不同的引物对 114个来自广东、广西和
海南的柱花草炭疽菌株进行了较为全面和系统的RAPD
分析。结果表明供试柱花草炭疽菌株DNA存在显著的
多态性。扩增谱带大小0.2-3.0 kb, 许多菌株扩增谱带
为 12-15条。其中用CW38114对 114个菌株进行扩
增, 共得到 786条谱带, 多态性谱带 558条。扩增图谱
在 260-650 bp处有 3条明显共同特征谱带, 体现了柱
花草炭疽菌种内的遗传稳定性, 而在 650-3 000 bp处
图 2 柱花草胶孢炭疽菌菌株用引物 CW38114扩增后的多态性图谱
Figure 2 Polymorphisms in gels for 56 isolates determined by random amplified polymorphic DNA analysis with the arbitrary
primer CW38114
59: CH545; 60: CH399; 61: CH382; 62: CH363; 63: CH519; 64: CH358; 65: CH403; 66: CH188; 67: CH492; 68: CH493; 69: CH374; 70:
CH396; 71CH411; 72: CH499; 73: CH506; 74: CH397; 75: CH295; 76: CH262; 77: CH541; 78: CH451; 79: CH476; 80: CH412; 81:
CH243; 82: CH242; 83: CH483; 84: CH461; 85: CH260; 86: : CH655; 87: CH658; 88: CH485; 89: CH497; 90: CH477; 91: CH478; 92:
CH498; 93: CH347; 94: CH657; 95: CH288; 96: CH625; 97: CH660; 98: CH616; 99: CH501; 100: CH653; 101: CH526; 102: CH426; 103:
CH405; 104: CH455; 105: CH311; 106: CH261; 107: CH635; 108: CH415; 109: CH496; 110: CH633; 111: CH518; 112: CH484; 113:
CH355; 114: CH504; M: marker 100-3 000 bp
178 植物学通报 24(2) 2007
谱带丰富, 表现较大的多态性差异。由于不同柱花草胶
孢炭疽菌株菌丝体和分生孢子表型培养特征高度相近,
因此利用传统的形态标记和经典遗传标记很难将它们进
行分类鉴定。本研究表明利用 RAPD技术可获得大量
的DNA遗传标记, 为柱花草炭疽菌病原种群遗传学研究
与遗传类型的鉴定和划分提供了重要手段。
3.2 柱花草炭疽菌株存在种内遗传分化
本研究的RAPD扩增结果聚类分析表明, 3省区菌株可
分成四大遗传类型, 其中第 I类和 III类各有 2个亚类。
而易克贤等(2003)利用RAPD标记将43个中国柱花草
炭疽病原菌划分成三大类型, 其中一类有4个亚类。两
者都证明我国海南和两广地区柱花草炭疽菌株存在着种
内遗传分化。本研究分析的柱花草炭疽菌株是 114个,
因此对中国柱花草炭疽病原菌遗传类型的划分更为系统
和全面。
3.3 柱花草炭疽菌株遗传多态性丰富程度表现
出地区性分布差异
研究表明3省区柱花草炭疽菌株遗传多态性丰富程度依
次为海南>广西>广东, 而且同一省区内不同地方的菌株
亦表现出不同的遗传多态性差异和地区分布差异。这
可能与各地柱花草的引种活动、推广种植的时间、规
模不同和生态条件差异有关, 引种和种植时间越长, 病原
菌为适应当地环境, 遗传变异和进化必然更加活跃。引
种柱花草最早、种植规模最大的海南及广西两省区菌
株遗传多态性表现丰富, 而海南东方、儋州、白沙三
地也是海南省引进种植柱花草最早、栽培面积最大的
市县, 遗传多态性也最为丰富。生产实践表明柱花草抗
病品种的有效期一般只有 10年左右(Cameron et al.,
图 3 海南、广东和广西三地 114个菌株 DNA的 RAPD扩增图谱
聚类图
Figure 3 Dendrogram of 114 isolates from Hainan,Guangdong
and Guangxi
®
179史学群等: 海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的RAPD分析
3.3 柱花草炭疽菌株表现出一定程度的专化寄
生性
本研究表明, 第 I和 IV两类菌株侵染圭亚那、西布拉和
西卡 3个品种 , 而第 I I 和 I I I 类菌株侵染圭亚那、有
钩和西卡。四类菌株均侵染圭亚那柱花草和西卡柱
花草 , 其中侵染圭亚那柱花草菌株以 I和 I I I类为主 ,
侵染西卡柱花草的菌株以第III类为主; 而侵染有钩柱
花草的仅有第II和II I两类; 侵染西布拉柱花草的仅有
第 I 和 I V 两类。
表 3 不同地区的菌株数及聚类结果
Table 3 Number of isolates in each place and the result in cluster
Clusters and isolates included
Province Site Isolates I I III IV Other
Hainan Dongfang 14 5 5 3 1
Qiongzhong 2 2
Wenchang 3 1 1 1
Baisha 15 2 6 6 1
Danzhou 13 3 2 1 6 1
Ledong 3 1 2
Changjiang 12 1 2 8 1
Total 62 15 16 19 11 1
Guangxi Quli 16 3 2 9 2
Quanjiang 6 2 2 2
Total 22 5 2 11 4
Guangdong Xingnin 12 8 4
