全 文 ：海藻糖及其在生物工程方面的应用*
陈杰1 何聪芬1 ** 叶兴国2 ** 董银卯1
( 1北京市植物资源研究开发重点实验室北京工商大学,北京 100037; 2中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081)
摘 要: 自海藻糖发现以来对其化学性质、生理功能、作用机理、代谢途径等已进行了较为深入的研究,其分
子生物学的研究也渐渐兴起。研究表明海藻糖能提高生物体对干旱、低温、高温、pH、盐渍等逆境条件下的抗性。
离体试验表明海藻糖能保护生物膜、蛋白质的结构并能保持逆境下的酶活性,同时, 外源海藻糖同样对生物体有保
护作用。由于海藻糖具有这些独特的生物学功能,它已在许多方面得以应用, 可作为食品工业的一种添加剂和甜
味剂,使干燥食品在得水后保持原有的色、香、味; 也可作为医药工业的非特异性生物制品和生化药品保护剂,使其
在常温下保存,从而降低运输与储存费用; 另外,在农业研究中可利用现代分子生物技术培育表达海藻糖的转基因
作物,提高农作物的抗旱、抗冻等抗逆性能。
关键词: 海藻糖 抗逆 生物学功能 合成途径 转基因
Trehalose and Its Application in Bioengineering
Chen Jie
1 He Cong fen1 Ye Xingguo2 Dong Yinmao1
( 1 Bei j ing Te chnology and Business Univ ersi t y , K ey lab of P lan t Resourc es R esearch and Dev elop ment ,
Bei j ing 100037; 2 Inst i tut e of Cr op S ci ence s, Chinese A cademy of A g ri cul tural S ci ence s, Bei j ing 100081)
Abstract: Since the discovery o f trehalo s, it has been deeply studied on chemical pr operty , phy siolog ical func-
tion, w orking mechanism and metabo lic pathw ay. Its molecular biolog ical reseaches are also g radually emphasized.
St udies have show n that the endogenous t rehalo se can raise the resistance o f o rganism against dr ought, low tempera-
tur e, high temperatur e, unstability pH , salt and so on. Experiment in v itro indicated that trehalo se can protect the
membrane, pr otein st ruct ur e and ma int ain the activities of some enzymes on st ress condition. Moreover , exogenesis
trehalo se also can protect the or ganism from the damage of abiotic stress. Because of those par ticular characters,
trehalo se has been applied in many fields including food production, co smetic industry , medicine industry , bio lo gy
research, ag ricult ur e research.
