全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (6): 714-725, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-06-26; 接受日期: 2007-10-10
基金项目: 973计划(No. 2005CB120904)
* 通讯作者。E-mail: yptong@genetics.ac.cn
.综述.
植物吸收转运无机氮的生理及分子机制
李新鹏, 童依平 *
中国科学院遗传与发育生物学研究所, 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京 100101
摘要 氮是植物生长必需的营养元素。植物从土壤中吸收的氮素主要是NO3-和NH4+等无机氮源。植物吸收NO3-和NH4+的
系统均有高亲和转运系统(high-affinity transport system, HATS)和低亲和转运系统(low-affinity transport system, LATS)
之分。近10多年的研究已对这些转运系统的分子基础有了较好的理解, 本文着重对近年来植物吸收无机氮分子机制的研究进
展进行了综述。
关键词 铵态氮, 高亲和力转运系统, 高等植物, 低亲和力转运系统, 硝态氮
李新鹏, 童依平 (2007). 植物吸收转运无机氮的生理及分子机制. 植物学通报 24, 714-725.
氮是蛋白质和核酸的重要组分, 也是植物需求量最
大的矿质元素。氮素的缺乏一方面可导致植物生长缓
慢, 产量下降; 另一方面可使粮食作物籽粒蛋白质含量下
降, 降低品质。由于氮肥生产原料可直接来自大气, 几
乎不受限制, 因此农业生产中大量使用氮肥, 是几十年来
农业增产的重要原因。但是大量施用氮肥也造成了严
重的资源浪费和环境污染问题。目前氮肥利用率比较
低, 国内平均氮肥利用率只有30%-40%, 高产地区更低
(朱兆良, 2000)。事实上, 20世纪 90年代以来我国氮
肥施用量继续大幅提高, 粮食产量却增长缓慢。硝态氮
和铵态氮都极易通过径流和淋洗损失, 并造成水体富营
养化。硝态氮的反硝化和铵态氮的挥发都可使氮素通
过气体形式损失, 并对大气造成污染, 一方面导致温室效
应, 另一方面对臭氧层也有破坏作用(朱兆良, 2000)。
提高氮肥利用率, 减少浪费和污染, 一是要通过改进
氮肥品质和施肥技术, 二是要提高植物对氮肥的吸收利
用效率, 在减少氮肥施用量的条件下达到稳产甚至增产
的目的。土壤溶液中含氮化合物的浓度差异很大, 低至
几个微摩尔每升, 高至数十毫摩尔每升, 植物在进化中形
成多种机制来适应各种氮素环境。硝态氮(NO3-)和铵
态氮(NH4+/NH3)是植物吸收的主要氮源。对植物吸收
转运无机氮的生理过程及其分子遗传机制的研究, 有利
于为培育高效利用氮肥的作物品种提供理论基础。对
于氮素等营养元素吸收转运的相关基因已有大量研究(韩
燕来等, 2003), 本文重点介绍硝态氮和铵态氮吸收、调
控的生理和分子机制。
1 植物吸收NO3-的生理特征
高等植物中NO3-的跨膜转运与多数离子类似, 具有高
亲和力运转系统(high-affinity transport system, HATS)
和低亲和力运转系统(low-affinity transport system,
LATS)。HATS的动力学特征符合Michaelis-Menten
方程, 具有可饱和性, km 值较低, 一般在 10-100
mmol·L-1; LATS的吸收动力学或者 km值较高(大于 1
mmol·L-1), 或者即使在较高浓度介质中, 也呈线型不饱
和特征(Siddiqi et al., 1990)。植物细胞膜具有较负的
膜电位, 而细胞质NO3-浓度在几到几十毫摩尔每升, 胞
外则为几十微摩尔到几个毫摩尔每升。在热力学上
NO3-的吸收不可能只靠自身的跨质膜电化学势差, 而必
须依赖额外能量进行主动吸收。Glass等(1992)对大麦
根段的电生理研究支持了2H+/1NO3-的同向共转运体假
说, 后来对拟南芥NO3-转运蛋白进行的蛙卵表达及电生
理实验也证明了这一点(Tsay et al., 1993)。
715李新鹏等: 植物吸收转运无机氮的生理及分子机制
在早期生理学研究中, 根据各系统的表达特性, 植物
对NO3-的吸收系统又可分为组成型高亲和力转运系统
(constitutive HATS, cHATS)、诱导型高亲和力转运系
统(induced HATS, iHATS)以及组成型低亲和力转运系
统(constitutive LATS, cLATS)(Siddiqi et al., 1990;
Crawford and Glass, 1998), 而没有发现诱导型低亲和
力转运系统(induced LATS, iLATS); 但Huang等(1996)
认为AtNRT1.1是iLATS。随着分子生物学的研究进展,
认为 LATS大致与NRT1家族蛋白对应, HATS大致与
