全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (5): 585-590, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-12-25; 接受日期: 2008-02-25
基金项目: 863计划(No.2006AA 100108)和河北省自然科学基金(No.C2004000739)
* 通讯作者。E-mail: congph@163.com
.技术与方法.
无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变
蛋白质变化规律中的应用
田义 1 , 张新忠2, 张志宏3, 丛佩华 1*, 康国栋1
1中国农业科学院果树研究所, 兴城 125100; 2中国农业大学, 北京 100094; 3沈阳农业大学, 沈阳 110161
摘要 对无胶筛分毛细管电泳体系的筛分介质浓度、缓冲体系的离子强度、分离电压、进样量及温度等条件进行了优化, 最
终确定最佳分离条件为7.5% Dextran, 7.5%丙三醇, 0.15 m ol.L-1 TB, 0.1% SDS, 分离电压23.5 kV, 进样量1.5 ps i×90秒, 温
度25°C。应用此方法对金冠×红玉苹果杂种后代韧皮部蛋白质进行测定, 得到了多个与阶段转变相关的蛋白质, 在韧皮部50
节上, 有分子量为5.0 kDa的特异蛋白质出现, 分子量为24.5 kDa的蛋白质含量在阶段转变过程中明显升高。
关键词 苹果, 无胶筛分毛细管电泳, 阶段转变, 蛋白质
田义 , 张新忠 , 张志宏 , 丛佩华 , 康国栋 (2008). 无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变蛋白质变化规律中的应用. 植物学通报
25, 585-590.
毛细管电泳(capillary electrophores is, CE)是一种
新型电泳与色谱相结合的分离分析技术, 具有分离效率
高、分析速度快和样品用量少等特点, 被广泛应用于核
酸和蛋白质的分离(梁琼麟等, 20 03 ; 金良和甘莉,
2003)。无胶筛分毛细管电泳(non-gel sieving capillary
elec trophoresis, NGSCE)是多种毛细管电泳分离模式中
应用最为广泛的分离模式之一。常用的无胶筛分介质
主要为线形均聚物, 如线形聚丙烯酰胺(LPA)、聚 N,N-
二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙烯
吡咯烷酮(PVP)、纤维素及其衍生物等(周丹和王延梅,
2006)。 Ganz ler等(1992)应用 10% 葡聚糖(分子量为
2.0×106 kDa)为筛分介质, 0.06 mol.L-1 MAMPD-
CACO, pH 8.8 (含 0.1% SDS), 以及 3%(w/v) PEG
100 000、0. 1 mo l.L-1 Tr is -CHE S, pH 8. 8(含
0.1%SDS)为条件测定蛋白质分子量并获得了满意的结
果。Guttman (1996)以 3% PEO为筛分介质, 0.1 mol.
L-1 Tris -CHES, pH 8.8(含 0.1% SDS)为条件成功地测
定了蛋白质的分子量。国内学者廖海明等(1999 )、赵
京山等(2005)和张振中等(2000)尝试使用不同的缓冲液
进行了标准蛋白质分子量的测定。Nicholas 等(2002)
对从菠菜叶片提取的变性Rubisco进行了检测和定量分
析。汪俏梅和曾广文(1998)利用毛细管电泳法对苦瓜可
溶性蛋白质进行了分析, 发现了一些与性别分化有关的
特异蛋白质。鉴于添加剂在无胶筛分毛细管电泳分离
DNA中效果显著, 本研究将丙三醇作为添加剂, 在较低
的筛分介质浓度下取得了良好的分离效果。
1990年, Poethig (1990)在 Science上发表的文章
中明确提出, 将植物的个体发育划分为童期(j uven il e
phase)、成年营养生长期(adult vegetat ive phase)和生
殖生长期(reproduct ive phase)3个发育阶段; 植株由童
性(juvenil ity)到成年(adult)期的转变过程通常被称为阶
