全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (2): 176-184, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-03-02; 接受日期: 2007-06-08
基金项目: 北京市自然科学基金(No. 5073045)、北京市自然科学基金重大项目(No.5050001)和北京市科技创新能力建设项目
* 通讯作者。E-mail: liufan@nercv.com
.研究论文.
花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
张丽 1,2, 赵泓 2 , 陈斌 2 , 刘凡 2 *
1首都师范大学生命科学学院, 北京 100037; 2北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097
摘要 利用非对称体细胞杂交技术, 获得芸薹属花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)与黑芥(B. nigra)的种间杂种, 实现
了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体, 具有抗黑腐、
黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体, 用不同强度的UV射线处理后, 利用PEG方法诱导供、受体原生质
体融合。培养后获得170棵再生植株, 选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检
测, 结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示, 约23%杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式
细胞仪测定DNA含量显示, 杂种植株DNA含量是受体的2-4倍, 20%杂种植株DNA含量小于供、受体之和。
关键词 非对称体细胞杂交, 黑芥, 花椰菜, 杂种鉴定, 植株再生
张丽 , 赵泓 , 陈斌 , 刘凡 (2008). 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定. 植物学通报 25, 176-184.
花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)为十字花
科芸薹属甘蓝的一个变种, 是具有较高营养价值及经济
价值的重要蔬菜, 但其生产常受到多种病害影响。针对
蔬菜高效、安全生产的要求, 迫切需要抗多种病害的育
种材料。同时由于病菌小种的多样性和易变性, 也急需
进一步扩大育种材料抗病基因的多态性。例如危害甘
蓝类蔬菜的主要病菌之一— — 黑腐病菌, 现已鉴定出至
少 6个生理小种(Vicente et al., 2001), 但目前甘蓝中
普遍存在的是对小种 3的抗性基因。在一些野生十字花
科植物中存在对主要生理小种 1 和 4 的抗性基因
(Vicente et al., 2002)。由于生殖隔离, 利用常规杂交
育种难以实现优异基因的种间转移。体细胞杂交为获
得种间杂种提供了可能性, 其中非对称体细胞杂交技术
是通过运用射线处理供体原生质体, 导致供体基因组的
有限转移 , 有利于提高杂种育性 , 缩短育种周期
(Forsberg et al. ,1998; Liu et al. , 2005)。
黑芥(Brass ica nigra)是芸薹属 3个基本种之一, 其
B基因组携带黑腐病(black rot)、黑胫病(black leg)和
根肿病(c lubroot)的抗性基因(Sacristan et al. ,1989;
Sjödin and Glimelius ,1989)。利用含 BB 基因组的芸
薹属作物分别与甘蓝型油菜进行种间体细胞杂交, 已获
得了抗黑胫病和根肿病的甘蓝型油菜 (Gerdemann-
knörck et al.,1995)。Chévre等(1997)利用常规远缘杂
交手段, 结合胚培养, 获得了黑芥与甘蓝的杂种, 并应用
于黑芥基因组分析。Pearson (1972)通过有性杂交向甘
蓝中转移黑芥的胞质不育基因。运用体细胞杂交技术,
Jourdan和 Salazar(1993)获得了黑芥与羽衣甘蓝(B.
oleracea var. acephala)的杂种; Naras imhulu等(1992)获
得了黑芥与青花菜(B. oleracea var. ital ica, CC)的杂种,
证明了埃塞俄比亚芥(B. carinata, BBCC)的体外合成。
本研究通过非对称体细胞杂交途径, 获得了花椰菜
与黑芥的种间杂种, 将黑芥的抗病基因转育到花椰菜种
质中, 扩大了甘蓝类蔬菜抗病基因的遗传多样性, 为新品
种的培育提供新的育种种质。
1 材料与方法
1.1 材料
供体黑芥(Brassica nigra, BB, 2n=16)抗病基因型(St.