NRT2家族蛋白对应。
2 植物吸收NO3-的分子机制
2.1 NRT1家族
现在已知转运 NO3-的 LATS由 NRT1基因家族编码。
NRT1转运蛋白属于PTR (peptide transporters)家族。
PTR家族是一类可转运氨基酸、寡肽和NO3-等含氮化
合物的膜转运蛋白, 普遍存在于动物、植物、酵母和
细菌中, 一般含450-600个氨基酸, 有12个跨膜区。在
植物 NRT1的第 6、7跨膜区之间, 有一个大的亲水环
(图1); 这个亲水环在真菌中位于第7、8跨膜区之间, 在
动物绝大多数成员中, 则位于第 9、10 跨膜区之间
(Tsay et al., 2007)。
第 1个植物NRT1 基因AtNRT1.1 (原名CHL1)于
1993年被克隆, 被认为属于LATS, 是一个2H+/NO3-共
转运体(Tsay et al., 1993)。在拟南芥根尖中, AtNRT
1.1主要在表皮细胞中表达, 在较成熟根段中则在皮层和
内皮层中表达(Huang et al., 1996)。20世纪 90年代
末, 随着一些双亲和性离子转运蛋白的发现, AtNRT1.1
也被发现同时具有高和低两种亲和性, km值分别为49
mmol·L-1和 8.5 mmol·L-1 (Huang et al., 1996; Liu et
al., 1999)(表 1)。
拟南芥中PTR家族有53个成员。该家族成员的功
能是介导 NO3-或者肽分子的转运。经系统分析, 这一
家族可分为4组。对拟南芥、水稻和油菜的部分NRT1
成员鉴定表明, 4个系统分支中都有吸收NO3-的成员。
除直接从介质中吸收NO3-外, AtNRT1.1还有其它一些
重要功能。近年发现 AtNRT1.1也在保卫细胞中表达,
在NO3-存在时可大幅促进气孔开放; 在光下, chl1突变
体的气孔开放和蒸腾作用都下降, 使该突变体比野生型
更加耐受干旱胁迫(Guo et al., 2003)。AtNRT1.1还
与一些新生器官的生长密切相关。在侧根、幼叶和花
芽等新生器官中, AtNRT1.1都有短时高量表达, 在
atnrt1.1突变体中, 这些新生器官普遍生长缓慢(Guo et
al., 2001)。AtNRT1.2是单纯的cLATS成员(Huang et
al., 1999)。AtNRT1.2主要在根的表皮和根毛中表
达。在蛙卵表达后其 km值约为 5.9 mmol·L-1。反义
AtNRT1.2的转基因植株表现出NO3-低亲和力吸收下
降, 并且对 ClO4-具有更强的抗性。
除直接参与根的NO3-吸收外, 还有一些NRT1成员
与NO3-的长距离运输以及贮藏有关。AtNRT1.4是一
个低亲和力NO3-转运蛋白, 在叶柄周鞘细胞中表达, 定
位于液泡前体中, 可能与硝态氮的贮藏有关。在 atnrt1.4
突变体中, 叶柄中氮浓度下降为野生型的50%-64%, 并
且叶片比野生型的宽(Ch iu e t a l . , 2004)。此外,
AtNRT1.5在根部中柱鞘中表达, 将NO3-装载到木质部,
参与了NO3-的长距离运输; 逆境下, AtNRT1.4在根中
诱导表达, 而AtNRT1.5表达降低, 这有助于提高NO3-
在根系中的积累。
AtNRT1.1除参与NO3-吸收外, 还可能参与了NO3-
图1 AtNRT1.1(CHL1)跨膜区和磷酸化位点(Liu and Tsay, 2003)
黑圈表示胞质一侧的磷酸化位点, 白圈表示膜内或膜外的磷酸化位
点
Figure 1 Putative membrane topology and phosphorylation
sites of AtNRT1.1 (Liu and Tsay, 2003)
The black circles represent the consensus phosphorylation
sites facing the cytoplasm and the white circles represent those
buried in the membrane or on the extracellular surface
716 植物学通报 24(6) 2007
引起的信号传递。拟南芥侧根的伸长被NO3-诱导, 这
一现象是由NO3-作为信号诱导的。拟南芥AtANR1属
于MADS转录因子家族, 在NO3-诱导侧根发育过程中
起着重要作用(Zhang and Forde, 1998; Gan et al.,
2005)。atnrt1.1突变体中高氮诱导的侧根伸长受到抑
制, 并且这一抑制作用无法用氮素吸收不足来解释;
AtNRT1.1 mRNA的组织定位与AtANR1基本重合, 都
在根尖、侧根根尖、基部和维管中表达; AtNRT1.1突
变体中, AtANR1表达受到抑制。因此 AtNRT1.1可能
在NO3-诱导的侧根伸长信号中起着重要作用, 并且位于
AtANR1的上游(Remans et a l. , 2006a)。此外,
