全 文 ：植物学通报 2004, 21 (3): 319~325
Chinese Bulletin of Botany
①教育部留学回国人员科研启动基金，资助优秀年轻教师基金和国家自然科学基金(39970079)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail:wangxj@scnu.edu.cn
收稿日期：2003-09-08 接受日期：2004-01-15 责任编辑：白羽红
绿豆下胚轴质膜微囊的提取和
H+-ATPase活性研究①
文 彬 宾金华 潘瑞炽 王小菁②
（华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室 广州 510631）
摘要 以两相法提取纯化绿豆下胚轴质膜微囊，材料与两相体系重量之比为32∶8时，一次洗膜就可
以得到纯度较高的质膜微囊。提取缓冲液中牛血清白蛋白的浓度对质膜H+-ATPase的潜在活性有影响。
质膜H+-ATPase水解活性依赖于Mg2+，Ca2+对酶活性有明显的促进作用。壳梭孢素（fusicoccin, FC）对
酶有明显的刺激作用，活体条件最大刺激达到72％，而离体条件下刺激为30％。
关键词 绿豆下胚轴, 质膜H+-ATPase，Mg2+，Ca2+，FC
Isolation of Mung Bean Plasma Membrane Vesicles and the
Analyses of Hydrolysis Activity of PM H+-ATPase
WEN Bin BIN Jin-Hua PAN Rui-Chi WANG Xiao-Jing②
(College of Life Science, South China Normal University, Guangdong Key Lab for Plant
Development and Biotechnology, Guangzhou 510631)
Abstract The aqueous two-phase partition method was used to isolate and purify plasma membrane
(PM) vesicles from mung bean hypocotyls. The PM vesicles were purified well when the proportion
of the weight of hypocotyls and two-phase partition reached 32:8. Bovine serum albumin in homog-
enization medium influenced the latency activity of the PM H+-ATPase. The enzyme hydrolysis
activity was Mg2+ dependent and was strongly stimulated by Ca2+. Fusicoccin (FC), an activator of
PM H+-ATPase, stimulated the enzyme activity with the maximal increase of 72% in vivo and of 30%
in vitro as compared with control.
Key words Mung bean hypocotyls, Plasma membrane H+-ATPase, Mg2+, Ca2+, FC
质膜（plasma membrane，PM）在植物细胞中执行着复杂而重要的功能，是细胞质与
外界环境之间的屏障，也是物质运输、能量转换和信息传递的重要场所。提取细胞质膜的方
法主要有两相分配法和蔗糖梯度法（Kjellbom and Larsson，1984；Moller et al.，1984；
Sommarin et al.，1985； Rochester et al.，1987）。两相分配法是根据不同生物膜囊泡具有
不同的表面性质，在亲水聚合物水溶液的不相溶两相中分配系数不同，从而达到分离纯化的
目的。不同的材料、匀浆液的配比、离心的时间和速度、两相体系所含的聚合物浓度、盐
组分、介质的 pH、离子强度以及被分离材料的量等都会直接影响所提质膜微囊的纯度、产
320 21(3)
率、膜上酶的活性及膜的类型和性质（Sandelius and Morré，1990）。我们以绿豆下胚轴为
材料，对两相分配法提取纯化质膜微囊的一些条件进行了比较，初步研究了影响质膜 H+-
ATPase 水解活性的因素，并对质膜 H+-ATPase激活剂（activator）壳梭孢素（fusicoccin,
FC）在活体（in vivo）和离体（in vitro）条件下影响酶活性进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 实验材料及药品
市场所购当年收获的绿豆（Vigna radiata L.）种子，自来水流水冲洗 4 h，蒸馏水冲
洗两遍，于 25℃黑暗条件下萌发 72 h，取黄化幼苗弯钩下 1~2 cm下胚轴提取并纯化质膜。
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)-10、PEG3350、FC和ATPNa2 购自 Sigma 公司；Dextran T500 购
自瑞典Amersham Pharmacia Biotech 公司；b-巯基乙醇购自瑞士 Fluka公司；Na3VO4为Sigma
试剂；Brij58为 Sigma 试剂；EGTA（乙二醇双乙胺醚 -N，N四乙酸）和MES（2-（N-
吗啉）磺酸乙烷）购自日本ナカライテワ株式会社；其余试剂均为国内生产的分析纯试剂。
1.2 质膜的提取
参照 Sandelius和Morré(1990)的方法。取黄化绿豆下胚轴，以 1 g材料 2 mL的比例加入
提取缓冲液（5 mmol.L-1 EGTA，1 mmol.L-1 PMSF，25 mmol.L-1 Tris-Mes，0.25 mol.L-1蔗
糖，1 mmol.L-1 MgSO4，0.2% (W/V)BSA，0.5% (W/V)PVP-10，10% (W/V)甘油，2 mmol.