461)来自德国联邦作物育种中心园艺作物研究所, 具有
177张丽等: 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
黑腐病、黑胫病和根肿病抗性。受体花椰菜
(B. oleracea var. botryt is , CC, 2n=18)编号 0307, 由
北京市农林科学院蔬菜研究中心提供, 经本中心生物技
术室筛选出的原生质体培养良好及植株再生能力强的材
料。受体材料种子常规消毒后, 在MS 基本培养基上萌
发, 24°C暗培养 6 天后, 取下胚轴用于原生质体制备。
供体材料的无菌苗在MS培养基中培养, 每次取 3-5片
幼叶用于叶肉原生质体制备。
1.2 原生质体的分离纯化及融合
原生质体的分离纯化按本实验室建立的芸薹属植物下胚
轴及叶肉原生质体的分离纯化方法进行(姚星伟等,
2005)。叶肉原生质体调整密度至每毫升 2×106 个, 以
每皿 5 mL铺于直径为 9 cm的培养皿中, 用 UV 射线照
射后, 离心力为 111.8 ×g, 离心 5分钟。分别调整供、
受体原生质体浓度至每毫升 2×106个, 按1:1(v/v)的比例
混合。原生质体融合采用 PEG 融合法, 按照 Ryschka
等(1996)的方法进行, 略作修改。步骤如下: 在直径为
5 cm 的无菌塑料培养皿中滴入 7滴混合原生质体溶液,
每滴 40 µL, 静置 10分钟, 使原生质体沉积在培养皿底
部; 然后在每滴两侧加 60 µL 40% PEG 溶液, 5分钟
后, 稍微倾斜培养皿, 去掉培养皿中的混合液; 随后加入
13%的 PEG 溶液 2 mL, 5分钟后去掉; 再加入 6.7%
的 PEG 溶液 2 mL, 5分钟后去掉。用培养基 1(B5培
养基大量元素、微量元素和有机成分; 包含 150 mg.
L-1 水解酪蛋白, 875 mg.L-1二水合氯化钙, 45 500 mg.
L-1山梨醇,45 500 mg.L-1甘露醇, 2 500 mg.L-1 葡萄
糖, 125 mg.L-1 2-脱氧 -核糖, 0.5 mg.L-1 2,4-二氯苯
氧乙酸, 0.2 mg.L-1 萘乙酸, 0.2 mg.L-1 6-苄氨基嘌
呤, pH 5.8-6.0)洗涤培养皿 2次后, 可进入原生质
体培养。
1.3 原生质体培养及植株再生
完成融合处理后, 在直径5 cm的培养皿中加入2 mL培
养基 1, 于 24°C 暗培养。3-7 天后, 当观察到较多的
细胞进入一次分裂时, 向每培养皿中加入400 µL培养基
2(B5培养基大量元素、微量元素和有机成分; 包含150
mg.L-1水解酪蛋白, 2 500 mg.L-1葡萄糖, 125 mg.L-1
2-脱氧核糖, 20 000 mg.L-1蔗糖, 0.5 mg.L-1 2,4-二氯
苯氧乙酸, 0.2 mg.L-1 萘乙酸, 0.2 mg.L-1 6-苄氨基嘌
呤, pH 5.8-6.0)。此后每 3天加入 1次培养基 2, 15-
20 天以后有细胞团出现时, 转移到培养基3 (B5培养基
大量元素, 微量元素和有机成分; 包含 150 mg.L-1水解
酪蛋白, 30 000 mg.L-1蔗糖, 0.5 mg.L-1 2,4-二氯苯
氧乙酸, 0.2 mg.L-1萘乙酸, 0.2 mg.L-1 6-苄氨基嘌呤,
10 000 mg.L-1琼脂, pH 5.8-6.0), 促使愈伤组织形成,
同时转为正常光照培养。当愈伤组织长到约 5 mm 时,
把愈伤组织转移到培养基 4 (MS 大量元素和微量元素;
B5有机成分; 包含150 mg.L-1水解酪蛋白, 30 000 mg.