AtNRT1.1还可能参与了其它NO3-转运蛋白的表达调
控。AtNRT2.1在高氮下表达受抑制。但对拟南芥表
达谱分析发现, AtNRT1.1突变体chl1-5中, 即使高氮下
AtNRT2.1的表达仍然不受抑制。这种抑制解除不是由
于吸氮量下降, 而与 AtNRT 1.1 的活性有关。因此
AtNRT1.1可能还有调控 AtNRT2.1的功能(Munos et
al., 2004)。在低硝高铵的培养条件下, AtNRT1.1介导
AtNRT2.1和AtNRT3.1(AtNAR2.1)表达上调, 这可能是
植物避免高氨中毒的反应(Krouk et al., 2006)。
油菜BnNRT1.2是一个非常特殊的NRT1蛋白, 因
为在已知的 PTR蛋白中, 只有 BnNRT1.2既可以转运
NO3-, 又可以转运氨基酸(L-组氨酸)(Zhou et al. ,
1998)。BnNRT1.2编码一个具有 12个跨膜区, 由 588
个氨基酸组成的蛋白。BnNRT1.2转运不同底物所需的
最适pH值不同, 转运L-组氨酸的最适pH值为碱性; 而
转运NO3-的最适pH值为酸性, 这与NO3-的转运为2H+/
1NO3-同向运输的机制相符。
2.2 NRT2和NAR2家族
NRT2转运蛋白属于NNP(nitrate-nitrite-porter)家族, 是
MFS超家族(major facilitator superfamily)之一。
NRT2也具有典型的跨膜转运蛋白结构。除少数成员具
有6个跨膜区外, 多数具有12个跨膜区, 可分为2组, 每
组 6个跨膜区, 中间由 1个大的亲水环连接。
真核生物中第1个克隆出来的NRT2基因是真菌构
巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NrtA(crnA)基因(Unkles
et al., 1991)。NrtA自身即可完成NO3-转运, 其 km值
为100 mmol·L-1; 构巢曲霉中另一个NRT2蛋白NrtB自
身亦可完成NO3-转运, 其km值为10 mmol·L-1 (Unkles
et al., 2001)。氨基酸突变分析表明, 分别位于第 2、
8跨膜区的NrtA的2个精氨酸残基R87和R459与底物
结合有密切关系(Unkles et al., 2004)。此后在单胞绿
藻(Chlamydomonas reinhartii)中分离得到了4个NrtA
的同源蛋白, 其中一些NRT2成员不能单独完成NO3-转
运功能, 必须与另一类NAR2蛋白共同作用。在蛙卵表
达系统中, CrNRT2.1或CrNAR2单独表达都不能产生
NO3-引发的电流; 只有二者同时表达才能转运 NO3-
(Zhou et al., 2000a)。CrNRT2.1/CrNAR2既可转运
NO3-, 又可转运 NO2-, km值分别为 1.6和 1.8 mmol·
L-1; CrNRT2.2/CrNAR2只有转运NO3-的活性, km值
为11 mmol·L-1。CrNRT2.3自身就有转运活性, 但只能
转运NO2-, km值为5 mmol·L-1 (Galvan et al., 1996)。
NAR2是一类较小的膜蛋白, CrNAR2由259个氨基酸组
表 1 NRT1转运蛋白的功能
Table 1 Function of NRT1 family of nitrate transporters
基因 物种 底物 km值
AtNRT1.1 Arabidopsis thaliana NO3- 低亲和力: 8.5 mmol·L-1 (Huang et al., 1996)
高亲和力: 49 mmol·L-1 (Liu et al., 1999)
AtNRT1.2 Arabidopsis thaliana NO3- 5.9 mmol·L-1 (Huang et al., 1999)
OsNRT1 Oryza sativa NO3- 9.1 mmol·L-1 (Lin et al., 2000)
BnNRT1. 2 Brassica napus NO3-
L-组氨酸 膜电位为–40 mV时 Km值为 4 mmol·L-1, 膜电位为–180 mV时 Km值为
14 mmol·L-1 (Zhou et al., 1998)
膜电位为–100 mV时Km值为 25 mmol·L-1, 膜电位为–180 mV时 Km值为
1.4 mmol·L-1 (Zhou et al., 1998)
717李新鹏等: 植物吸收转运无机氮的生理及分子机制
成, 高等植物中的NAR2蛋白更小一些, 一般为 200个
氨基酸左右。NAR2只有1-2个跨膜区。NAR2与NRT1
和NRT2没有同源性。在大麦中, HvNRT2.1也必须与
1个NAR2基因同时表达才能转运NO3-, 并且具有特异
性: 在大麦的HvNAR2.1、HvNAR2.2和HvNAR2.3中,
只有HvNAR2.3可与HvNRT2.1互补吸收NO3- (Tong et
al., 2005)。
