全 文 ：植物学通报 2005, 22 (5): 579~583
Chinese Bulletin of Botany
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: ly433@163.com
收稿日期: 2004-01-07 接受日期: 2004-04-19 责任编辑: 崔郁英,于昕
新鲜大蒜中蒜氨酸酶的分离纯化及性质
李 燕 王 荣 李 冠 苟 萍①
(新疆大学生命科学与技术学院 乌鲁木齐 830046)
摘要 用葡聚糖凝胶G-200层析柱分离纯化了新鲜大蒜(Allium sativum)中的蒜氨酸酶, SDS-PAGE结
果为单一条带, 分子量为53 kD在35 ℃下以蒜氨酸为底物, Km为 0.693 mmol.L-1, Vmax 为0.353 mmol.
min-1, 最适反应温度为30 ℃, 热稳定的温度在50 ℃以下。Zn2+对酶有抑制作用, Mn2+使酶活力增加。
关键词 大蒜, 蒜氨酸酶, 分离纯化, 性质
Purification and Properties of Alliinase from Fresh Garlic
(Allium sativum)
LI Yan WANG Rong LI Guan GOU Ping
(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046)
Abstract Alliinase (EC.4.4.1.4) of fresh garlic (Allium sativum) was purified 14-fold by gel filtration
on a SephadexG-200 system. SDS-PAGE revealed a molecular weight of 53 kD, with Km and Vmax
values of 0.693 mmol.L-1 and 0.353 mol.L-1, respectively. The optimal temperature for activity
was 30 ℃, with stable activity below 50 ℃. The activity was inhibited by Zn2+ stimulated by
0.1 mol Mn2+.
Key words Garlic, Alliinase, Purification, Property
实 验 简 报
大蒜为百合科葱属植物, 有丰富的营养成
分和药用价值。在民间传统医术中常用于治
疗传染病, 预防中风和心血管疾病。医学证明
大蒜在杀菌、抗血栓、防治动脉硬化、预治
中风和高血压等有显著的疗效, 近年来又发现在
防治肿瘤中也有独特的作用(于红霞和赫连玉
良, 1995)。大蒜原产地在新疆, 药用成分含量
高, 有广阔的开发利用前景(江苏中医学院,
1993)。已知大蒜中的药用成分主要是含硫化
合物, 即蒜氨酸酶(alliinase,EC4.4.1.4)催化蒜氨酸
(alliin, 烯丙基硫代半胱氨酸亚砜)生成的大蒜辣
素(allicin)及阿霍烯(ajoene)等成分。目前国内
外的大蒜制品多为蒜粉和大蒜提取物, 由于蒜氨
酸酶含量及活性低造成这些产品的药理作用及
疗效不显著, 因此对蒜氨酸酶的分离纯化及性质
的研究是开发应用蒜类药用产品的关键。本
文对生长在新疆吉木萨尔县的新鲜大蒜鳞茎中
蒜氨酸酶进行了分离纯化，并对其性质进行
了初步研究,为新疆大蒜进一步的开发利用提供
理论参考。
580 21(5)
1 材料和方法
1.1 材料
生长在新疆吉木萨尔且的新鲜大蒜 (Allium
sativum)鳞茎。
1.2 底物
20 mmol.L-1蒜氨酸。
1.3 酶活性测定
以20 mmol.L-1的蒜氨酸为底物, 用丙酮酸
法测定酶活性(王秀奇等, 1999)。在35 ℃条件
下, 每分钟产生1 mmol丙酮酸定义为1个活力
单位(U)。1.0 mL酶液加2.0 mL底物在35 ℃下
反应5分钟后, 加3 mL10%三氯乙酸终止反应,
吸取2.0 mL反应物与0.5 mL 2,4-二硝基苯肼充
分反应后, 加入5 mL 0.5 mol.L-1 NaOH摇匀显
色, 用752紫外分光光度计在波长520 nm处测
定光吸收(OD)值。
1.4 蛋白质浓度测定
蛋白质浓度测定采用Bradford (1976)
方法。
1.5 Sephadex G-200柱层析
将SephadexG-200(Pharmacia)处理后，装
入层析柱 (2.0 cm × 40 cm) (层析试验冷柜(0~10
℃)中固定)(张龙翔等, 1982), 用50 mmol.L-1 pH
7.0的Na/K磷酸洗脱缓冲液平衡(参照Nock and
Mazelis, 1987方法), 将透析后的酶液上清液适
当浓缩后凝胶过滤,洗脱,流速0.5 mL.min-1, 每
管收集5 mL, 测定洗脱液中蛋白质含量和蒜氨
酸酶活力。
1.6 SDS-聚丙烯酰胺电泳
采用12 %的分离胶, 5 %的浓缩胶进行电
泳分析。
2 结果
2.1 酶的分离纯化
称取100 g新鲜大蒜鳞茎, 加入100 mL 4 ℃
预冷的Na/K磷酸缓冲液(20 mmol.L-1，pH 7.