L-1蔗糖, 0.2 mg.L-1萘乙酸, 2.0 mg.L-1 6-苄氨基嘌
呤, 1 000 mg.L-1琼脂, pH 5.8-6.0), 诱导不定芽形成。
当幼苗的真叶形成时, 转移到无激素的培养基中, 使再生
植株正常生长并生根。
1.4 杂种植株鉴定
1.4.1 分子标记鉴定杂种植株 　
植物总 D N A 提取采用 C TA B 法。D N A 浓度采用
Techcomp UV-VIS8500紫外分光光度计检测, 最后将
纯化后的DNA 稀释至 50 ng.µL-1备用。
1.4.1.1 RAPD分析 　
从 50条随机引物中筛选出编号为 12的随机引物, 在花
椰菜及黑芥双亲中表现出DNA的扩增差异, 用于对杂种
植株进行鉴定。引物(由北京赛百盛基因技术公司合成)
序列为: 5-GGGCCACTCA-3。PCR反应体系为: 总反
应体积 13. 5 µL, 其中 10×反应缓冲液 1.25 µL, 2.5
mmol ·L-1 dNTPs 1 µL, 2.5 U Taq酶 (购自TianGen公
司) 0.4 µL, 模板 DNA 100 ng, 随机引物 10 pmol,
ddH2O 6.85 µL, 20 µL矿物油覆盖。PCR反应在Gene
Amp公司的System 9600 PCR仪上进行, 反应循环条
件参照姚星伟等(2005)的方法。
1.4.1.2 SRAP分析
采用一对在双亲中表现出扩增差异的引物进行再生植株
178 植物学通报 25(2) 2008
杂种特性的 S RA P(s equence -re la ted amp l if ied
polymorphism)分析 (Li et al., 2001)。上游引物(由北
京赛百盛基因技术公司合成 ) m e 7 序列为 : 5 -
TGAGTCCAAACCGGTTG-3, 下游引物em5序列为: 5-
GACTGCGTACGAATTAAC-3。PCR反应体系: 总反
应体积为10 µL, 其中10×反应缓冲液1.0 µL, 10 mmol.
L-1 dNTPs 0.25 µL, 2.5 U Taq酶 (购自 Tian Gen公
司) 0.6 µL, 100 ng模板DNA, 正向和反向引物各50 ng,
3.4 µL ddH2O, 20 µL矿物油覆盖。采用的 PCR仪同
上, 扩增程序为: 94°C 5分钟; 94°C 1分钟, 35°C 1分
钟, 72°C 1分钟, 5个循环; 94°C 1分钟, 50°C 1分钟,
72°C 1分钟, 35个循环; 72°C 10分钟, 4°C保存。PCR
产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, Na2CO3银
染法染色显影, 在 X胶片观察灯上观察并分析条带。
1.4.2 流式细胞仪测定植株相对 DNA含量　
取再生植株和供、受体亲本叶片各 0.2 g, 分别加入 2
mL细胞裂解液, 以锋利刀片切碎组织, 过滤、离心后
用 50 µg.mL-1碘化丙啶(PI)染液进行染色。30分钟后,
以供体黑芥和受体花椰菜样品为对照, 用流式细胞仪(BD
FACSCalibur)测定再生植株细胞 DNA 相对含量。
1.4.3 染色体计数　
取供、受体亲本和杂种再生植株的根尖, 用饱和对二氯
苯预处理2-3小时后, 卡诺溶液(冰醋酸: 乙醇＝1: 3)固
定 4小时, 1 mol.L-1 HCL解离 5分钟, 卡宝品红染色
后常规压片镜检。
2 结果与分析
2.1 融合细胞培养以及UV射线处理对植株再生
的影响
在培养 3天之内, 融合的原生质体与未发生融合的受体
原生质体在外观上明显不同。显微镜观察可见, 融合的
细胞中有明显的供体叶绿体存在, 而未融合的受体原生
质体由于来源于暗培养的下胚轴, 不含有叶绿体, 此特征
可以作为早期鉴别杂种细胞的标志。据此计算, 本融合
处理条件下, 原生质体的异源融合率约为 16%。培养
12 天后可看到大的细胞团(图 1A), 18 天后有星状细胞
团出现(图 1B ), 此时可转入固体增殖培养基。40-50
天后愈伤组织约 1-5 mm(图 1C), 将它们转入分化培养
基上。在幼苗的真叶形成后(图 1D),及时转到无激素的
MS 基本培养基中可获得生长正常的植株。
实验中设计了 9种不同的辐射剂量, 以确定处理供
体黑芥适宜的最大辐射剂量。由图 2可见, 当用较低剂
量的射线处理供体原生质体时(0.010、0.050、0.075、
0.087 5、0.100和 0.200 J.cm-2), 愈伤组织的产量随
着剂量的增加而增加, 且可以得到再生植株。辐射剂量
较高时(0.300 J.cm-2), 仅得到愈伤组织无再生植株。
当辐射剂量达到致死剂量时(0.400和0.500 J.cm-2), 不
能获得小细胞团。在受试的低剂量范围内, 随着辐射剂
