全 文 ：植物学通报 2005, 22 (4): 426~431
Chinese Bulletin of Botany
①重庆市教委科学技术研究项目(11807)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: wannengw@cqit.edu.cn
收稿日期: 2004-07-29 接受日期: 2004-09-23 责任编辑: 崔郁英, 于昕
实 验 简 报
烟草内生细菌防治烟草黑胫病及
促生作用研究①
1王万能② 1全学军 2肖崇刚
1 (重庆工学院生物工程学院 重庆 400050) 2(西南农业大学植保学院 重庆 400716)
摘要　 筛选烟草内生细菌防治烟草黑胫病, 获得了对烟草黑胫病有很好防效的内生细菌118、57和93等
菌株。在温室控病实验中它们的防效分别可达69 .23%、61 .53%和65 .38%。1 1 8菌株对烟草疫霉
(Phytophthora parasitica var. nicotianae)菌丝生长有明显的拮抗作用。118菌株具有较广的抗菌谱, 且对
烟草有促生效果, 烟草的鲜重增产率为13.10%。
关键词　 烟草黑胫病, 内生细菌, 生物防治
The Disease-controlling and Growth-promoting Effects of
Endophytic Bacteria in Tobacco
1WANG Wan-Neng② 1QUAN Xue-Jun　2XIAO Chong-Gang
1 (Department of Bioengineering, Chongqing Institute of Technology, Chongqing 400050)
2(College of Plant Protection, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716 )
Abstract Endophytic bacteria presented in plants can stably develop and propagate. Tobacco
black shank (Phytophthora parasitica var. nicotianae) is a severe disease of tobacco. We selected
endophytic bacteria to control tobacco black shank and obtained strains 118, 57 and 93. Their control
effects were 69.23%, 61.53% and 65.38% in the greenhouse, respectively. Strain 118 can restrict the
growth of hypha of P. parasitica var. nicotianae . Furthermore, strain 118 can restrain the growth of
several main pathogenetic fungi of tobacco on plates and can promote the growth of tobacco.
Key words Tobacco black shank, Endophytic bacteria, Biocontrol
烟草黑胫病(Phytophthora parasitica
var. nicotianae)是烟草(Nicotiana tabacum)
上主要的毁灭性病害, 从苗期到成株期都可发
生。生产上对烟草黑胫病的防治主要以化学
防治为主, 但是化学防治难以长期持续有效,
还严重污染环境。
利用有益微生物防治植物病害既持续有效,
又保护环境, 是近年来的研究热点。已经报道
的烟草黑胫病的生物防治主要是利用从根围分
离的真菌和细菌, 但由于定殖差, 受环境条件制
约, 防效难以稳定(单卫星, 1992)。
植物内生细菌分布于植株体内, 生长繁殖
4272005 王万能等: 烟草内生细菌防治烟草黑胫病及促生作用研究
相对稳定, 是很好的生防菌资源(孔庆云, 2001),
美国Georgia大学研究发现, 水稻(Oryza sativa)
种内生细菌对水稻丝核菌表现很强的体外拮抗
活性, 可作为生防制剂能够保护水稻幼苗或保护
其他作物免受真菌病害(Cindy and Jaco, 2002)。
傅正擎等(1999)从棉株内分离到的内生细菌
73a对棉花(Gossgpium hirsutum)黄萎病的
防效在 70%以上, 并对其防病机制作了研
究 , 发现其有促生作用。
内生细菌的促生作用如植物根际促生细菌
一样, 可以产生植物促生物质, 直接促进植物生
长。如从墨西哥分离到的 18株重氮营养醋杆
菌在与植物相互作用中不仅固氮, 而且可以直接
作用于植物的代谢, 促进植物生长。
目前, 内生细菌对病害生物防治和植物
促生作用主要在水稻、棉花、玉米 ( Z e a
mays)和蔬菜上有一些研究, 在烟草上尚未
见报道。
1 材料与方法
1.1 供试品种
烟草(Nicotiana tabacum) ‘K326’由云南省
烟草科学研究院提供。
1.2 供试菌株
烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.