L-1 ATPNa2，15 mmol.L-1β -巯基乙醇，1 mmol.L-1 DTT），冰浴研磨过滤，滤液在 4℃
下 12 000× g离心 15 min，取上清液，于 4℃下以 80 000× g 离心 30 min，取沉淀，加入 1
mL悬浮缓冲液(25 mmol.L-1 Tris-Mes，0.25 mol.L-1蔗糖，0.2% (W/V)BSA，1 mmol.L-1 DTT，
10% (W/V)甘露醇)，将悬浮液加入二相系统（8 g两相系统的配比为: 1.37 g 蔗糖， 0.0024 g
DTT， 1.8 mL H2O， 50 mmol.L-1 KCl 0.4 mL，1.3 g PEG3350，2.6 g Dextran T-500，200
mmol.L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液 0.4 mL），上下摇匀 40次，4℃下以 4 200× g 离心 5 min，取
上相和下相继续进入两相系统，分离 3次后合并上相，稀释 3~5倍，4℃下以 80 000× g离
心 30 min，沉淀加入 1~2 mL保存缓冲液，悬浮并分装，迅速放入液氮中，然后放入-70℃
冰箱中保存。
1.3 蛋白质含量的测定
参照Bradford (1976)的方法以及李琳和焦新之（1980）的考马斯亮蓝G-250染色法。以牛
血清白蛋白(BSA)作为标准样品作标准曲线。
1.4 质膜H+-ATPase 水解活性的测定
采用Ames的钼蓝法（1966），以质膜H+-ATPase水解ATP所释放的无机磷量来表示酶
的活性。取质膜膜蛋白 20~60 mg，加入酶反应液（30 mmol.L-1 pH 7.0 Tris-Mes, 50 mmol.L-1
KCl, 3 mmol.L-1 MgSO4, 50 mmol.L-1 NaNO3, 0.1 mmol.L-1 Na2MoO4, 10 mmol.L-1 NaN3, 100
mmol.L-1 Na3VO4, 3 mmol.L-1 ATPNa2），以加入ATPNa2时开始计时，在 37℃恒温下反应 30
min后, 加入l0% SDS 200 mL终止反应, 加入1 mL显色液 (1 gVt C，0.25 g (NH4)2MoO4 ，1.72 mL
H2SO4，加水定容至 70 mL)，以日本岛津（Shimadzu UV-2100）分光光度计测OD820值，计
算酶活性（酶活单位为 mmolpi.mg-1protein.min-1）。K+、Mg2+、Ca2+影响的实验中，将不
同浓度的MgCl2、 KCl 和CaCl2加入酶反应液中。
3212004 文 彬 等：绿豆下胚轴质膜微囊的提取和H+-ATPase活性研究
1.5 FC对酶活性的影响
活体（in vivo）实验：用 10 mmol.L-1浓度的 FC处理在 25℃、黑暗条件下培养的 3 d龄
幼苗，5 h后切取弯钩下 1~2 cm下胚轴提取质膜，将质膜微囊加入酶水解活性检测反应体系
中，以上述方法测定质膜 H+-ATPase水解活性的变化。离体（in vitro）实验：取暗培养
3 d龄的黄化幼苗下胚轴提取质膜微囊，将质膜微囊加入含有10 mmol.L-1 FC的酶反应体系中，
温育 2 h后，以上述方法测定 H+-ATPase的水解活性。酶反应体系的 pH值为 7.0。
2 实验结果
2.1 绿豆下胚轴质膜的分离和纯化
以不同细胞器膜上ATPase或其他标志酶的抑制剂进行处理，检测质膜微囊的纯度。表1a