量的加强, 植株再生率也呈现增加趋势, 但剂量过高则加
重细胞损伤, 严重影响融合后再生。处理供体适宜的最
大辐射剂量为0.087 5 J.cm-2, 既能得到大量愈伤组织,
植株再生率也最高。
2.2 形态学观察
亲本植株和杂种的株型比较见图 1(E-G)。花椰菜的叶
片呈椭圆形, 蓝绿色, 叶缘锯齿状, 无叶耳, 叶面光滑无
毛。黑芥叶片卵圆形, 绿色, 浅裂, 有叶耳, 叶面被毛。
再生植株基本分为2种类型: 一种是受体类型, 一种是中
间类型。受体类型的叶片形状与受体花椰菜类似, 叶片
椭圆形, 无毛; 中间类型再生植株的叶形介于供、受体
之间(图 1H), 其叶片形态、颜色、叶毛的有无等呈现
多样性分布。
2.3 再生植株核基因组的RAPD与SRAP分析
2.3.1 RAPD分析
将筛选出的第 12 号随机引物用于杂种植株鉴定。图 3
为杂种及亲本 DNA扩增结果, 显示引物 12在花椰菜中
有 2条扩增条带, 分别为 300和 600 bp; 在黑芥中有 3
条特异扩增带, 分别为 1 000、1 300和 1 500 bp。在
1-7号再生植株DNA扩增图谱中, 均含有来自花椰菜基
因组的 300和 600 bp特征带, 以及 2-3条来自黑芥基
179张丽等: 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
因组的扩增带(箭头所示)。

2.3.2 SRAP标记分析
SRAP引物组合me7+em5对亲本DNA进行扩增(图4),
产生 11个能够很好区分双亲的多态性位点, 结果稳定,
重复性好, 可用于再生植株鉴定。由图 4 可见, 17、
18、20-23、28 和 29号再生植株都同时具有双亲的
特征条带, 证实为杂种, 而 19、25-2、32、47 和 66
号则不具有黑芥的特征条带, 为非杂种。由于 SRAP扩
增条带远多于 RAPD, 因此本实验体系具有更高的杂种
检出率。
2.4 再生植株的DNA含量测定
用流式细胞仪对再生植株进行DNA含量测定, 从图5中
可以看出供体黑芥 G1期(I)位于46道处, 受体花椰菜G1
(III)期位于 50道处。由于黑芥细胞的 DNA含量为 0.98
pg, 花椰菜为1.19 pg, 据此对再生植株细胞的流式图进
行统计分析。发现所测的 80 棵再生植株核 DNA 含量
图 1 融合后原生质体培养、植株再生及再生植株的形态观察
(A) 培养 12 天后形成的细胞团; (B) 培养 18 天后形成的星状细胞团; (C) 1-5 mm愈伤组织; (D) 愈伤组织上分化出幼芽; (E)花椰菜(受
体); (F)杂种再生植株; (G) 黑芥(供体) ; (H) 受体、杂种和供体植株叶型比较
Figur e 1 Culture and regeneration of the protoplasts af ter fusion and morphological comparison of the regenerated plants
(A) mic rocalli f ormed after 12 days of culture; (B) mic rocalli f ormed after 18 days of culture; (C) 1-5 mm callus ; (D) callus
differentiated into shoots; (E) caulif low er (Brass ica ol eracea var. botryti s) (recipient) plant; (F) hybr id plant; (G) black mus tard
(B. ni gra) (donor ) plant; (H) leaf morphology comparison among parents and hybrids
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介于 1.309-4.76 pg之间, 其中 20% 的再生植株细胞
DNA含量高于受体但低于供、受体 DNA 含量之和, 如
图5中显示的该杂种的细胞DNA含量在G1期约为1.79
pg(峰 V); 2% 的植株DNA 含量等于供、受体 DNA 含
量总和; 77.5%的植株 DNA含量高于供、受体 DNA含
量总和。再生植株不同的细胞核DNA 含量, 一方面为
体细胞杂种提供了佐证, 另一方面也反映出再生植株中
双亲遗传物质构成的多样性。
2.5 染色体计数
黑芥和花椰菜的染色体数分别为 2n=16和2n=18, 显微
观察显示, 再生植株的染色体数介于 19和 68之间, 两
亲本和 3 株杂种植株的根尖染色体数目比较见图 6。
23% 的再生植株的染色体数目少于双亲染色体数之和
(4x=34), 其余再生植株的染色体数目均多于34条, 多达