0 )(参照Nock and Mazelis, 1986方法)。用组
织破碎仪破碎细胞后 4 ℃ 3 000 g离心15 分钟,
上清液用25%~75%间隔10%的饱和度硫酸铵
沉淀, 4 ℃ 20 000 g离心20 分钟, 测定沉淀中的
酶活性。图1 结果表明, 30%~55%饱和硫酸铵
沉淀的酶活性较高。
30%~55%分级沉淀得到的蒜氨酸酶用Na/
K磷酸缓冲液溶解后用含10 %甘油, pH 7.0的
蒸馏水透析, 浓缩后酶液上葡聚糖G-200柱
(2.0 cm × 40 cm), 用50 mmol.L-1 pH 7.0 Na/K磷
酸洗脱液洗脱, 分步收集, 将集中洗脱的蒜氨酸
酶测定酶活性。浓缩后酶液, 经SDS-PAGE凝
胶电泳检测, 显示单一条带，分子量为53 kD
(图 2)。蒜氨酸酶纯化步骤见表 1，由表 1可
看出新鲜大蒜经硫酸铵沉淀、SephadexG-
200柱层析得到纯化的 14倍较纯蒜氨酸酶，
但其得率不高。
2.2 温度对酶活性及热稳定性的影响
将纯化后的酶液和底物在不同温度下保温
5 分钟后测定酶活性, 结果表明, 酶的最适反应
温度为30 ℃(图3)。将酶在不同温度下保温30
分钟后冷却, 再在30 ℃下测定酶活性, 以保温
的酶活性测定为100%, 结果表明酶的热稳定性
不好，在 50 ℃以下较稳定(图 4)。
2.3 米氏常数测定
在不同底物浓度下测定酶活性, 用双倒数
图 1 硫酸铵分级沉淀蒜氨酸酶
Fig.1 Isolation of alliinase by saturated (NH4)2SO4
fraction
5812004 李燕 等: 新鲜大蒜中蒜氨酸酶的分离纯化及性质
作图法(Lineweaver-Burk)作图(图5)表明, 酶的
Km=0.693 mmol.L-1, Vmax = 0.353 mmol.min-1, 回
归方程为Y=1.964x+2.8338, r = 0.999。
2.4 金属离子对酶活性的影响
将2.0 mmol.L-1的金属离子和酶液1:1混合,
使金属离子的终浓度为1 mmol.L-1。测定酶的
活性, 以不加任何金属离子测定为对照。结果
表明: Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+和 Fe2+离子
对酶活力影响不显著, Zn2+对酶有抑制作用,
Mn2+能增加酶活力(图 6)。
3 讨论
新鲜大蒜的提取液经(NH4)2SO4沉淀后透
析, 再经SephadexG-200层析可分离得到14倍
纯化的蒜氨酸酶。Nock和Mazelis(1986)以及
Krest和Keusgen(1999)采用羟基磷灰石柱和伴
刀豆蛋白A亲合柱两步层析, 分别得到纯化6倍
和11倍的蒜氨酸酶。我们的方法较之而言简
便且纯度高。本实验从新鲜大蒜中提取的
蒜氨酸酶以外消旋蒜氨酸为底物测得
图 2 蒜氨酸酶 SDS-PAGE电泳图谱
1.葡聚糖凝胶层析洗脱液; 2.低分子量蛋白标准; 3.