和表 1b分别是取绿豆下胚轴重量（g）与两相体系重量(g)之比为 50:8和 32:8所获得的结果。
U1、U2和 U3分别是第 1次、第 2次和第 3次进入两相系统洗膜后的上相组分。结果表明，
当绿豆下胚轴与两相系统的配比为50:8时，U1对钒酸钠的敏感程度为54.8%，U2对钒酸钠的
敏感程度可达 71.5%，U3对钒酸钠的敏感程度可达 72%; 与之相比，32:8配比时，U1对钒酸
钠的敏感程度可达 69％，且 U1、U2和 U3对其他各抑制剂的敏感程度都差异不大。
2.2 BSA对酶活性的影响
在下胚轴匀浆缓冲液中分别加入 0.2%和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA），在酶反应液中加
入TritonX-100和 Brij58两种去垢剂检测质膜的类型及ATPase的相对潜在活性。ATPase是质
膜内在蛋白之一，它与 ATP的结合位点在质膜的胞质一侧，而质膜对ATP是不可通透的，
加入Brij58可以破碎质膜，而加入TritonX-100可以使膜透性增加，底物和ATP可以自由通透，
表 1a 下胚轴重量与两相体系重量为 50:8配比条件下质膜微囊的纯度
Table 1a Purification of plasma membrane (PM) vesicles in 50:8 system
H+-ATPase activity (mmol pi.mg-1 protein.min-1) (Inhabition %)
处理 Treatment
U1 U2 U3
对照 Control 1 . 5 1 ± 0 . 0 5 7（0 . 0） 2 . 1 0 ± 0 . 0 9 7（0 . 0） 2 . 1 2 ± 0 . 0 1 0 3（0 . 0）
Na3VO4(10 mmol.L-1) 0.68± 0.031(54.8) 0.60± 0.023(71.5) 0.60± 0.022 (72.0)
Na2MoO4 (100 mmol.L-1) 1.44± 0.061(4.5) 2.06± 0.098(2.0) 2.08± 0.084 (1.6)
NaN3(10 mmol.L-1) 1.47± 0.059(2.8) 2.06± 0.102(2.1) 2.08± 0.101(2.0)
NaNO3(50 mmol.L-1) 1.38± 0.043(8.8) 2.04± 0.082(1.8) 2.07± 0.092(2.4)
抑制率（%）=〔(总活性-加入抑制剂后活性）/ 总活性〕× 1 0 0 %
Inhibition（%）=〔(Activity(-inhibitor)-Activity(+inhibitor)）/Activity(-inhibitor)〕× 100%
表 1b 下胚轴重量与两相体系重量为32:8配比条件下质膜微囊的纯度
Table 1b Purification of PM vesicles in 32:8 system
H+-ATPase activity (mmol pi.mg-1 protein.min-1) (Inhabition %)
处理 Treatment
U1 U2 U3
对照 Control 1 . 1 6 ± 0 . 0 4 2（0 . 0） 1 . 3 0 ± 0 . 0 5 1（0 . 0） 1 . 4 4 ± 0 . 0 5 5（0 . 0）
Na3VO4(10 mmol.L-1) 0.36± 0.010(69.0) 0.38± 0.011(71.0) 0.40± 0.014(72.5)