68条。同一愈伤组织分化再生的不同单株其染色体数
目不同, 流式细胞仪检测结果也显示相同的差异。如
32#-1 和 32#-2杂种根尖染色体数目分别为 2n=19和
2n=30(图6D,E), 二者用流式细胞仪检测的细胞DNA含
量分别为 1.666 pg和 2.618 pg。
2.6 形态学、RAPD和SRAP分子标记鉴定结果
的比较
对 15株再生植株分别进行形态学、RAPD和 SRAP分
图 2 不同UV 剂量对融合后原生质体愈伤组织形成和植株再生
的影响
Figur e 2 Inf luence of UV dose on microcalli formation and
plant regeneration after protoplast fusion　
图 3 引物 12对亲本及再生植株的RA PD扩增结果
M: DNA标准分子量; C: 受体0307; N: 黑芥; 1-7: 再生植株 (箭头
显示黑芥的特异多态性条带)
Figur e 3 RA PD pattern of parents and regenerated plants
amplif ied using primer 12
M: DNA marker ; C: Caulif low er (Brassica ol eracea var . botrytis)
0307; N: B. nigra; 1-7: regenerated plants (ar row s show B.
ni gra-specif ic bands)
图 4 亲本及杂种再生植株的SRA P分析图谱
C: 受体 0307; N: 黑芥; 17-25、28、29、32、47和 66: 再
生植株(箭头显示黑芥特征带)
Figur e 4 SRAP pattern of parents and regenerated plants
C: Caulif low er (Brassi ca ol eracea var . botrytis ) 0307; N: B.
ni gra; 17-25, 28, 29, 32, 47 and 66: regenerated plants (arrow s
show B. nigra-specif ic bands)
子标记鉴定, 结果显示各鉴定方法的结论有一定差异(表
1)。如形态学上编号为 18 、23 及 26 的 3 株再生植
株呈现为受体花椰菜类型, 判断为非杂种植株, 这几株材
料的RAPD分析结果也显示为非杂种植株; 而SRAP鉴
定结果则证明为杂种植株。因此, 一种方法不足以确定
181张丽等: 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
Earle, 1997)、花椰菜和B . spinescens (姚星伟等,
2005)以及花椰菜与 ogura CMS甘蓝型油菜(惠志明等,
2006)体细胞杂交实验中也有相似的结论。
在对杂种植株进行细胞学分析时, 流式细胞仪检测
结果显示 20%的再生植株DNA含量低于供、受体DNA
含量之和, 而染色体计数得出23%的再生植株其染色体
数目之和小于亲本染色体之和。两种方法的统计结果
相差3%, 笔者认为原因是流式细胞仪的测定值是基于细
胞基因组的大小, 是基因组的C值, 而不是基于染色体
的数目; 另外, 不同染色体对 C值的贡献不同。虽然近
似基因组构成材料的C值和染色体数目呈高度线性相
图 6 双亲及其杂种的染色体分析
(A) 花椰菜0307(2n=18); (B) 黑芥(2n=16) ;(C) 55#杂种 (2n=58);
(D) 32#-1杂种 (2n=19); (E) 32#-2杂种 (2n=30)
Figur e 6 Chromosome analys is of parents and the regener-
ated hybrids
(A) caulif low er (Brassica oleracea var . botryti s) 0307 (2n=18);
(B) B. ni gra (2n=16); (C) hybr id 55# (2n=58); (D) hybrid 32#-1
(2n=19); (E) hybr id 32#-2 (2n=30)
图 5 双亲及其杂种DNA含量的流式细胞分析图
I, II: 受体花椰菜的G１和G２期; III, IV : 供体黑芥的G１和G２期;
V, VI: 杂种再生植株的G１和G２期
Figur e 5 DNA content analysis of parents and their regener-
ated hybrid by f low cytometry
I, II: G１ and G２ phase of caulif low er (Brass ica ol eracea var .
