全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 603-608, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-11-27; 接受日期: 2007-03-29
基金项目: 河南大学博士启动基金
* 通讯作者。E-mail: haofsh@henu.edu.cn
.实验简报.
渗透胁迫对黑麦幼苗活性氧和抗氧化酶活性的影响
郝福顺 1*, 崔香环 1, 赵世领 1, 孙立荣 1,2
1河南大学生命科学学院, 农业生物技术研究所, 开封 475001; 2辽宁师范大学生命科学学院, 大连 116029
摘要 用20%聚乙二醇(PEG 6000)研究了渗透胁迫对黑麦(Secale cereale L.)幼苗活性氧(reactive oxygen species, ROS)
和主要抗氧化酶— —超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶
(ascorbate peroxidase, APX)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)活性的影响。结果表明, 与对照相比, PEG处
理明显提高了叶子和根中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量、ROS的水平和以上4种抗氧化酶的活性。渗透胁迫下,
叶子和根中MDA和ROS水平变化的规律基本相似, 但抗氧化酶活性在2种器官中表现不完全相同, 叶子中CAT的活性在对
照和处理中无显著差异, 但在根中差异明显, 表明叶子中SOD、APX和GR在植物应答渗透胁迫中起重要作用, 而根中这4
种抗氧化酶都参与植物对胁迫的反应。GR活性随PEG处理变化幅度显著高于其它抗氧化酶, 表明GR在黑麦应答渗透胁
迫中所起作用可能强于其它抗氧化酶。
关键词 抗氧化酶, 渗透胁迫, 活性氧, 黑麦
郝福顺, 崔香环, 赵世领, 孙立荣 (2007). 渗透胁迫对黑麦幼苗活性氧和抗氧化酶活性的影响. 植物学通报 24, 603-608.
干旱和盐是限制植物生长发育的关键环境因子, 它
们均能够通过渗透胁迫对植物造成伤害(Bartels and
Sunkar, 2005)。研究表明, 渗透胁迫影响植物生长发
育的重要原因之一是胁迫条件下植物体内超氧阴离子
(O2
-. )和过氧化氢(H2O2)等活性氧(ROS)的产生和清除,
平衡被打破后大量积累, 破坏蛋白质、核酸和细胞膜等
结构, 干扰细胞的正常代谢, 使植物的生长和发育受阻。
植物中存在清除ROS的抗氧化酶, 对植物起保护作用,
主要的保护酶有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶
(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶
(GR)等。SOD清除 O2-. , 并能将其转化为活性较弱的
H2O2; 而 CAT、APX和GR清除 H2O2, 将其还原为水
(Mittler, 2002)。
黑麦(Secale cereale L.)是最早成功用于改良小麦
(Triticum aestivum)的近缘植物, 具有抗逆、抗虫、抗
倒伏、分蘖力强及赖氨酸含量高等优点, 在小麦育种中
起非常重要的作用(吴金华等, 2005)。尽管目前已有渗
透胁迫影响小麦膜脂过氧化水平和某些抗氧化酶活性的
报道(Zhang and Kirham, 1994; 张煜等, 2005), 但均未
同时研究植株地上部分和根中ROS水平及抗氧化酶的
活性, 而且关于这方面的研究在黑麦上还未见报道。为
此, 我们系统研究了渗透胁迫对黑麦幼苗根和地上部分
ROS和抗氧化保护酶的影响, 以期能为揭示黑麦根和叶
对渗透胁迫的响应机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
黑麦(Secale cereale L.)种子由河南大学生命科学学院
李锁平教授提供。
1.2 方法
1.2.1 黑麦苗的培养
用2%次氯酸钠将黑麦种子消毒15分钟后, 去离子水冲
洗干净, 30°C催芽24小时, 将种子播于架在浅盘上向下
凹陷的钢丝网中的湿纱布上, 用1/10 Hoaglands溶液培
604 植物学通报 24(5) 2007
养, 培养液中通气并每天更换培养液。培养条件: 光
照 /黑暗周期 16/8小时, 温度 25°C, 光强 400 µmol.