拟南芥NRT2家族有 7个成员。半定量PCR实验
表明, AtNRT2.1、AtNRT2.4、AtNRT2.5和 AtNRT
2.6主要在根中表达, AtNRT2.7主要在地上部表达
(Orsel et al., 2002)。AtNRT2.1和 AtNRT2.2位于拟
南芥 1 号染色体 , 反向相邻排列。L i 等( 2 0 0 7 )对
AtNRT2.1和AtNRT2.2的分别敲除以及双敲除突变体
进行了分析, 结果显示: 突变体 atnrt2.1的 iHATS活性
下降了 72%, 而 cHATS和 LATS活性没有明显下降;
atnrt2.2的 iHATS活性也下降了 19%, 同样对 cHATS
和 LATS没有显著影响。这意味着 AtNRT2.1可能是
iHATS的主要组分, 而AtNRT2.2是次要组分。不过在
atnrt2.1中, AtNRT2.2的表达量约是野生型的3倍, 说
明当AtNRT2.1被敲除后, AtNRT2.2表达得到了补偿性
提高(Li et al., 2007)。拟南芥中有 2个 NAR2基因:
AtNAR2.1(AtNRT3.1和 At5g50200)和 AtNAR2.2
(AtNRT3.2和 At4g24720)。AtNAR2.1的突变对
cHATS和 iHATS都有强烈抑制(Okamoto et al. ,
2006)。与HvNRT2.1类似, AtNRT2.1只有与AtNAR 2.1
同时在蛙卵中表达才能引发NO3-内流, 并且AtNRT2与
AtNAR2的组合也具有特异性(Orsel et al., 2006)。
Wirth等(2007)以 atnar2.1突变体为材料研究发现,
AtNAR2.1可能与AtNRT2.1的蛋白合成、质膜定位或
者降解有关。
最近一项研究表明, AtNRT2.7定位于液泡膜, 在成
熟种子中高量表达; atnrt2.7突变体在营养生长期与野生
型没有明显差异, 但种子中 NO3-含量显著下降, 表明
AtNRT2.7对拟南芥种子成熟过程中的NO3-贮存有重
要作用(Chopin et al., 2007)。
水稻基因组中只有4个NRT2基因和2个NAR2基
因。对几种单子叶和双子叶植物中已知的NRT2基因比
对后, 根据序列相似性可将NRT2分为3类, 第1类只包
括双子叶植物基因, 第2类全部是单子叶植物的基因, 第
3类则包括单子叶和双子叶植物的基因。其中第3类与
藻类NRT2基因较为接近。这表明在单子叶和双子叶植
物形成后, 各自的NRT2基因又发生了进化, 产生了各自
特有的 NRT2基因(Cai et al., 2007a)。
AtNRT2.1除作为HATS组分吸收NO3-外, 还可能
参与了植物根系形态的调控。拟南芥的侧根发生受高
蔗糖/低硝酸根抑制, 但AtNRT2.1的突变体 lin1不受这
种抑制; 这一表型并非由于 NO 3-吸收的减少, 因此
AtNRT2.1可能在这一过程中起着感受NO3-或者信号转
导的功能(Little et al., 2005)。另一方面, AtNRT2.1的
氮素吸收功能也间接对根形态有着重要影响(Remans et
al., 2006b)。
2.3 NO3-的跨液泡膜转运
前面提到, 拟南芥叶柄中 AtNRT1.4和成熟种子中的
AtNRT2.7都位于液泡膜上, 参与了NO3-跨液泡膜的转
运。除此之外, 还有其它一些蛋白也参与了NO3-的转
表 2 部分 NH4+特异转运蛋白的功能
Table 2 Function of ammonium transporters
高亲和力转运系统 物种 底物 km值
AtAMT1.1 Arabidopsis NH4+/甲基铵 8 mmol·L-1(底物为甲基铵)(Gazzarrini et al., 1999)
AtAMT1.2 Arabidopsis NH4+/甲基铵 高亲和力: 24 mmol·L-1(底物为甲基铵) (Gazzarrini et al., 1999);
低亲和力: 3.0 mmol·L-1(底物为甲基铵)(Shelden et al., 2001)
AtAMT1.3 Arabidopsis NH4+/甲基铵 11 mmol·L-1(底物为甲基铵)(Gazzarrini et al., 1999)
AtAMT1.5 Arabidopsis NH4+ 4.5 mmol·L-1(底物为 NH4+)(Yuan et al., 2007b)
AtAMT2 Arabidopsis NH4+ 22 mmol·L-1(Sohlenkamp et al., 2002)
LjAMT1.1 Lotus japonicus NH4+/甲基铵 129 mmol·L-1(底物为甲基铵)(Salvemini et al., 2001)
LjAMT2.1 Lotus japonicus NH4+ 未知
718 植物学通报 24(6) 2007
运。一类所谓氯离子通道(chloride channel, CLC)的蛋
白被认为是阴离子通道。在一些物种中发现, CLC事实