Meixian 3 2 1
Fengshun 2 1 1
Dianbai　 4 3 1
Chaoyang 5 4 1
Puning 4 3 1
Total 30 21 7 2
Total 114 41 18 37 17 1
表 4 114个菌株 RAPD聚类结果及其与寄主种类的关系
Table 4 Number of 114 isolates by RAPD cluster vs. host species
Group Stylosanthes guianensis S. hamata S. seabrana S. scabra
Cluster I 34 2 5
Cluster II 12 3 3
Cluster III 23 1 13
Cluster IV 10 2 5
Total 79 4 4 26
1997), 这与柱花草胶孢炭疽菌不断进化新小种有密切关
系。国外许多报道(Kelemu et al., 1997; Cameron et
al.,1997; Chakraborty et al.,1997)均表明在柱花草的
起源中心——南美和长期种植区柱花草胶孢炭疽菌存在
着广泛的生物多样性和遗传变异性, 而在新种植区则相
对简单。与国外研究结果相比, 中国柱花草遗传多样性
要简单得多, 因此在柱花草的引种和推广过程中, 应特别
注意病原菌的检疫和种子的灭菌处理, 以防止新的侵染
力强的病原菌株或小种从国外或老种植区带入新区, 对
柱花草造成严重威胁。
180 植物学通报 24(2) 2007
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Genetic Diversity Analysis of Colletotrichum gloeosporioides from
Stylosanthes spp in Hainan, Guangdong and Guangxi with Use of
Random-amplified Polymorphic DNA
Xuequn Shi 1 , Haichao Song 1 , Xin Zhang2 , Kexian Yi 3,4*
1Life Sciences and Agriculture College, Hainan University, Haikou 570228, China
2Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China
3National Biotechnological Laboratory of Tropical Crops, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
4South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Zhanjiang 524091, China
Abstracts Genetic diversity of 114 isolates of Stylosanthes spp of Colletotrichum gloeosporioides in Hainan, Gunagdong and
Guangxi was analyzed by use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) and 8 arbitrary 10-base oligonucleotide primers. The
amplified fragments were 0.2-3.0 kb. A total of 786 well-replicated, clear and stable bands were amplified by use of the primer
CW38114. The results showed good DNA polymorphism between isolates. Four significant common bands were found between
260 and 650 bp in the amplification profile. However, between 650 and 3 000 bp showed large differences. The grouping analysis
showed all the isolates grouped in four clusters, and clusters I and III could be divided into two subgroups each. The genetic
variation differed by provinces: Hainan > Guangxi > Gunagdong. These isolates also showed parasitic specialization to some
extent.
Key words Colletotrichum gloeosporioides, RAPD, Stylosanthes spp
Shi XQ, Song HC, Zhang X, Yi KX (2007). Genetic diversity analysis of Colletotrichum gloeosporioides from stylos in Hainan, Guangdong
and Guangxi with use of random-amplified polymorphic DNA. Chin Bull Bot 24, 173-180.
* Author for correspondence. E-mail: yikexian@21cn.com
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(责任编辑: 白羽红)