段转变(phase change)。个体发育除时间上存在差异
外, 在空间上也存在差异, 即进入成年阶段的整个树体的
不同高度 /节位在发育阶段上存在质的差异。张新忠和
束怀瑞(2004)、田义等(2006)对植物童性及调控以及阶
段转变的研究进展进行了综述。李春敏等(2 005 )和
Zhang等(2007)通过对苹果(Malus domestica)实生苗叶
片和韧皮部内多胺和多酚类物质的测定, 结合最低开花
节位, 确定80节和120节分别为童期向成年营养生长期
和成年营养生长期向生殖生长期转变的临界节位。
586 植物学通报 25(5) 2008
1 材料和方法
1.1 无胶筛分毛细管电泳条件的优化路线
(1)不同筛分介质浓度的优化: 10% Dextran, 7. 5%
Dext ran, 5% Dextran。(2 )电泳温度的优化: 20°C,
25°C, 30°C。(3)分离电压的优化: 21.2 kV, 23.5 kV,
25.8 kV。(4)进样量的优化: 1.0 psi×90秒, 1.5 psi×90
秒, 3.0 ps i×90秒。(5)缓冲液离子强度的优化: 0.075
mol.L-1, 0.1 mol.L-1, 0.15 mol.L-1。
1.2 苹果韧皮部蛋白质的分析
1.2.1 取样
以 2年生金冠×红玉(Golden Delic ious×Jonathan)杂种
实生苗60株为取样材料(河北省昌黎县), 分为2组(A1和
A2), 30株为 1个重复。参照 Zhang等(2007)副梢‘接
力’的取样方法, 自下而上 5节为 1个取样单位, 上部枝
条节位为主干节位与枝条自身节位之和, 相同节位混合
采样, 采后放入冰盒迅速带回实验室。将材料洗净后吸
干水分, 取叶片和韧皮部, 置液氮中速冻, 然后在冷冻干
燥机内冻干 30小时, 高速粉碎机粉碎后过 60目筛, 于
4°C 保存备用。
1.2.2 蛋白质的提取
称取 100 g样品, 加入 0.3 g聚乙烯聚吡咯烷铜(PVPP)
和 5 mL蛋白提取液(62.5 mmol.L-1 Tris -HCl, 10% 丙
三醇, 5% b-巯基乙醇, 0.5% SDS, pH 8.0), 充分涡旋,
4°C提取 1小时。然后 4°C 12 000 ×g离心 20分钟,
取上清液, 过 0.45 mm 滤膜。取 180 mL滤液,加入 20
mL的0.1%橙黄剂(orange green, OG), 沸水浴10分钟,
冰浴 3分钟, 0.5 ps i×30秒进样测定。电极缓冲液组成:
0.1 mol.L-1 Tris-Boric acid (TB), 10% 丙三醇, 5%
Dextran, 0.1% SDS(过 0.45 mm滤膜)。上机检测。
1.2.3 仪器和试剂
实验所用仪器为美国 Beckman公司 P/ACE MDQ型毛
细管电泳仪、二极管阵列检测器及 32karat数据分析系
统。毛细管为内径 75 mm 的聚丙烯酰胺涂层毛细管(中
国科学院大连化学物理研究所), 管长 47 cm, 至检测窗
口 37 cm。蛋白质标样为低分子量(14.4-97.4 kDa)标
准蛋白(中国科学院上海生物化学研究所监制)。Dextran
为 20 000T(美国 Pharmacia公司)。
1.2.4 数据分析
32karat数据处理系统自动生成数据, 根据迁移时间(结
合特征峰)对测定结果进行判断, 以便找到特异蛋白质
峰。以节位为横坐标, 以蛋白质的相对含量(蛋白质的
峰面积与内标OG峰面积的比值)为纵坐标作图, 分析蛋
白质含量的变化趋势。
2 结果与分析
2.1 无胶筛分毛细管电泳条件的优化
2.1.1 筛分介质浓度的优化
蛋白质标样在不同浓度筛分介质中的电泳结果如图 1所
示(横坐标表示标样蛋白组分到达检测窗口的时间, 纵坐
标表示蛋白质组分通过检测窗口时的吸收强度, 检测波
长为 214 nm)。
在筛分介质浓度为 10% Dextran(含10%丙三醇作
为添加剂)的条件下(图 1A), 基线不稳, 蛋白质峰的峰高
非常低, 有的蛋白质峰没有出现。其原因之一可能是由
于筛分介质浓度太大, 导致进样量小, 从而造成蛋白质峰
小。筛分介质浓度为 7.5% Dextran(含 7.5% 丙三醇)
的条件下(图1B), 基线平稳, 各组分实现基线分离, 分离
度良好, 具有较高的分离效率, 在30分钟内完成了对分