nicotianae)、小麦纹枯病病菌(Rhizoctonia
c e r e a l i s )、茄褐纹病病菌( P h o m o p s i s
v e x a n s )、棉花立枯病病菌( R h i z o c t o n i a
solani)、烟草灰霉病病菌(Botrytis cicerea)、
烟草炭疽病病菌(Collectotrichum nicotianae)、
玉米小斑病病菌(Bipolaris maydis)、烟草赤星
病病菌(Alternaria alternata)和棉花黄萎病病菌
(Verticillium dahliae)由西南农业大学植物生态
病理研究所提供。
内生细菌由本实验室从采自四川省开江县
和重庆市綦江县的健康烟株的根、茎、叶中
分离所得。
2 实验方法
2.1 烟苗培育
育苗移栽于装有砂壤土的塑料钵中, 每钵1
株, 塑料钵的体积为0.21 cm3。 温室培养, 20~26
℃温室中光照(日光灯, 4 500 lx, 12小时/天)培
养, 相对湿度70%~80%。培养烟苗至4~6叶期
待用。
2.2 烟草内生细菌的分离
烟草内生细菌的分离方法参照刘云霞
(1997)的方法。
2.3 平板筛选
采用平板对峙培养法。初步筛选, 在芝麻
蛋白胨培养基平板上作对峙实验, 平板中心接种
烟草疫霉, 菌块d=0.4 cm , 周围对称接种待测内
生细菌4个菌株, 距中心2.5 cm, 每个菌株重复
3次, 3天后观察有无抑菌带并记录。对有抑菌
作用的菌株在芝麻蛋白胨培养基平板上再次筛
选, 平板中心接种烟草疫霉, 菌块d=0.4 cm, 两
边对称接种待测内生细菌菌株, 蘸取菌悬液在距
中心 2.5 cm处各划一条直线, 每个菌株重复 3
次, 3天后测抑菌带宽, 记录并统计。
2.4 温室控病实验
2.4.1 内生菌的培养和施用 调整菌液浓度
为1.0×108 cfu.mL-1, 每次每株施10 mL, 灌根。
2.4.2 病原菌的培养 病原菌的培养方法见
Gooding和 Lucas (1959)。
2.4.3 4~6叶期烟苗温室控病试验 1)温室
盆栽控病试验初测。 对平板抑菌效果较好
的菌株 50、57、80、88、93、96及 118作
温室盆栽控病实验。烟苗移栽时和接种病原
菌前18天分别施一次待测菌, 菌量、浓度及方
法见2.4.1节, 对照施等量清水, 每个处理3次重
复, 每个重复12株。烟草疫霉接种为灌根接种,
接种前用少量清水湿润土壤, 每株接种10 mL菌
液, 灌根。20 ℃黑暗处理接种烟苗24小时, 之
后28 ℃保持光照(日光灯, 4 500 lx, 16 小时/天),
428 22(4)
表 1 平板筛选结果
Table 1 Selection on plates
Strains Isolation Inhibition Width of inhibition
parts effects zone (mm)
43 R ＋ 4
46 R ＋ 5
50 R ＋ 6
57 R ＋ 8
73 R ＋ 4
80 R ＋ 6
88 R ＋ 6
93 R ＋ 10
96 R ＋ 6
97 S ＋ 4
102 R ＋ 3
104 R ＋ 5
118 S ＋ 8
注: R. 分离自根部; S. 分离自茎部; ＋. 有抑菌带. 无抑菌
作用菌株未列出
Note: R. Isolated from root; S. Isolated from stem; +.
Inhibition effect. The no effective strains are not listed.