m-2.s-1。
1.2.2 试剂处理
用20%聚乙二醇(PEG6000)分别处理生长10天的黑麦
根 3、6、12和 24小时, 然后用清水冲洗掉 PEG, 吸
干, 分别剪下根和地上部, 称重后迅速放入液氮中速冻保
存备用。用1/10 Hoaglands溶液处理相同时间的根作
为对照。
1.2.3 膜脂过氧化指标测定
按Du和Bramlage(1992)的方法, 通过测定苗和根中丙
二醛(MDA)的含量以确定膜脂的过氧化程度。
1.2.4 过氧化氢和超氧阴离子的测定
根据 415 nm 处测定形成钛 - 过氧化复合物的方法
(Brennan and Frenkel, 1977)确定苗和根中 H2O2含
量。按 Jiang和 Zhang(2001)的方法测定苗及根中O2-.
的含量。方法稍加改动, 即在测定 530 nm光吸收前,
反应混合液中未加乙醚。
1.2.5 抗氧化酶活性的测定
按Jiang和Zhang(2001)的方法制备苗及根的粗酶液并
测定 SOD、CAT、APX和 GR的活性。所有操作均
在 4°C 下进行。
1.2.6 统计分析
以上实验至少重复 3次, 在 0.05概率水平用Student’s
t检验计算处理和对照有关指标平均数的显著性差异。
2 结果
2.1 渗透胁迫对黑麦幼苗叶子中MDA、H2O2和
O2
-. 产生的影响
MDA能够反映细胞膜脂的过氧化程度。图 1显示, 与
对照相比, PEG6000明显促进了黑麦地上部 MDA、
H2O2和O2-. 的产量。MDA随PEG处理时间的延长而增
加, 6小时前增加较慢, 6小时后增加迅速, 处理和对照
差异达到显著水平, 12小时后, 处理和对照的MDA差异
最大, 处理约为对照的 1.9倍。处理后MDA的量持续
增加, 表明长时间处理比短时间处理对细胞膜的伤害更
大(图 1A)。
用PEG处理黑麦根, 苗中H2O2产生量在前6小时
随着处理时间的延长而迅速增加, 12小时达到最大值,
以后逐渐下降; 6小时, 处理值为对照的2倍, 两者差异
图 1 PEG不同处理时间对黑麦幼苗叶子MDA (A)、H2O2 (B)、
和O2
-. (C)含量变化的影响
Figure 1 The effects of PEG on changes of the contents of
MDA (A), H2O2 (B), and O2
-. (C) in leaves from Secale cereale
seedlings at different times of treatment
605郝福顺等: 渗透胁迫对黑麦幼苗活性氧和抗氧化酶活性的影响
达到极显著水平(图 1B)。O2-. 产生量随 PEG处理时间
的延长在12小时前持续增加, 6小时前增加速度较快, 6
小时后增加速度变慢, 6小时, 处理与对照差异达到显著
水平, 12小时的处理值则约为对照值的 2.5倍(图 1C)。
2.2 渗透胁迫对黑麦幼苗根中MDA、H2O2和O2-.
产生的影响
PEG处理增加了黑麦根中MDA、H2O2和 O2-.的产生
量。6小时前, 处理和对照样品中的MDA差异不明显,
12小时后差异达到极显著水平, 24小时差异最大, 处理
值为对照值的 4倍多(图2A)。12小时前, H2O2随PEG
处理时间的延长而增加, 6小时前增加较慢, 6小时后增
加迅速, 处理和对照差异显著, 12小时差异达到最大, 处
理约为对照的 1.9倍, 以后逐渐下降(图 2B)。根中O2-.