子量范围为 14.4-97.4 kDa的蛋白质标样的分离, 且标
样中的杂质峰很低。筛分介质浓度为5.0% Dextran(含
5.0%丙三醇)的条件下(图 1C), 基线平稳, 分离度较小,
标样中 6个组分之间的距离小于 8分钟, 这样可能会导
致将来样品中相近分子量的蛋白质不能被分离开。其
它电泳条件: 温度 25°C, 分离电压 23.5 kV, 进样量1.5
ps i×90秒。电极缓冲液的缓冲体系: 0.1 mol.L-1 TB,
0.1% SDS。样品为 6组分的小分子量蛋白质标样。标
样溶解液: 62.5 mmol.L-1 Tris-HCl, 10%丙三醇, 5%
b-巯基乙醇, 0.5%SDS。
587田义等: 无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变蛋白质变化规律中的应用
2.1.2 其它电泳条件的优化
在筛分介质浓度为 7.5% Dextran(含 7.5%丙三醇)基础
上(分离电压 23.5 kV, 进样量 1.5 ps i×90秒, 电极缓冲
液缓冲体系 0.1 mol.L-1 TB、0.1%SDS), 对 3个温度
(20°C、25°C和 30°C)梯度下的分离效果进行比较, 结
果表明随着温度的升高, 分离时间缩短, 分离度也随之降
低, 考虑到较高的温度可能会影响毛细管的使用寿命, 最
终选择 25°C。此后, 依次在前一个优化的分离条件下,
对分离电压(21 .2、23 .5 和 25. 8 kV )、进样量(1. 0
psi×90秒、1.5 psi×90秒、3.0 psi×90秒)、缓冲体
系(0.075 mol.L-1 TB、0.10 mol.L-1 TB和 0.15 mol.
L-1 TB)进行优化, 结果表明随着电压的升高和缓冲体系
离子强度的降低, 分离时间缩短。随着进样量的增大,
峰值变大, 但是当进样量达到 3.0 psi×90秒时, 峰基部
开始明显变宽。最后, 综合考虑基线稳定性、分离时
间、峰值及毛细管寿命等因素, 认为最佳分离条件为
7.5% Dextran, 7.5% 丙三醇, 0.15 mol.L-1 TB, 0.1%
SDS, 23.5 kV 分离电压, 进样量为 1.5 psi×90秒, 温
度 25°C。
2.2 韧皮部蛋白质的测定
在进行样品分析之前, 用优化的电泳条件测定蛋白质标
样, 制作蛋白质分子量标准曲线(图 2)。
应用优化的无胶筛分毛细管电泳条件对苹果韧皮部
蛋白质进行分析, 发现有一个5.0 kDa蛋白质在50节以
前缺乏, 而在 50 节以后出现(图 3)并一直存在。
对所有蛋白质峰面积进行积分, 将蛋白质峰面积与
内标峰面积对比, 发现分子量为 24.5 kDa 的蛋白质随
节位的升高其丰度明显增加(图 4)。在 70节左右其含量
有明显的上升, 在 120节以上, 其含量再次明显上升。
其发生规律与Zhang等(2007)利用多酚所测定的苹果阶
段转变蛋白质的结论基本一致。据此认为 5.0 kDa 和
图 1 筛分介质浓度对电泳结果的影响
(A) 10% Dextran; (B) 7.5% Dextran; (C) 5% Dextran
OG: 橙黄剂 ; 1-6分别代表分子量为 1 4. 4、2 0. 0、3 1. 0、
43.0、66.2和 97.4 kDa的蛋白质峰
Figure 1 Eff ec t of dif ferent concentrations of separation
matrix on elec trophores is
(A) 10% Dex tran; (B) 7.5% Dextran; (C) 5% Dextran
OG: Orange green; 1-6 stand for peaks of 14.4, 20.0, 31.0,
43.0, 66.2 and 97.4 kDa proteins respectively
图 2 蛋白质分子量标准曲线
RMT: 相对迁移时间
Figur e 2 The standard curve of protein molecular w eight
RMT: Relative migration time
A
B
C
588 植物学通报 25(5) 2008
24.5 kDa 蛋白质为阶段转变相关蛋白质。利用无胶
筛分毛细管电泳法进行阶段转变相关蛋白质的分析