botrytis); III, IV: G１ and G２ phase of B. ni gra; V, VI: G１ and G２
phase of hybr id plant
杂种性质, 必须综合运用形态学、RAPD和 SRAP分子
标记等多种方法才能证明杂种的真实性。
3 讨论
本研究通过UV 辐照处理黑芥叶肉原生质体, 并与未经
任何处理的花椰菜下胚轴原生质体融合, 高频率获得了
花椰菜和黑芥的种间体细胞杂种。紫外线处理可以引
起供体染色体的断裂和消减(V lahoval et al. ,1997;
Forsberg et al. ,1998), 诱导不对称体细胞杂种产生。本
实验所设计的 9种不同辐射剂量处理供体原生质体, 总
体趋势上表现为低剂量处理的融合产物再生率较高, 而
高剂量照射后融合细胞的分裂分化能力较低, 当剂量加
大到一定程度后(如0.400 J.cm-2), 杂种细胞丧失分裂能
力, 无愈伤组织形成。UV 处理的这种表现, 在小麦与
獐茅(Yue et al. , 2001)、小麦和羊草(Sigarava and
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关, 但对于黑芥和花椰菜的种间体细胞杂种而言, 再生植
株中不同供体和受体的染色体构成, 有可能会产生染色
体数目和基因组的 C值非完全线性相关的情况, 即出现
染色体数少, 但细胞基因组 C 值大, 或者相反的情况。
Jan在对甘蓝和白菜的体细胞杂种以及甘蓝型油菜与
Eruca sat iva的体细胞杂种进行流式DNA 含量测定
和染色体数目相关性分析时, 得出二者的相关系数为
0.91(Jan et al. , 1988), 也可以解释本研究中两种结
果之间的矛盾。此外, 在对同一愈伤组织来源的不同
再生单株进行根尖染色体计数时发现, 不同单株的染
色体数目存在差异, 通过流式细胞仪分析也得到了验
证。这种现象可能缘自于融合细胞的分裂分化中, 某
些具有再生能力的细胞发生了不同程度的染色体丢失,
导致了同一愈伤的不均一性, 进而形成不同染色体数
目的再生植株。
在杂种形态学和分子水平鉴定过程中发现, 形态学
鉴定简单、易行, 但局限于人眼识别程度, 有的杂种特
性人眼无法识别, 就必须依靠分子水平的鉴定手段。
RAPD分子鉴定方法简单、成本低, 但重复性较差、检
测位点不多, 也只能部分反映植株基因组的组成, 容易出
现遗漏情况。本研究采用了SRAP 新型分子标记,　其
带型丰富稳定、重复性好, 多态性高, 更能准确地鉴定
杂种性质。和 RAPD相比, SRAP是今后分子水平上鉴
定杂种的有效方法。
但是, 上述鉴定方法都只能是鉴定杂种性质, 不能有
效地揭示杂种中异缘染色体及基因组的构成情况。因
此, 在以后对体细胞杂种及其后代的鉴定分析工作中, 要
在综合运用形态学、RAPD和 SRAP 等方法的基础上,
利用 AFLP、GISH (程雨贵等, 2006) 或 FISH等手段
进一步对非对称融合杂种的非对称水平、染色体组成
及其遗传稳定性进行更加深入的研究。
虽然本研究运用非对称体细胞杂交手段获得的花椰
菜和黑芥种间体细胞杂种大多数是中间类型, 但还是有
少数杂种表型偏向受体, 可较快成为育种桥梁材料。中
间类型的杂种植株也可以通过与亲本的连续回交, 消除
多余的供体野生性状, 获得在花椰菜基因组背景上具有
来自黑芥的新型抗性基因的创新抗性育种材料。本研
究扩大了甘蓝类蔬菜的抗病基因资源, 为新品种选育提
供了新的多抗性育种基础材料。
参考文献
程雨贵 , 吴江生 , 华玉伟 , 张明海 , 陈洪高 (2006). 萝卜与甘蓝属
间杂种基因组原位杂交分析. 遗传 28, 858-864.
惠志明 , 刘凡 , 简元才 , 申书兴 , 赵泓 (2006). 原生质体非对称融
合法获得花椰菜与Ogura CMS甘蓝型油菜种间杂种. 华北农学
报 21, 65-70.