Key words: T rehalose Stress resistence Bio log ic function Metabo lic pathway T ransgeno sis
某些植物种子、酵母细胞、真菌孢子和许多微生
物,在其细胞内的水分完全或几乎完全失去时,仍然
能以一种极低新陈代谢状态长期生存, 脱水数十年
后再得水仍能恢复活性, 其奥妙就是体内积累了大
量的海藻糖( T rehalose) [ 1] 。海藻糖是一种非还原
性双糖,由 2个葡萄糖分子通过 , -1, 1 糖苷键结
合而成。海藻糖最早是由 w igger s等于 1882 年从
黑麦的麦角菌中分离, 随后又在许多微生物和动植
物中发现有海藻糖存在。海藻糖在自然界中广泛分
布,主要是在低等植物、藻类、细菌以及一些无脊椎
动物中。特别是在酵母、霉菌以及蘑菇等真菌中,海
藻糖含量可达干重的 15%以上 [ 2]。在一些无脊椎
动物如虾、昆虫的血淋巴中也存在海藻糖,甚至一些
昆虫血糖的主要成分就是海藻糖。海藻糖化学性质
稳定,不能使斐林试剂还原, 也不能被糖苷酶水解;
同时,海藻糖还有非特异性保护作用与抗辐射作用,
且不含结晶水的海藻糖,相对湿度 30%以上有很强
的吸湿性。大量的研究结果已经证实, 海藻糖对生
收稿日期:修回日期: 2005- 09-01
* 基金项目:北京市教委,北京市基金科技重点项目(编号: KZ200410011006)
作者简介:陈杰( 1980- ) ,男,江苏扬州人,北京工商大学在读硕士研究生,研究方向为植物基因工程
** 通讯作者:叶兴国,电子信箱: hecf@ th . btbu. edu . cn yex g@ mail . caas. n et . cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
物大分子的活性具有良好的保护效果, 对生物体起
着抗逆保护作用 [ 3]。
1 海藻糖的商业价值
由于海藻糖有着许多优良的性质与功能, 近年
来海藻糖被广泛应用于食品、保健品、医药及化妆品
方面。食品和保健品方面, 由于海藻糖水溶液性质
稳定,无色无味,入口清凉,甜味极弱;且与氨基酸和
蛋白质混合加热也不会发生褐变; 在人体内可酶解
为葡萄糖,具有保护蛋白质结构及抗干燥作用。因
此,在食品加热浓缩或干燥之前加入,可防止蛋白质
变性,干燥产品冲调后非常接近原物 [ 4]。另有报道
口服海藻糖可改善骨质疏松症。日本林原研究所用
摘除卵巢的骨质疏松症模拟小鼠做实验, 证明海藻
糖能抑制骨重量减少。对人体也进行了实验, 证明
摄食海藻糖可预防骨质疏松症 [ 5]。海藻糖在医学上
的应用主要是作为诊断药的稳定剂。例如, 应用于
移植内脏器的储存、淋巴激素、生物制剂、抗生素、维
生素、酶以及各种容易失去活性的物质改良与稳定。
Gillian等研究发现成体胰岛用海藻糖冷冻保存的存
活率比用二甲基亚砜( DMSO)保存的要高, 且胰岛
中胰岛素的含量和分泌能力是未加保护的 14倍[ 6]。
海藻糖也可用于牙膏、内服药、糖衣片剂等中作为甜
味剂、呈味改良剂、品质改良剂、稳定剂。海藻糖还
有极强的保湿作用, 防晒, 防紫外线作用也相当显
著,所以将其用于化妆品, 能使皮肤免遭干燥、日晒
和冷冻之害。目前用于化妆品的主要是海藻糖的衍
生物,在日本, 海藻糖因其本身的保湿性, 已被卫生
部批准为新的化妆品原材料[ 7] 。
2 海藻糖的生物学功能
大量证据表明, 海藻糖具有保存生物活力的特
殊功能, 它独特的对生物的抗脱水、抗冷冻、抗高渗
的保护作用使其作为一种天然的非特异性生物保护
物质而倍受关注。
2. 1 对生物膜的保护作用
膜表面结合水的存在对膜的稳定及保持完整有
着重要作用。正常情况下, 膜表面都存在大量的结
合水, 而一旦失去结合水, 膜结构将发生一系列变
化,出现诸如磷脂相变温度升高, 磷脂侧向相分离,
膜脂缺陷及形成非双层相等, 从而使膜通透性增高
乃至产生膜融合。海藻糖或其它糖类(甘露糖,葡萄