30%~55% 饱和(NH4)2SO4 沉淀的酶蛋白
Fig.2 SDS-PAGE of alliinase
1.Purified alliinase; 2. Low-molecular weight protein
marker; 3. Dialysate of 30%-55% (NH4)2SO4 fraction
图 3 温度对蒜氨酸酶活性的影响
Fig.3 Effect of temperture on alliinase activity
图 4 蒜氨酸酶热稳定性曲线
Fig.4 Curve thermal stability of alliinase
图 5 蒜氨酸酶Km值测定
Fig.5 Km assay of alliinase
582 21(5)
即蒜酶的最适底物(Stoll and Seebeck,1951), 而
我们采用的底物是从新鲜大蒜中提取的外消
旋蒜氨酸(S-烯丙基 -L-半胱氨酸亚砜)。此
酶最适温度为30 ℃, 比文献报道(Stoll and
Seebeck,1947)蒜氨酸酶最适反应温度为37
℃低。通过测定金属离子对蒜氨酸酶活性
的影响发现 : Z n 2 + 离子对酶有抑制作用 ,
Mn2+对酶有一定的激活作用, 而Mazelis 和
Crews (1968)以S-烷基 -L-半胱氨酸亚砜为
底物, 通过乳酸脱氢酶法测定酶活性, 结果认
为 Fe2+、Mg2+、Mn2+和 Co 2+离子能增加
酶活性, Cu2+离子对酶有抑制作用, 这可能是
由于底物不同, 活性测定方法不同造成。蒜
氨酸酶极其不稳定, 提取过程中若温度较高,
在空气中放置时间长, 均会导致酶活性完全
丧失，加入甘油、PVP和NaCl等能提高酶
的稳定性。
表 1 蒜氨酸酶的纯化
Table 1 Summary of garlic alliinase purification
Volume Total Total Specific Purification Recovery
Fraction (mL) protein activity activity -fold (%)
(mg) (mmol) (mmol·mg-1)
Homogenate 100 3570 69 19.3 1.00 100
30%-55% (NH4)2SO4 fraction 20 829.4 27.2 32.79 1.70 23.23
Dialysis 50 681 28.8 42.29 1.85 19.08
Sephadex G-200 10 264 71.93 272.39 14.11 7.39
图 6 金属离子对蒜氨酸酶活性的影响
Fig.6 Effect of cations on the alliinase activity
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他们使用天然的(+)-S-烷基 -L-半胱氨酸亚砜,
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拟南芥学术研讨会 2005
Workshop on Arabidopsis Research 2005
为促进我国拟南芥科研人员的交流与合作, 第四届“拟南芥学术研讨会 /Workshop on Arabidopsis
Research 2005”定于 2005年 11月 30日在北京举行。研讨会由中国科学院遗传与发育生物学研究所和
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所主办, 植物基因组学国家重点实验室、植物分子遗
传国家重点实验室、蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室、植物生理生物化学国家重点实验
室、植物细胞与染色体工程国家重点实验室、中国科学院光合作用与环境分子生理学重点实验室、中
国科学院分子发育生物学重点实验室、Journal of Integrative Plant Biology(原《植物学报》)等单位联
合承办。
研讨会将邀请国内从事拟南芥研究的专家到会, 同时也邀请从事其他植物分子生物学研究的专家参
加会议, 以大会报告、分组报告(分为植物生长发育的分子机理和植物信号转导分子机理两个专题)和论
文集的形式进行学术研讨和交流。
会议组委会成员：
主席: 许智宏 院 士 (北京大学校长, 中科院上海生科院植物生理生态所)
李家洋 院 士 (中科院副院长, 中科院遗传发育所)
成员: 方荣祥 院 士 (中科院微生物所, 植物基因组学国家重点实验室主任)
薛勇彪 研究员 (中科院遗传发育所所长)
陈晓亚 研究员 (中科院上海植物生理生态所所长, 植物分子遗传国家重点实验室主任)
薛红卫 研究员 (中科院上海植物生理生态所副所长)
种 康 研究员 (中科院植物所副所长, 中科院光合作用与环境分子生理学重点实验室主任,
Journal of Integrative Plant Biology副主编)
朱玉贤 教 授 (北京大学, 蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室主任)
武维华 教 授 (中国农业大学, 植物生理生物化学国家重点实验室主任)
王道文 研究员 (中科院遗传发育所, 植物细胞与染色体工程国家重点实验室主任)
杨维才 研究员 (中科院遗传发育所, 中科院分子发育生物学重点实验室主任, 国际拟南芥科学
协调委员会MASC中国代表)
左建儒 研究员 (中科院遗传发育所)