Na2MoO4 (100 mmol.L-1) 1.12± 0.039(2.7) 1.27± 0.057(2.1) 1.42± 0.061(1.7)
NaN3(10 mmol.L-1) 1.12± 0.041(2.7) 1.27± 0.052(1.7) 1.42± 0.07(1.6)
NaNO3(50 mmol.L-1) 1.13± 0.033(2.4) 1.27± 0.057(2.1) 1.25± 0.059(2.1)
抑制率（%）=〔(总活性-加入抑制剂后活性）/ 总活性〕× 1 0 0 %
Inhibition（%）=〔(Activity(-inhibitor)-Activity(+inhibitor)）/Activity(-inhibitor)〕× 100%
322 21(3)
使酶活性增加约65％；0.02％的TritonX-
100可使酶活性提高60％左右；而当BSA
用量为0.2%时，Brij58和TritonX-100对
酶活性的影响较小（表 2）。
我们的实验说明, BSA对膜的渗透性
及微囊的致密性影响很大，在较高的
BSA浓度下，获得的质膜微囊的致密性
较好，因此加入Brij58和TritonX-100后，
表现出具有较高 ATPase潜在活性。
2.3 质膜H+-ATPase 的基本特性
从图 1~图 3和表 3可以看到，（1）
酶活性的最适 p H 值为 7 . 0（图 1），
35~37℃范围内酶的活性最高（图 2）；
（2）绿豆下胚轴质膜H+-ATPase活性依
表 2 BSA对质酶H+-ATPase水解活性的影响
Table 2 The effect of BSA on PM H+-ATPase hydrolysis activity
BSA Brij58 (0.0125%) Triton X-100(0.02%)
Concen-
- +
Latency
- +
Latency
tration activity (%) activity (%)
0.2% 0.850± 0.042 0.967± 0.039 13.7± 0.57 0.578± 0.032 0.706± 0.033 18.1± 0.089
0.5% 1.094± 0.051 1.833± 0.091 67.5± 2.9 1.017± 0.049 1.644± 0.063 61.7± 3.1
潜在活性( % ) =［（+）B S A 酶活性-（-）B S A 酶活性］/（-）B S A 酶活性
Latency activity (%)=［Activity（+BSA）-Activity (-BSA)/Activity（-BSA)］× 100%
图 1 pH对绿豆下胚轴质膜H+-ATPase活性的影响
Fig.1 The influence of pH on the hydrolysis
activity of PM H+-ATPase
图 2 温度对绿豆下胚轴质膜H+-ATPase活性的影响
Fig.2 The influence of temperatures on the hydrolysis activity
of PM H+-ATPase
赖于Mg2+，K+对酶活性有一定的刺激
作用；只有当Mg2+存在时，酶表现
出较强的活性；没有Mg2+的情况下，
酶活性较低，且随着K+浓度的增加，
酶的活性并不增加，始终处于较低水
平；K+存在时，酶活性随Mg2+浓度
的增加而增加，在Mg2+达到 3 mmol.