姚星伟 , 刘凡 , 云兴福 , 赵泓 , Rys chka U, Schumann G (2005).
非对称体细胞融合获得花椰菜与Brassica spinescens的种间
杂种. 园艺学报 32, 1039-1044.
Che vre AM, Barre t P, Eber F, Dupuy P, Brun H, Tanguy X,
Re nar d M (1997). Selec tion of stable Brassi ca napus-B.
juncea recombination lines resistant to blackleg (Leptosphaeria
maculans). 1. Identif ication of molecular markers , chromo-
somal and genome origin of the introgression.Theor Appl Genet
95,1104-1111.
表 1 形态学、RAPD和SRA P分子标记鉴定结果比较
Table 1 Comparison of results on hybr id identif ication by dif ferent methods
Code of plant 17 18 19 20 21-1 22 23 24 25-1 25-2 26 27 28 29 30
Morphology
identif ication + - - + + + - + + - - + + + +
RA PD
analys is + - - + + + - + + - - + + + +
SRAP
analys is + + - + + + + + + - + + + + +
+: 杂种植株; -: 非杂种植株 +: hybrid plant; -: non-hybr id plant
183张丽等: 花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定
Fors berg J, Lagercrantz U, Glimelius K (1998). Comparison
of UV light, X-ray, and restrict ion enzyme treatment as tools in
production of asymmetric somatic hybrids betw een Brassica
napus and Arabidopsis thaliana. Theor Appl Genet 96, 1178-
1185.
Gerdemann-knörck M, Nielen S, Tzs cheetzsch C, Iglisch
J, Schieder O (1995) . Transfer of disease resistance w ithin
the genus Brassica through asymmetric somatic hybridization.
Euphytica 85, 247-253.
Jan F, Johan D, Eva S, Kristina G (1988). Correlation betw een
flow cytometric determination of nuclear DNA content and
chromosome number in somatic hybrids w ithin Brassicaceae.
Plant Cell Rep 7, 74-77.
Jourdan P, Salazar E (1993). Brass ica cari nata resynthes ized
by protoplast fus ion. Theor Appl Genet 86, 567-572.
Li G, Gao M, Yang B, Quiros CF (2001). Sequence-related am-
plif ied polymorphism(SRAP), a new marker sys tem based on
a simple PCR reaction: its application to mapping and gene
tagging in Brass ica. Theor Appl Genet 103, 455-461.
Liu JH, Xu XY, Deng XX (2005). Intergeneric somatic hybridiza-
tion and its application to crop genetic improvement. Plant Cell
82, 19-44.
Naras imhulu SB, Kirt i PB, Pr akash S, Chopra VL (1992) .
Resynthesis of Brass ica car inata by protoplast fusion and
recovery of a novel cytoplasmic hybrid. Pl ant Cel l Rep 11,
428-432.
Pearson OH (1972). Cytoplasmically inherited male sterility char-
acters and f lavor components from the species cross Bras-
sica nigra (L.) Koch ×B. oleracea L. J Amer Soc Hor tic Sci
97, 397-402.
Ryschk a U, Schum ann G, Klocke E, Scholze P, Neumann M
(1996) . Somatic hybridization in Brass icaceae. Ac ta Hortic
407, 201-208.
Sacristan M D, Gerde mann-knorck M, Schie der O (1989).
Incorporation of hygromycin resistance in Brassica ni gra and
its transfer to B. napus through asymmetric protoplast fusion.
Theor Appl Genet 78, 194-200.
Sigarava MA, Earle ED (1997) . Direct transfer of a cold-tolerant
Ogura male-sterile cytoplasm into cabbage (Brassica oleracea
ssp. capi tata ) via protoplast f usion. Theor Appl Genet 94,
213-220.
Sjödin C, Glime lius K (1989) . Trans fer of resis tance against
Phoma l ingam to Brassica napus by asymmetric somatic hy-
bridization combined w ith toxin selection. Theor Appl Genet
78, 513-520.
Vicente JG, Conway J, Rober ts SJ, Taylor JD (2001). Iden-
tif ication and or igin of Xanthomonas campes tri s pv .
campestr is races and related pathovars. Phytopathology 91,
492-499.