糖等)由于拥有许多羟基,能够替代水和磷脂头部发
生氢键结合,从而取代失去的结合水,维持着膜表面
水化状态。Cr ow e等[ 8]从兔肌肉中分离得到的肌
浆网,在没有海藻糖的条件下进行干燥时, 其形态发
生改变, 再水化时, 其转运钙的功能明显丧失。然
而,当存在一定浓度海藻糖时(相当于无水生活体内
的浓度) , 在干燥过程中, 形态几乎不受损害, 再水化
时,转运钙的能力可恢复到原有水平。用其它生物
膜作实验也得到类似的结果。童济 [ 9]等发现存在海
藻糖时,包载抗肿瘤药物的阿糖胞苷和阿霉素的脂
质体,经干燥再水化后,其原有的内含物 80%以上被
保留下来,比无海藻糖存在时增加 4倍以上。
2. 2 对蛋白质的保护作用
蛋白质尤其酶在干燥过程中很容易失活, 例如
磷酸果糖激酶( PFK)是四聚体,在干燥过程中能解
离成无活性的二聚体。如果在干燥前加人一定量的
海藻糖,即使极度干燥, PFK 完全稳定而且仍保持
原活性[ 10]。海藻糖具有稳定干燥蛋白质(酶)的功
能, 李建伟等研究了海藻糖和其他几种糖在不同温
度条件-20 、30 、40 下以及不同浓度的各种糖
对粗酶液的保护情况,结果表明, 不同温度下, 海藻
糖对粗酶液热稳定性都有很好的保护作用,而且温
度越高, 保护作用越显著, 海藻糖最佳保护浓度为
10% ~ 15%
[ 11]。Cam ilo 等把 EcoRI, Bg III, Pst I 和
HindIII 等内切酶和 T 4-DNA 连接酶在含海藻糖的
缓冲液中于 37 通风干燥, 干燥后的酶在 70 保存
35d仍能精确地切割和连接 DNA, 而其它种类的糖
起不到这种保护作用, 未加海藻糖的酶其活性完全
丧失。
2. 3 对其他生物分子的保护作用
近年来研究表明, 海藻糖不但可以保护生物膜
及蛋白质分子免受干燥与冷冻的破坏, 而且还可以
保护细胞中 DNA 分子, 使其在强辐射条件下免受损
害, 对有机溶剂甲苯也有抗性[ 12] 。英国剑桥的
Quadrant研究基金会把口服小儿麻痹症疫苗与海
藻糖一起干燥, 发现干燥状态下, 45 时其稳定性和
液态 4 保存条件时相当。计融等的试验结果表明,
海藻糖浓度为 0. 250mol/ L 时,抗体可以在室温下存
放 1年而仍然具有活性[ 13 ]。颜栋美等[ 14] 研究表明,
当海藻糖/磷脂比例达到 1 1时, 基本能抑制脂质
30 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
体的融合;当海藻糖/磷脂比例达到 2: 1 以上时, 脂
质体的保存率达到 90%以上,在足够数量的海藻糖
存在下,通过真空干燥保存载药脂质体是可行的。
3 海藻糖在生物体内的合成途径及相关基
因的克隆
在不同生物中, 海藻糖的生物合成途径并不完
全相同,目前至少已发现 3种途径。可以相信,随着
研究的深入, 新的海藻糖合成途径还有可能在其它
物种中发现。
3. 1 以葡萄糖为底物的海藻糖合成途径
大肠杆菌和酵母可利用海藻糖-6-磷酸合成酶和
海藻糖-6-磷酸酯酶合成海藻糖,该途径是先由 6-磷
酸海藻糖合成酶催化尿苷二磷酸葡萄糖( UDP)和 6-
磷酸葡萄糖反应生成 6-磷酸葡萄糖, 然后再在 6-磷
酸海藻糖磷酸脂酶的作用下脱磷酸最终生成海藻
糖。在大肠杆菌中编码上述两种酶的基因分别为
OtsA 和 OtsB [ 15] 。而在酵母中编码上述两种酶的基
因分别为 T PS 1和 TPS2[ 16] 。而大多数生物中海藻
糖的合成正是采用这种途径。
另外在担子菌灰树花中海藻糖是D-葡萄糖和-
葡萄糖-1-磷酸在海藻糖合酶 ( Tsase ) 催化下合
成[ 17]。
在 Euglena gr aci l is , F lam mulina velutip es ,
Br ady rhiz obium j ap onicum , 及 Micr ococcus var i-
ans 中存在海藻糖磷酸化酶, -葡萄糖-1-磷酸和葡萄
糖在海藻糖磷酸化酶催化下生成海藻糖和磷酸。E.