上介导了 Cl-/H+交换。拟南芥 AtCLCa突变体 clca-1
根和叶中的NO3-浓度下降50% (Geelen et al., 2000);
AtCLCa定位于液泡膜, 是一个NO3-/H+反向转运体, 二
者化学比为2:1, 起着将NO3-转运到液泡中的功能, 并
使得液泡中 NO3-浓度可达细胞质中的 30-50倍(de
Angeli et al., 2006)。
2.4 NO2-的跨膜转运
NO 3-进入细胞后在细胞质中被还原成 NO 2-, 此后
NO2-进入叶绿体被进一步还原成NH4+。在高等植物细
胞中, 我们对NO2-进入叶绿体这一过程的分子机制所
知甚少。Rexach等(2000)在绿藻 Chlamydomonas
reinhardtii中发现1个NAR1基因, 该基因编码1个叶绿
体膜蛋白, 它与细菌的甲酸盐/亚硝酸盐转运蛋白有很高
的同源性。NAR1发生突变后, C. reinhardtii不能在以
NO3-为唯一氮源的生长介质中存活。这说明NAR1在
NO2-进入叶绿体过程中起着非常关键的作用。但目前
为止, 在高等植物中尚未发现 NAR1的同源基因。
3 植物吸收、转运NH4+的生理特征
在土壤中, NO3-和NH4+是主要氮素形态。一般情况下,
旱地土壤中氮素主要形态是NO3-, 淹水环境中则铵态氮
较多。尽管多数情况下土壤NO3-含量比NH4+高得多,
但多数植物更偏好后者。这主要有两点原因 : 一是
NH4+带正电荷, 细胞膜内侧带负电荷, 吸收 NH4+比
NO3-更节省能量; 二是NH4+进入细胞内后, 可直接用于
合成氨基酸, 而NO3-必须先经过两步还原反应转化为
NH4+再用于氨基酸的合成。但由于NH4+过多对细胞有
一定的毒性, 因此 NH4+转运和转化受到严密的调控。
类似于NO3-的转运, 植物对NH4+的吸收也分为HATS
和 LATS两类。HATS在铵浓度较低时(<1 mmol·L-1)
占优势, 可饱和, 其km值低于100 mmol·L-1 (Wang et
al., 1993; Kronzucker et al., 1996)。缺 N时 HATS
被诱导, 细胞内高铵或者铵的代谢物如谷氨酰胺则抑制
其活性。LATS则在高铵浓度(>1 mmol·L-1)时占优势,
呈非饱和的线性动力学曲线; 另外, LATS表现为组成型
表达, 对 N调节不敏感(Wang et al., 1993)。
NH4+与NH3两种形态在溶液中处于动态转换中, 在
所有的生理环境中, 均以NH4+占绝对优势, 在接近中性
pH时, NH3只占大约1%。细胞对铵态氮的吸收以NH4+
为主, 但是细胞膜脂双层膜则对 NH3的透性较高, 对
NH4+却极低。少量 NH4+/NH3可以通过一些非铵转运
蛋白/通道进行非特异性转运, 例如NH4+和K+电荷相等,
大小相仿, 可以少量通过 K+通道(Gassmann and
Schroeder, 1994); NH3则可以通过液泡膜上的水通道
(Loque et al., 2005)。铵态氮转运主要由NH4+特异转
运蛋白AMT(ammonium transporter)完成(表2)。
4 植物吸收、转运NH4+的分子机制
AMT属于 AMT/Rh类蛋白, 广泛存在于细菌、真菌和
动植物中, 参与铵态氮的转运。植物AMT蛋白具有 11
个跨膜区, N端在外, C端在胞内一侧; 每个 AMT转运
蛋白由3个亚基组成同源三聚体。尽管对于AMT/Rh结
构有了一些研究, 但其具体的转运机制仍不很清楚。很
可能不同物种中的转运机制并不一致。目前一般认为
植物AMT是一个NH4+的单向转运体(uniporter), 转运方
表 3 高亲和力转运系统的功能
Table 3 Function of high-affinity transport system
高亲和力转运系统 物种 底物 Km值
NrtA Aspergillus nidulans NO3- H+/NO3-共转运: 24 mmol·L-1
被动吸收: 127 mmol·L-1 (Zhou et al., 2000b)
CrNRT2.1 + CrNAR2 Chlamydomonas reinhanltii NO3- 28 mmol·L-1 (Zhou et al., 2000a)
HvNRT2.1 + HvNAR2.3 Hordeum vulgare NO3- 30 mmol·L-1 (Tong et al., 2005)
AtNRT2.1 + AtNAR2.1 Arabidopsis NO3- 未知 (Orsel et al., 2006)
719李新鹏等: 植物吸收转运无机氮的生理及分子机制
式可能类似于通道(Ludewig, 2006)。
拟南芥基因组中有6个AMT基因, 可分为2个亚家
族: AtAMT1和AtAMT2。AtAMT1有 5个成员(AtAMT 1.1
-AtAMT1.5), 成员之间在氨基酸水平上的相似性达
70%以上; 而AtAMT2只有 1个成员AtAMT2.1。就目