相对湿度 80%~90%。7 天后调查病情, 0级为
植株不发病, I级为植株死亡。根据试验结果,
筛选出防效较好的菌株进一步作盆栽试验。
2 )不同施菌方式对控病作用的影响。对控
病效果较好的 57、93、118菌株进行 3种不
同施菌方式的控病试验, 每个处理3次重复, 每
个重复12株。第1种施菌方式(W1): 移栽时施
一次待测菌; 第2种施菌方式(W2): 移栽时施一
次待测菌, 接种病原菌前18 天和7 天各施一次
待测菌; 第3种施菌方式(W3): 移栽时施一次待
测菌, 接种病原菌前18 天、1 天各施一次待测
菌。每次施菌的菌量、浓度及方法如 2.4.1节;
对照施等量清水, 移栽30天后接种烟草疫霉, 为
灌根接种, 方法见 2.4.3的 1)节。
2.5 菌株 118的抗菌谱测定
在马铃薯葡萄糖培养基上平板对峙培养
(见 2.3节), 28 ℃培养 4天后, 测抑菌带宽。
2.6 菌株 118的促生作用
选择培育15天、长势和大小一致的烟苗,
移栽于塑料钵中, 塑料钵的体积为0.21 cm3, 装
有等量的砂壤土, 每钵 1株烟苗。移栽时用浓
度为1.0×108 cfu.mL-1的118菌液浸5分钟, 对
照施用清水。分别设 3个重复, 每个重复 15
株。每10天施一次Hoaglands全营养液, 每钵
10 mL。25天后拔出烟苗洗净晾干称重,记录并
处理数据。
2.7 菌株的鉴定
对防效较好的 118、57和 93菌株按《常
见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)进行鉴
定, 确定其属的分类地位。
3 结果与分析
3.1 烟草内生细菌的分离结果
通过分离、培养、纯化、转管及保存,
从烟草根、茎和叶中共获得238个内生细菌菌
株。其中从根部分离到 138个内生细菌菌株,
从茎部分离到75个内生细菌菌株, 从叶部分离
到 25个内生细菌菌株。
3.2 平板对峙拮抗试验结果
从分离的238个内生细菌菌株中筛选出13
个菌株对烟草疫霉有平板拮抗作用, 占总数
5.5%。在本试验中, 这些拮抗菌都是分离自烟
草根部、茎部的内生细菌, 而无一株是分离自
叶部, 拮抗菌的最大抑菌带宽为10 mm, 最小抑
菌带宽为 3 mm(表 1, 图 1)。
3.3 温室控病试验
在温室防治测定中, 施用内生细菌后烟苗
没有出现任何病症, 生长正常, 个别菌株施用后,
烟苗生长势优于对照。
在 4~6叶期烟苗温室控病实验初测中, 在
平板上抑菌效果较好的 57、93及 118三个菌
株防效较好, 防效分别为 30.00%、36.66%及
46.66%(表 2)。
在3种不同的内生菌施用方式中, 第2种施
菌方式控病效果最好, 57、93及118三个菌株
防效分别为61.53%、65.38%和69.23%(表3)。
其余 2种施菌方式防效较差。第 1和第 2种施
菌方式中处理比对照晚1~2 天发病, 而第3种施
菌方式中处理与对照同时开始发病。虽然第3
种施菌方式中比第1种施菌方式多施两次待测
4292005 王万能等: 烟草内生细菌防治烟草黑胫病及促生作用研究
图1 平板对峙试验示烟草内生菌株118对烟草疫霉(Phytophthora paresitica var. nicotianae)的拮抗作用
Fig. 1 Pairing culture on plate showing the endophytic bacteria strain 118’s cotrolling effect to Phytophthora
paresitica var. nicotianae
表 2 4~6叶期烟苗温室控病试验初测
Table 2 Greenhouse tests on tobacco with 4-6 pieces of leaves
Strains Total plants Disease plants Disease index
Control efficacy Significant difference
(%) 0.05 0.01
Control 36 30 83.33 0 a A
57 36 21 58.33 30.00 bc BC
118 36 16 44.45 46.66 d C
93 36 19 52.78 36.66 d BC
50 36 24 66.67 19.99 b B
96 36 25 69.45 16.65 b AB
88 36 22 61.11 26.67 bc B
80 36 25 69.45 16.65 b AB
表 3 不同施菌方式温室控病试验结果
Table 3 Control efficiencies of different test ways in greenhouse
Test way Strains Total plants Disease plants Disease index Control efficacy Significant difference
(%) 0.05 0.01
Control 36 26 72.22 0 a A
57 36 20 55.55 23.08 b AB
W1 group 93 36 20 55.55 23.08 b AB
118 36 18 50.00 30.77 b B
57 36 10 27.78 61.53 c C