简便可行。
3 讨论
3.1 无胶筛分毛细管电泳的优点与不足
本实验对无胶筛分毛细管电泳的分离条件进行了优化并
获得了较好的应用效果。与传统的 SDS-PAGE 相比,
无胶筛分毛细管电泳显示出了极大的优越性: (1)简单,
直接可以看到结果, 省去了制胶、染色和脱色等步骤;
(2)安全, 不必使用丙烯酰胺、TEMED等有毒药品, 且
药品用量少, 对环境污染小; (3)快速, 可在 30分钟内完
成对单个样品的检测并可以定量。本文通过对峰面积
比值(蛋白质峰面积与内标峰面积之比)的比较, 对苹果阶
段转变过程中未知蛋白质进行了半定量比较, 找到了在
阶段转变过程中定量变化的蛋白质。同时, 本研究将丙
三醇作为添加剂应用到蛋白质的分离中, 并且在较低的
葡聚糖浓度(7.5%)条件下获得了很好的分离效果, 比
Ganzler等(1992)和廖海明等(1999)所用浓度(10%葡聚
糖)降低了 25%。在利用无胶筛分毛细管电泳进行分离
DNA的研究中发现, 以羟丙基甲基纤维素为筛分介质分
离 DNA 时, 羟丙基甲基纤维素、硼酸和丙三醇之间形
成了络合物, 从而形成了不同孔径的网络, 进而提高了分
离度(周丹和王延梅, 2006)。本实验中所用的葡聚糖和
羟甲基纤维素均为长链并带有多个羟基的化合物, 加入
丙三醇之后分离效果得以提高的机理可能与羟甲基纤维
素的机理相同, 在葡聚糖、硼酸和丙三醇之间形成络合
物, 形成不同孔径的网络, 使分离度得以提高。
然而, 无胶筛分毛细管电泳在具备了以上一系列优
点的同时, 也存在一些问题。首先, 仪器价格昂贵, 使
毛细管电泳仪的普及受到了限制。其次, 对于没有纯品
的蛋白质不能制作标准曲线, 从而难以实现定量。利用
内标法虽然可对蛋白质进行半定量分析, 但由于仪器在
每次进样时的进样量可能会存在差异, 加之对于峰面积
无论是仪器自动积分还是手动积分都会造成不同程度的
偏差, 导致非凝胶筛分毛细管电泳对于未知蛋白质的定
量检测难以精确。再者, 涂层毛细管的使用寿命和成本
也限制其广泛应用。随着使用次数的增加, 毛细管对于
电渗流的抑制作用逐渐减弱, 管壁对蛋白质的吸附逐渐
增强, 使得分离难以实现。本实验中每个样品分摊的毛
细管费用在 4元左右, 使得检测费用大幅度增加。
3.2 阶段转变蛋白质变化规律
研究苹果的阶段转变对于提高育种效率及加快育种进程
图 4 24.5 kDa蛋白质含量在苹果阶段转变中的变化规律
Area B/Area OG: B蛋白质峰面积与橙黄剂峰面积比值
Figur e 4 The variation of the content of a 24.5-kDa protein
Area B/Area OG: The ratio of peak area betw een protein B and
orange green
图 3 5.0 kDa蛋白质在苹果阶段转变中的变化趋势
(A) 50节以下未检测到该蛋白质; (B) 51-55节该蛋白质出现; (C)
56节以上该蛋白质含量明显增加
OG: 橙黄剂
Figur e 3 The variation of a 5.0-kDa protein
(A) The protein can not be determined below the node of 50th;
(B) The protein appears f rom the node 51-55th; (C) The pro-
tein content increased above the node 56th
OG: Orange green
A B C
589田义等: 无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变蛋白质变化规律中的应用
具有重要意义。本实验通过非凝胶筛分毛细管电泳法
获得了 5.0 kDa和 24.5 kDa 2个阶段转变相关蛋白质。
此前, Bon和Monteuuis (1991)在巨杉(Sequoiadendron
giganteum)中检测到与膜相关的 16 kDa的蛋白仅在童
期和返童的组织中存在, 而在成年组织中缺乏。板栗
(Castanea moll issima)成年区枝条组培苗中有 38 kDa
和44 kDa 2条特异蛋白质带, 而童期枝条的组培苗中没
有发现上述蛋白质带(Amo-Marco et al. , 1993)。在北