L-1时，酶活性达到最高值；并且 K+
和Mg2+之间有一定的协同作用，二者
都存在的情况下，酶的活性最高（表
3）；（3）Ca2+对质膜 H+-ATPase水
解活性有明显刺激作用，浓度为 7
mmol.L-1和70 mmol.L-1时的刺激作用最
使ATPase活性增加，所增加的部分就是ATPase的潜在活性（Sandelius and Morré，1990）。
实验表明，当BSA用量为0.5%时，酶活性受Brij58和TritonX-100影响很大，0.0125％的Brij58
3232004 文 彬 等：绿豆下胚轴质膜微囊的提取和H+-ATPase活性研究
经过对活体和离体条件下FC处理后酶活性
变化时间进程的比较（结果未列出），发现 FC
对质膜H+-ATPase水解活性有明显的刺激作用。
活体条件下，10 mmol.L-1处理的下胚轴质膜酶
活性比对照增加 72%；离体条件下，酶活性只
增加 3 0 % 左右（图 4）。
3 讨论
两相分配法具有重量依赖性，两相系统的
重量决定了这一系统可以乘载多少质膜微囊体以
及纯化质膜时需要洗几次。对不同的植物来
说，材料与两相系统的重量之比也可能存在一
定的差别。邱全胜和苏雪峰（1999）认为，当
质膜H+-ATPase对钒酸钠的敏感程度达到 60%
表 3 不同浓度K+和Mg2+对质膜H+-ATPase水解活性的影响
Table 3 The effect of different concentrations of K+and Mg2+ on PM H+-ATPase hydrolysis activity
H+-ATPase活性(mmol pi.mg-1protein.min-1)
Mg2+ K+
0 mmol.L-1 1.5 mmol.L-1 3 mmol.L-1 4.5 mmol.L-1
0 mmol.L-1 0.444± 0.019 0.694± 0.031 0.778± 0.034 0.776± 0.031
25 mmol.L-1 0.550± 0.021 0.733± 0.033 0.789± 0.022 0.783± 0.029
50 mmol.L-1 0.483± 0.020 0.756± 0.029 0.850± 0.038 0.853± 0.037
图 3 Ca2+对质膜H+-ATPase水解活性的影响
Fig.3 The effect of Ca2+ on PM H+-ATPase hy-
drolysis activity
图 4 活体与离体条件下 FC对质膜H+-ATPase水解
活性影响比较
Fig.4 The effect of FC on PM H+-ATPase hydrolysis
activity under in vivo and in vitro experiments
时，细胞质膜的纯度就可达到较高水平。
从本实验的研究结果来看，50:8和32:8的配
比对本实验材料来说都是适用的，用 32:8
配比的两相系统一次洗膜就可以获得纯度较
高的质膜。
早期对质膜 H+-ATPase的研究发现，
K+可以刺激质膜H+-ATPase活性，K+的刺
激作用反映在对阳离子运输过程的促进
（Leonard,1982）。对大麦、燕麦、玉米
和小麦等质膜进行研究发现，K+对ATPase
的刺激作用与这些作物根吸收K+的速率有
关(Leonard, 1982; Briskin and Hanson, 1992)，
Sekler等（1991）的研究也表明K+是质膜
H+-ATPase水解活性所必需的。但也有一
强，酶水解活性比对照增加近一倍(图3)。
2.4 FC对质膜H+-ATPase 的影响
324 21(3)
些研究表明，质膜H+-ATPase活性与它介导的K+运输之间有不一致性（Briskin and Hanson，
1992）。我们的实验表明，K+ 对绿豆下胚轴质膜H+-ATPase水解活性有促进作用，但不是必
须的，而Mg2+ 为H+-ATPase水解活性所必需。Kauss等（1983）认为胞外高浓度的 Ca2+具
有双重作用：一是维持膜结构的稳定性；另外是作为“Ca2+库”参与信号转导。邱全胜等
（1997）的研究发现跨膜Ca2+梯度对大豆下胚轴质膜H+-ATPase的水解活性的影响较小，而
对质子泵活性有较大的影响。Kinoshita等（1995）发现 1mmol.L-1 Ca2+可以抑制保卫细胞质
膜H+-ATPase水解活性，从而导致气孔的关闭。我们的实验表明， Ca2+对质膜H+-ATPase 水
解活性有明显的刺激作用，浓度为 7μmol.L-1时刺激作用最大，酶水解活性比对照增加近一
倍。这一现象的原理还有待进一步深入研究。
壳梭孢素（FC）是质膜H+-ATPase的激活子,也是研究H+-ATPase作用机制的有效工具
（Olsson et al., 1998；文彬等，2001）。根据实验材料的不同，FC对活体和离体条件下酶
活性的影响程度不同（Lanfermeijer and Prins,1994）。我们的实验证实，对绿豆下胚轴质膜
微囊来说，FC对活体条件下酶活性的促进作用比离体条件下高两倍多，这意味着活体细胞质
中的某些因子对激活酶的活性是必需的。对这种现象的解释还需进一步的研究。
参 考 文 献
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