产生量的变化规律与H2O2相似, 12小时前O2-.的量随处
理时间延长而快速增加, 12小时后逐渐降低, 3小时, 处
理与对照差异达到显著水平, 12小时, 处理与对照差异
最大, 前者约为后者的 3倍。对照样品的O2-.量在整个
过程中变化不明显(图 2 C)。
2.3 渗透胁迫对黑麦幼苗叶子中抗氧化酶活性
的影响
PEG处理提高了黑麦幼苗地上部SOD、APX和GR的
活性(图 3)。与对照相比, SOD的活性随处理时间延长
而一直增加。6小时后, 处理和对照的差异达到显著水
平, 24小时, 两者差异最大, 处理的SOD活性为对照的
1.4倍。在整个处理过程中, 对照的酶活性变化不显著
(图 3 A)。PEG处理也增加了 APX的活性。6小时后,
处理和对照差异达到显著水平, 而从 6小时到 24小时,
处理样品的APX活性增加缓慢(图3C)。PEG处理使GR
的活性持续增加, 从3小时到6小时增加较快, 6小时后
增加缓慢。6小时, 两者差异达到显著水平。24小时
差异最大, 处理的活性约为对照的2.2倍(图3D)。CAT
的活性随PEG处理时间的延长先升高后降低, 在整个处
理过程中, 处理与对照的变化趋势相似, 两者差异不显著
(图 3B)。
2.4 渗透胁迫对黑麦幼苗根中抗氧化酶活性的
影响
PEG的处理明显增加了根中SOD、CAT、APX和GR
的活性(图 4)。处理的 SOD活性在 3小时前增加迅速,
以后缓慢下降。3小时后, 处理和对照的差异达到显著
水平, 6小时, 两者差异最大, 处理的 SOD活性约为对
照的 1.3倍(图 4A)。CAT的活性在PEG处理的前 6小
时显著提高, 以后逐渐降低。3小时, 处理和对照差异
达到显著水平。APX的活性随PEG处理时间的延长而
图 2 PEG不同处理时间对黑麦幼苗根 MDA (A)、H2O2 (B)和O2
-.
(C)含量的影响
Figure 2 The effects of PEG on changes of the contents of
MDA (A), H2O2 (B), and O2
-. (C) in roots from Secale cereale
seedlings at different treatment times
606 植物学通报 24(5) 2007
增加。6小时, 处理和对照差异达到显著水平, 12小时,
两者差异最大, 处理的APX活性为对照的1.2倍。对照
在整个过程中变化不显著(图 3C)。PEG处理显著提高
了GR的活性, 12小时前GR活性增加较快, 12小时后
增加变慢, 24小时达到最大值, 处理的活性比对照高约
2倍(图 4D)。
3 讨论
干旱和盐是作物遇到的主要环境胁迫, 这2种胁迫都包
含渗透胁迫(Bartels and Sunkar, 2005)。研究证明, 渗
透胁迫能够产生 ROS, 对作物造成伤害。植物同时存
在清除 ROS的抗氧化保护酶, 如 SOD、CAT、APX
和GR等, 控制植物体内的 ROS水平(Mittler, 2002)。
本研究表明, 渗透胁迫下, 黑麦苗地上部分及根中
MDA、H2O2和O2-.的值均随处理时间延长而明显增加
(图1, 图2), 说明渗透胁迫能够导致氧化胁迫, 这与一些
研究者在小麦(Bartoli et al., 1999; Celina et al., 2005;
张煜等, 2005)和玉米(Zea mays)(Jiang and Zhang,
2002; 杨涛等, 2006)等作物上的研究结果类似。胁迫
下, 黑麦根和叶子中这3种氧化胁迫指标的变化趋势相
似, MDA随处理时间延长逐渐增大, 开始增加较快, 以
后变慢, 在 24小时趋于稳定, 总体呈上升趋势, 说明渗
透胁迫产生的氧化胁迫对膜脂的伤害开始较小, 以后变
大, 达到一定程度后不再显著增加。H2O2和O2-.的量开
始是随胁迫时间延长而增加, 达到最大值后逐渐下降, 说
明植物体内有清除ROS的酶或抗氧化剂在起作用。与
根相比, 叶子中MDA、H2O2和O2-.的值均明显偏高, 表
明叶子中更容易产生ROS。这可能是因为叶子中具有
叶绿体, 而叶绿体在植物受到胁迫时能够大量产生ROS
的缘故(Mittler, 2002; 胡筑兵等, 2006), 但具体的机制
需进一步深入研究。从ROS产生量随渗透胁迫处理时
图 3 PEG不同处理时间对黑麦叶子 SOD (A)、CAT (B)、APX (C) 和GR (D)活性的影响
Figure 3 The effects of PEG on changes in the activities of SOD (A), CAT (B), APX (C) and GR (D) in leaves from Secale
cereale seedlings at different times of treatment
607郝福顺等: 渗透胁迫对黑麦幼苗活性氧和抗氧化酶活性的影响
间的变化规律看, 黑麦与小麦非常相似(J iang and
Zhang, 2002), 这可能是因为这2种植物亲缘关系近, 产
生及清除 ROS的机制相似所致。
在叶子中, 3种主要抗氧化酶SOD、APX和GR的
活性均随处理时间的延长而显著增加, 说明这些酶在植
物应答渗透胁迫中起重要作用。GR的活性变化幅度最
大, 表明该酶可能在清除 ROS 中作用大于 SOD 和
APX。在整个 PEG处理过程中, CAT变化规律与对照
无明显差别, 说明该酶可能在黑麦叶子应答渗透胁迫中
不起作用或者作用很小(图 3)。
根中抗氧化酶活性的变化与叶子中类似, 但不相
同。最大的不同点是根中 CAT的活性随 PEG处理明
显升高, 说明根中抗氧化的机制与叶中不完全相同。根
中GR的活性变化幅度比其它 3种抗氧化酶高很多, 与
叶子中的情况类似, 表明GR可能是植物中最重要的抗
氧化酶之一(图 4)。
无论处理还是对照, 根中抗氧化酶的水平均低于叶
子, 这与各自器官中 ROS的水平相一致。但 SOD和
APX的变化趋势在叶子和根中存在差异。叶子中这2种