前所知, 除 AtAMT1.2可能具有高低双重亲和特性外
(Shelden et al., 2001; Neuhauser et al., 2007), 其余
所有AMT1和AMT2成员都属于HATS组分。AtAMT 1.1
在根、茎和叶中均有一定表达; AtAMT1.3则在根中表
达(Gazzarrini et al., 1999); AtAMT1.2主要在根内皮
层表达, 皮层细胞也有少量表达(Neuhauser et al., 2007;
Yuan et al., 2007b); AtAMT1.5主要在根尖和根毛细胞
中表达(Yuan et al., 2007b)。番茄 LeAMT1.1和
LeAMT1.2在雾培条件下根毛中的表达远高于根的其它
部分(von W iren et al. , 2000)。当 AtAMT1.1或
AtAMT1.3被敲除后, 拟南芥缺氮根系对铵的吸收分别
下降 30%, 并且这 2 个基因的功能表现出加性效应
(Loque et al., 2006)。然而尽管AtAMT1.1和AtAMT1.3
双缺失可减少铵吸收高达70%, 但在绝大多数培养条件
下突变体的生长只受到轻微影响。这表明, 剩余的铵转
运蛋白在多数情况下可以满足拟南芥的生长需要。图2
为Yuan等(2007b)根据已知报道和自己的实验结果对拟
南芥 AMT1在根中的定位和功能所做的总结。
水稻基因组中有 10个 AMT基因, 其中OsAMT1、
OsAMT2和OsAMT3各有 3个, 以及 1个OsAMT4基
因(Suenaga et al., 2003)。其中OsAMT1.1表达量最
高, 并且在根和叶中都有较高表达; OsAMT1.2 和
OsAMT1.3主要在根中表达; 但在不同研究中对这几个
基因诱导表达特性的描述不一致(Sonoda et al., 2003;
Kumar et al., 2003; 赵首萍等, 2006)。OsAMT2.1在
根和叶中组成型表达; OsAMT3.1表达很微弱(Suenaga
et al., 2003)。与拟南芥相比, 水稻的 AMT基因较多,
而转运NO3-的HATS成员NRT2却较少, 也少于二倍体
单子叶植物大麦(已克隆6个), 这可能是水稻这种沼生植
物和旱地植物在不同环境中进化的结果。
5 转运蛋白基因表达和转运活性的调控
NRT1和NRT2的表达首先受其底物的调控。例如拟南
芥 AtNRT2.1和 AtNRT2.2的表达都受 NO3-诱导, 但
AtNRT2.1的表达远高于 AtNRT2.2 (Zhuo et al.,
1999)。水稻中除 OsNRT2.3外, 其余几个 NRT2和
图 2 拟南芥根部 AMT1分布及功能 (Yuan et al., 2007b)
Figure 2 Model summarizing the functions of AMT1-type transporters in high-affinity ammonium uptake in Arabidopsis thaliana
roots (Yuan et al., 2007b)
720 植物学通报 24(6) 2007
NAR 2 基因都较明显地受 NO 3-诱导(C a i e t a l . ,
2007a)。AtAMT1.1在氮饥饿时在根中高表达; 供氮充
足时在叶中高表达(Engineer and Kranz, 2007)。缺N
处理时, AtAMT1.1转录为对照的5倍, 与流量变化一致;
AtAMT1.3转录也增加到 3倍; 而 AtAMT1.2变化不显
著。当幼苗从NH4NO3转移到NO3-为单一氮源的培养
液后, 其对NH4+的吸收能力大大增加, 但3个基因的表
达量都没有增加(Gazzarrini et al., 1999)。AtAMT1.5
只在缺氮处理时表达(Yuan et al., 2007b)。
代谢物对转运蛋白的反馈调节也有很多研究报道。
在硝酸还原酶活性缺失的拟南芥突变体G4-3植株中,
无论在氮饥饿阶段还是NO3-诱导阶段, AtNRT2.1的表
达几乎总是高于野生型植株(Filleur and Daniel-Vedele,
1999)。这可能是氮素代谢库的减少引起的反馈调节。
无机氮的直接代谢产物氨基酸对氮素吸收的调节很早就
受到关注。然而就目前的研究看来, 氨基酸对NO3-吸
收的影响比较复杂, 不同的氨基酸种类和实验材料得到
的结果不尽相同。谷氨酰胺合成酶 ( g l u t a m i n e
synthetase, GS)抑制剂硫代甲硫胺酸(methionine
sulfoximine, MSX)强烈抑制AtNRT2.1的表达, NH4+、
精氨酸( A r g )和天冬酰胺( A s n )等也不同程度下调
AtNRT2.1的表达, 但谷氨酰胺(Gln)对其没有明显影响
(Zhuo et al., 1999)。在有关大麦的报道中, Gln对NO3-
内流和 NRT2的表达都有较弱的抑制作用(Vidmar et
al., 2000)。在小麦中, 天冬氨酸(Asp)可抑制 NO3-吸