W2 group 93 36 9 25.00 65.38 c C
118 36 8 22.22 69.23 c C
57 36 18 50.00 30.77 b B
W3 group 93 36 17 47.22 34.62 b B
118 36 19 52.78 26.92 b B
菌, 但防效差异不大, 而且发病较早。第2和第
3种施菌方式中施菌次数一样, 但由于第3种施
菌方式中最后一次施菌是在接种病原菌前一天
施用内生菌, 防效反而降低。以菌株 57为例,
两种施菌方式中其防效分别为 61.53%和
30.77%, 表明在温室试验中, 不同施菌方式下, 控
430 22(4)
表 5 菌株 118的促生作用
Table 5 The growth-promoting effect of strain 118
Strain Plants Fresh weight Average fresh weight Increase rate Significant difference
(g) (g) (%) 0.05 0.01
Control 15 2.51
15 2.53 2.52 0 b B
15 2.53
118 15 2.83
15 2.85 2.85 13.10 a A
15 2.86
病效果不同。
3.4 菌株 118的抗菌谱测定
在PDA平板上, 菌株118能抑制小麦纹枯
病病菌、茄褐纹病病菌、棉花立枯病病菌、
烟草灰霉病病菌、烟草炭疽病病菌、玉米小
斑病病菌、烟草赤星病病菌、棉花黄萎病病
菌和烟草疫霉病菌生长, 产生抑菌带。实验结
果表明菌株118的抗菌谱较广, 对几种烟草主要
病害病原菌都有不同程度的拮抗作用(表 4)。
3.5 菌株118的促生作用
菌株 118对烟草有明显的促生作用, 鲜重
增产率为13.10%。在a=0.05和a=0.01水平上,
菌株118处理植株鲜重与对照相比, 都呈显著差
异(表 5)。
3.6 菌株鉴定结果
按《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等,
2001)进行鉴定, 确定118、57菌株属的分类地
位为芽孢杆菌属(Bacillus), 93菌株属的分类地
位为假单孢杆菌属(Pseudomonas)。
4 讨论
本实验中筛选出的内生细菌, 在温室生物
防治测定中对烟草黑胫病有明显的防治作用, 防
效较好。
Andrews(1992)认为植物内生细菌可以系统
分布于植物组织内, 植物组织有足够的碳源和氮
源, 具有良好的生存环境, 克服了以往从根围促
生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,
PGPR)中筛选的生防菌定殖差和受环境影响大
的缺点。内生细菌能够受到植物的保护, 比暴
露于强烈的日光、紫外光及暴风雨等恶劣环
境的附生细菌有更稳定的生存环境, 而且与植物
长期共生, 可以缓解寄主植物的防卫反应作用,
更易于内生细菌发挥作用, 作用更稳定持久。
本实验中有较好抑菌和防病效果的菌株
118、93和57等内生细菌都是分离自烟草根茎
部, 无一是分离自叶部, 此结果符合微生态学原
理。微生态系统中的微生物用于生物防治, 由
于它本身是微生态系统中的组成成分, 有利于其
本身的定殖和发挥作用(陈涛, 1996)。烟草黑胫
病是主要发生在根茎部的病害, 在根茎部很可
能分离到对烟草黑胫病控制效果较好的内生细
菌, 从而起到更好的生物防治效果。
待测菌的施菌方式不同, 防治效果不同。
以菌株118为例, 3种施菌方式中防效分别为
30.77%、69.23%和 26.92%。第 2种施菌方式
表 4 菌株 118的抗菌谱
Table 4 Pairing culture strain 118 with pathoge-
netic fungi
Strains Width of inhibition zone (cm)
Rhizoctonia cerealis 1.23
Phomopsis vexans 1.13
Rhizoctonia solani 0.80
Botrytis cicerea 1.00
Collectotrichum nicotianae 0.83
Bipolaris maydis 0.88
Alternaria alternata 0.75
Verticillium dahliae 0.90
Phytophthora parasitica var. 1.10
nicotianae
4312005 王万能等: 烟草内生细菌防治烟草黑胫病及促生作用研究
参 考 文 献
防效较高, 这可能与待测菌在烟草体内定殖、
繁殖和转移情况有关, 因此在实际生产中施用内
生细菌必须选择适当的方式。
菌株 118的抗菌谱较宽, 对几种主要烟草
病害病原菌都有直接的拮抗作用, 可进一步试验
此菌对其他烟草病害的防治作用。菌株118较
广的抗菌谱为该菌应用于烟草病害综合生物防
治中成为可能。
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内生细菌用作生防菌是一个较新的研究领
域, 利用烟草内生细菌防治烟草黑胫病, 能提高
生防效果, 促进植物生长, 保护环境。本试验
中菌株 118的定殖能力、大田防效、代谢产
物和发酵条件等方面有待进一步深入研究, 研
究结果将为其以后进一步应用于生产打下基础
和创造条件。