Vicente JG, Taylor JD, Sharpe AG, Park in AP, L idiate DJ,
King GJ (2002). Inheritance of race-specif ic resistance to
Xanthomonas campestr is pv. campes tr is in Brass i ca
genomes. Phytopathol ogy 92, 1134-1141.
Vlahova M, Hinnisdaels S, Frulleux F, Claeys M, Atanassov
A, Jacobs M (1997). UV ir radiation as a tool for obtaining
asymmetr ic somatic hybr ids betw een Ni coti anapl um
bagini folia and Lycopersi con eculentum. Theor Appl Genet
94, 184-191.
Yue W, Xia GM, Zhi DY, Che n HM (2001) . Trans fer of salt
tolerance f rom Ael eutopus l i ttorali s Sinens is to w heat
(Triti cum aestivum L.) via asymmetric somatic hybridization.
Plant Sci 161, 259-263.
184 植物学通报 25(2) 2008
Development and Identification of Interspecific Somatic Hybrids
Between Cauliflower and Black Mustard
Li Zhang1, 2, Hong Zhao2, Bin Chen2 , Fan Liu2*
1Co lle ge of L ife Scien ces, Capital Normal Un iversit y, Bei jin g 1 0003 7, Chi na
2Ve getable Re sea rch Cen ter, Beij ing Aca demy o f Ag riculture and Fo restry Sci ences, Bei jin g 1 000 97, Chi na
Abstr act Interspec if ic somatic hybrids of black mustard and caulif low er w ere produced by asymmetr ic somatic hybridization to
introduce disease-resistance genes of w ild spec ies into Brassica c rops . Hypocotyl protoplasts of Brassica oleracea var. botryti s,
genotype 0307, possess high regeneration capacity . B. nigra, genotype St.461, show s resistance to black rot, black leg and
clubroot diseases . Hypocoty l protoplasts of 0307 w ere fused w ith UV-ir radiated mesophyll protoplasts of B. nigra by the PEG
method. Approximately 170 regenerated plants w ere obtained, and 30 of 40 plants w ere ver if ied as somatic hybrids by morphologi-
cal observation, and w ith RAPD and sequence-related amplif ied polymorphism (SRAP) molecular markers. Chromosome analys is
show ed 23% of the hybr id plants w ith f ew er than 34 chromosomes , the sum of donor and recipient parents. Flow cytometry
revealed mos t of the hybrid plants w ith DNA content tw o to four t imes greater than that of the fusion rec ipient but 20% w ith a
content less than that of the sum of donor and rec ipient parents.
Ke y w ords asymm etric soma tic hybri diza tio n, bla ck mustard , caul ifl owe r, h ybrid ide nti fica tio n, pla nt rege nerati on
Zhang L, Zhao H, Chen B, Liu F (2 008). De velo pmen t an d id enti ficatio n of intersp ecif ic soma tic hybrids between cau lifl ower and bla ck
mu stard. Ch in Bull Bo t 25 , 17 6-18 4.
*A uthor for correspondence. E-mail: liufan@nercv.com
(责任编辑: 白羽红)
第九届全国植物基因组学大会
基因组研究已成为生命科学最活跃的领域之一。近 10多年来, 我国的植物基因组和分子生物学研究取得了举
世瞩目的成果, 克隆了一批重要基因并阐明了其功能, 为作物分子设计与遗传改良奠定了良好的基础。为了及时了
解国内外植物基因组和分子生物学研究的最新进展, 促进国内和国际同行之间的学术交流与合作, 定于2008年7月
18-20日(17日报到)在广州召开第九届全国植物基因组学大会。欢迎国内外从事相关研究的专家学者和研究生参
会 。
大会设 5个讨论专题: (1)基因组研究的新领域; (2)作物功能基因组; (3)植物小分子 RNA 和非编码 RNA; (4)生
物与非生物逆境; (5)种质资源与自然变异。
联系方式
联系人: 郭晶心 地址: 广东省广州市天河区五山华南农业大学 邮编: 510642
电话: 020-85288399, 020-88283982 传真: 020-85280200 手机: 13910020989
E-mail: pgc2008@scau.edu.cn
第二轮通知将于 4月中下旬发布, 请登录 ht tp: //www.plantgenomics.cn/