收达 50%, Asn 和 Gln 却没有影响(Rodgers and
Barneix, 1993)。然而Cai等(2007b)发现, 添加Gln可
诱导缺氮培养的小麦NRT2成员的转录上调, 但并不提
高 NO3-吸收速率。可以推测, 这种转录和吸收变化不
一致是由于转录后调控所致。在低等植物小立碗藓
(Physcomitrella patens)中, 供应NH4+可抑制NRT2和
NAR2的表达, GS抑制剂则解除这一抑制作用; 原丝体
中PpNRT2和PpNAR2的表达量与谷氨酰胺含量呈负
相关(Tsujimoto et al., 2007)。在拟南芥中, AMT1的
转录水平、NH4+的 HATS活性与 N量呈负相关。但
是在高氮水平下, 当用MSX阻断Gln的合成后, AMT1
转录和HATS流量都恢复到高水平; 直接添加Gln则能
同时抑制二者。这表明对 AMT1表达及 HATS流量起
抑制作用的物质是 N H 4 + 的代谢产物而不是其自身
(Rawat et al., 1999)。近期一项研究则表明AtAMT1.1
的 m R N A 丰度可能受转录后调节( Y u a n e t a l . ,
2007a)。番茄 LeAMT1.1也被缺N和低Gln诱导, 但
LeAMT1.2的表达则随供氮水平提高而增加(Lejay et
al., 2003)。
昼夜节律和光合产物对氮素代谢也有强烈影响。
拟南芥 AtAMT1.1、AtAMT1.2和 AtAMT1.3的表达丰
度都与昼夜节律相关, 其中AtAMT1.3增加达3倍, 变幅
最大; AtNRT1.1和 AtNRT2.1的表达也具有相同的特
征; 相应地, 拟南芥根系对NH4+和NO3-吸收速率的日
变化也与此一致(Gazzarrini et al., 1999)。暗期对这
些基因的抑制可被蔗糖处理逆转, 然而蔗糖对这些转运
蛋白的调控机制还不清楚(Lejay et al., 2003)。
氮素转运蛋白的调控与植物激素及转录因子等调控
蛋白之间的关系也开始受到关注。前面提到, AtNRT
1.1在新生器官中有短时高量表达, 而这些器官的分化生
长都受生长素的调控。有实验表明, 外源添加生长素或
生长素过量合成的突变体中, 可强烈诱导AtNRT1.1在
这些器官中的表达(Guo et al., 2002)。外源施加 ABA
可在 4 小时内上调 H A T S 组分中的 T a N R T 2 . 1、
TaNRT2.2、TaNRT2.3及TaNAR2.1和TaNAR2.2的
表达, 然后下调; 但 ABA在低氮时对 NO3-的吸收却起
抑制作用(Cai et al., 2007b)。ABA可抑制质膜 H+-
ATPase的活性, 从而使质膜去极化, 这可能是ABA对
HATS活性抑制的原因。拟南芥LNT1是一个转录因子,
AtLNT1的T-DNA插入突变体在低氮时的NO3-含量高
于野生型; 同时, NRT2 家族中, 除 AtNRT2.3 和
AtNRT2.7变化不明显外, 其余成员的表达都有一定提
高, 但 AtNRT1.1 和 AtAMT1.1 都无明显变化; 而
AtLNT1对氮素反应的表达模式恰好与NRT2相反, 在低
氮时表达下降, 高氮时表达上升(未发表数据)。综合这
些结果, 可推测AtLNT1可能是几个NRT2的负调控因
子。此外, 如前面所述, AtNRT1.1不仅自身是转运蛋
白, 而且也可以调控 AtNRT2.1的活性。
磷酸化是最常见的蛋白活性调控方式之一。
721李新鹏等: 植物吸收转运无机氮的生理及分子机制
AtNRT1.1的两种亲和力之间的转换取决于其第2跨膜
区胞质一侧第101位苏氨酸的磷酸化状态: 非磷酸化时
表现为低亲和力, 磷酸化时表现为高亲和力; 这种磷酸化
状态则受供氮水平调控: 低氮培养下幼苗的AtNRT1.1
高度磷酸化, 而在高氮培养下磷酸化水平降低(Liu and
Tsay, 2003)。拟南芥 PTR家族中有 36个成员都具有
可磷酸化的苏氨酸101位点, 不过AtNRT1.1仍然是目
前已知唯一对NO3-具有双重亲和性的蛋白(Tsay et al.,
2007)。最近的研究表明, AMT1转运活性的激活 /失活
受磷酸化调控。位于AMT1胞质侧的C端(cytosolic C
terminus, CCT)与相邻的亲水环相互作用, 对三级结构
和功能有重要作用; 未修饰的AMT处于活化状态, CCT
的磷酸化可使 AMT1失活(Loque et al., 2007)。这可
以解释高氮条件下, 即使AMT存在于细胞中, 也无转运
活性的现象。当AtAMT1.2的CCT中可磷酸化残基Thr
突变为 Asp(模拟磷酸化)后, 转运活性丧失; 但突变为
Ala后, 却保持了转运活性(Neuhauser et al., 2007)。
NRT1和NRT2/NAR2转运NO3-都需要依赖H+的
跨膜电化学势, 因此pH对这类蛋白介导的NO3-转运有
一定影响, 一方面是改变驱动力的强弱, 另一方面可能直