美红杉(Sequoia sempervirens)的成年组织细胞内有32
kDa的并发生磷酸化作用的蛋白质, 而在童期组织的细
胞中不存在(Kuo et al. , 1995)。在常春藤(Hedera
nepalens is)和橄榄(Olea europaea)中也发现了与阶段转
变相关定性或定量变化的蛋白质(Garcia et al., 2000)。
田义等(2006)对木本植物阶段转变相关蛋白质的研究进
行了综述。2007年 5月, Sc ience杂志上发表了德国
Max Pl anck 植物培育研究院、英国伦敦帝国学院的
Lau rent Co rbes i er 等和日本奈良科学技术学院的
Shojiro Tamaki等研究的结论: 70年来人们一直在寻找
的开花素就是 FT 基因的蛋白产物(Corbes ie r et al. ,
2007; Tamaki et al. , 2007)。随着双向电泳技术的日
益完善及其与质谱兼容技术的开发, 必将进一步引导研
究者将木本植物阶段转变的研究重点转向阶段转变相
关的蛋白质。本文利用优化的无胶筛分毛细管电泳
条件成功地找到了与苹果阶段转变相关的蛋白质, 为
下一步进行双向电泳筛选阶段转变相关的特异蛋白质
奠定了基础。
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Analysis of Non-gel Sieving Capillary Electrophoresis in Protein
Changes Pattern in Development Phase Shift in Apple
Yi Tian1, Xinzhong Zhang2, Zhihong Zhang3, Peihua Cong1*, Guodong Kang1
1Re sea rch Institute of Pomolo gy, Th e Ch ine se Aca demy of Ag ricultural Scien ces, Xi ngchen g 1 251 00, Chi na
2Ch ina Ag ricu ltu ral Un ive rsit y, Bei jin g 1 000 94, Chi na; 3Sh enyang Ag ricultura l Universi ty, Sh enyang 11 016 1, Chi na
Abstr act Protein markers w ere used w ith optimal electrophoresis conditions in analysis of proteins of phase change in apple.
Optimal conditions for non-gel s iev ing capillary electrophoresis (NGSCE) w ere 0.15 mol.L-1 TB, 0.1% SDS, 7.5% Dex tran, 7.5%
glycerol, 23.5 kV separation voltage and 1.5 psi×90 s injection volume. This condition for NGSCE w as used to separate the phloem
proteins in apple hybrid seedlings . A 5.0-kDa protein appeared above the 50th node, and the content of a 24.5-kDa protein increased
sharply dur ing phase change. The result w as valuable for s tudy of apple phase change.
Ke y w ords a pple , n on-gel si evin g capi lla ry e lectro pho resis, pha se cha nge , prote in
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(责任编辑: 白羽红)
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