酶的活性在处理的最后时间段一直增加, 在根中则呈下
降趋势, 这可能是因为处理24小时, 叶子中抗氧化酶清
除能力高于 ROS产生水平, 而在根中则相反(图 3, 图
4 )。
另外, 就对照而言, 叶子和根中ROS以及抗氧化酶
活性在不同时间有明显的变化, 有的已达到显著差异水
平(图 2, 图 4)。这是因为植物体内ROS水平随光照时
间存在周期性变化规律导致的, 这在拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中已得到证明(Chen and Gallie, 2004)。
综上所述, 黑麦中, 无论叶子还是根, 渗透胁迫均能
够增加ROS的水平和主要抗氧化酶的活性, 但这2种器
官中ROS及抗氧化酶活性的水平存在差异, 说明根和叶
子应答渗透胁迫的机制不完全相同。
图 4 PEG不同处理时间对黑麦根 SOD (A)、CAT (B)、APX (C) 和GR (D)活性的影响
Figure 4 The effects of PEG on changes in the activities of SOD (A), CAT (B), APX (C) and GR (D) in roots from Secale cereale
seedlings at different times of treatment
608 植物学通报 24(5) 2007
Effects of Osmotic Stress on the Production of Reactive Oxygen
Species and Change of Antioxidant Enzyme Activities in
Seedlings of Secale cereale L.
Fushun Hao1*, Xianghuan Cui1, Shiling Zhao1, Lirong Sun1, 2
1Institute of Agricultural Biotechnology, College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475001, China
2College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China
Abstract Effects of osmotic stress on the production of reactive oxygen species (ROS) and change in activities of the main
antioxidant enzymes, inchuding superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT) and glutathione reduc-
tase (GR), in seedlings of Secale cereale L. were investigated with 20% PEG 6000 treatment. Compared with controls, PEG-treated
seedlings showed significantly increased level of membrane lipid peroxidation, contents of H2O2 and O2
-. , and activities of SOD, APX,
CAT and GR. The change pattern of MDA content and ROS level in leaves was similar to that in roots, but the change in antioxidant
enzyme activity induced by PEG treatment in leaves and roots differed. CAT activity in roots but not leaves of PEG-treated and
control seedlings differed significantly. These results showed that SOD, APX and GR in leaves and in roots may play important roles
in S. cereale in response to osmotic stress. In addition, the change in magnitude of GR activity in PEG-treated seedlings was
markedly higher than that of other antioxidant enzymes, which suggests that GR may play a more important role in removing ROS
than other enzymes in S. cereale.
Key words antioxidant enzyme, osmotic stress, reactive oxygen species, Secale cereale L.
Hao FS, Cui XH, Zhao SL, Sun LR (2007). Effects of osmotic stress on the production of reactive oxygen species and change of
antioxidant enzyme activities in seedlings of Secale cereale L. Chin Bull Bot 24, 603-608.
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(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: haofsh@henu.edu.cn