接调节蛋白活性。真菌 Aspergillus nidulans的 NrtA
(CRNA)介导的NO3-跨膜电流在pH5-7的范围内, 随pH
降低而增强, 在pH5以下则不再有明显变化(Zhou et al.,
2000b)。但大麦HvNRT2.1/HvNAR2.3在蛙卵双表达
实验中, 这2个蛋白在介质pH为 6.5时介导的电流最强;
随着pH继续降低, 电流迅速下降, 到pH5.5时电流几乎
为零 (Tong et al., 2005)。这可能由于 pH会影响 2个
蛋白的相互作用, 酸化介质会使HvNRT2.1和HvNAR2.3
解离, 从而丧失转运活性。与之对应的是, 大麦对低浓
度NO3-的吸收速率也大约在 pH6.5时最高 (未发表数
据)。此外, 现有的实验证据表明, 氮素转运蛋白对底物
的亲和力可能广泛受膜电位影响。膜电位越负时 ,
AtAMT1.2、LeAMT1.1和HvNRT2.1/HvNAR2.3转运
底物的km值都变得更小(Tong et al., 2005; Ludewig,
2006; Neuhauser et al., 2007)。BnNRT1.2转运NO3-
和L-组氨酸的km值也随膜电位而变化, 当膜电位降低
时(变得更负), 其转运NO3-的km值变大, 而转运L-组
氨酸的 km值变小(表 3)(Zhou et al., 1998)。
蛋白降解是其功能调节的重要环节。酵母(Hanse-
nula polymorpha)的 NO3-高亲和转运蛋白 YNT1与
Aspergillus nidulans的NrtA和NrtB同源, 可被Gln诱
导降解, 这一过程是通过Gln诱导的YNT1泛素化引发
的(Navarro et al., 2006)。植物氮素转运蛋白的降解机
制还有待研究。
6 展望
对氮素转运蛋白的研究, 上世纪末主要是克隆了一些重
要组分的基因, 并获得一些其结构、功能及调节的信
息。本世纪初, 基因组学和生物信息学的开展更系统地
揭示了氮素转运蛋白家族的大小和成员。但是NRT1的
庞大家族以及一些尚未认识的具有氮素转运功能的蛋白,
使基因发现和功能鉴定还需要大量工作。目前有关转
运蛋白的表达和活性调控机制还知之甚少, 这将是今后
研究的一个重点。另外, 在氮素转运蛋白与植物体内其
它组分的相互作用方面, 虽然获得了一些信息, 但还没有
形成清晰的框架。氮素转运蛋白不仅受其底物和下游
氮化合物(如氨基酸)的反馈调节, 而且受光合产物的调节,
这就涉及植物物质同化中一个基本而广泛的调节— —
碳氮调节; 另外, 一些氮素转运蛋白还可能参与氮素信号
转导和植物形态等过程的调控, 也使氮素转运蛋白的研
究更加复杂而有趣; 而在与激素的相互关系这一重要的
方面, 可以说了解甚少。在研究手段方面, 需要生理学
和遗传学等传统技术与生物信息学、基因组学、分子
生物学和细胞学等现代生物学技术的整合应用, 还需要
把氮素转运放到植物整体的代谢调节和信号传递网络中,
从而更深刻地了解氮素转运的机制和生理功能, 为农业
和生物工程的应用提供坚实的基础。
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Abstract Nitrogen (N) is an essential macro-nutrient for plants. Nitrate and ammonium are the main N sources absorbed by plants.
Both nitrate and ammonium transport systems can be kinetically divided into two systems: the low-affinity transport system and the
high-affinity nitrate transport system. This review introduces recent advances in the physiological and molecular mechanisms of
inorganic N transport in plants.
Key words ammonium, high-affinity transport system, higher plants, low-affinity transport system, nitrate
Li XP, Tong YP (2007). Physiological and molecular basis of inorganic nitrogen transport in plants. Chin Bull Bot 24, 714-725.
(责任编辑: 孙冬花)
* Author for correspondence. E-mail: yptong@genetics.ac.cn
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