graci li s 的海藻糖磷酸化酶在生理条件下可催化两
个方向的反应, 而 F. v elut ip es 的海藻糖磷酸化酶在
生理条件下仅催化磷酸水解, 原因是酶对葡萄糖的
Km 值非常高, 对 M. Var ians 海藻糖磷酸化酶反应
的平衡常数计算的 G 为-414KJ( pH7. 0, 25 ) ,
表明平衡倾向于海藻糖的合成, 但还要取决于生理
条件下的底物浓度[ 18] 。
3. 2 以淀粉为底物的海藻糖合成途径
1993年,在日本群马县酸性温泉中分离到一种
嗜超高温古细菌 硫矿硫化叶菌( S ul f olobus sol-
f atar icus KM 1) , 该菌可利用淀粉产生海藻糖[ 19]。
首先,糖原的 -1, 6 葡萄糖键, 经异淀粉酶水解, 生
成直链淀粉, 其次, 通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶
( M TSase)的分子内转移作用,直链淀粉的 - 1 , 4-
键变换为 , -1, 1-键,生成淀粉西尔海藻糖, 再通过
麦芽寡糖基海藻糖水解酶( M T Hase)特异的水解作
用,生成海藻糖。反应式为:
目前, 这一海藻糖合成途径已在节杆菌( A r-
throbacter sp. str ain Q36)
[ 20]
, 根瘤菌 ( Rhiz obium
sp. st rain M 11) [ 21] , 微黄短杆菌 ( Br ev ibacter ium
helv olum )
[ 22]及结核分枝杆菌( My cobacterium tu-
ber culosi s)
[ 23] 中被证实。在这一途径中, MT Sase
是由 T re Y 基因编码, 而 MTHase 则是由 Tr eZ 编
码。
3. 3 以麦芽糖为底物的海藻糖合成途径
该途径作用的底物是麦芽糖( M altose) ,反应将
, -1, 4 糖苷键连接的麦芽糖转化为 , -1, 1糖苷
键 连 接 的 海 藻 糖。该 途 径 是 在 脂 肪 杆 菌
( Pimelobacter sp. R48) [ 24]和水生栖热菌( T hermus
aquat icus ) [ 25] 两株菌中发现的。其作用机制与
MTSase 类似,也是分子内的转糖基化作用。该反
应同时也是上述 3个海藻糖合成途径中惟一一个具
可逆反应的途径, 即该酶也可以将海藻糖转化为麦
芽糖。在这一途径中海藻糖合成酶是由 T reS基因
编码的。
3. 4 海藻糖合成酶相关基因的克隆
有关海藻糖代谢途径的研究已取得了较多成
果,也相继从多种微生物中克隆了海藻糖合成的相
关基因, 20世纪 90年代初, Kassen等对大肠杆菌海
藻糖合成酶基因进行了分子克隆, 他认为在由高渗
透压诱导大肠杆菌的海藻糖合成途径中, OtsA 基
因和OtsB 基因分别编码海藻糖-6-磷酸合成酶和海
藻糖-6-磷酸磷酸酯酶, 两基因组成一个操纵子,
312005年第 6期 陈杰等:海藻糖及其在生物工程方面的应用
OtsB 基因离启动子较近, OtsA 基因离启动子较远,
二基因重叠 23bp, 其编码的蛋白质分子量分别为
29. 1KD和 53KD[ 15]。Bel l W 等于 1992年从面包
酵母中克隆了 TPS1基因和 T PS2基因[ 16]。Mar u-
ta K等 1996年从 A rthr obacter sp 和Rhiz obium sp
克隆了编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基
海藻糖水解酶的 T r eY 基因和 T r eZ 基因 [ 18, 19]。
Tsusaki K等于 1996年和 1997年分别从脂肪杆菌
( Pimelobacter sp. R48) [ 24]和水生栖热菌( T hermus
aquat icus )
[ 25] 中克隆了 Tr eS 基因。另外 Saito K
于 1998年从担子菌灰树花 ( Gr i f ola f r ondosa ) [ 17]
中克隆了编码海藻糖合酶的基因。在这些基因中,
以大肠杆菌 OtsBA 基因和酵母 T PS 1基因研究最
多,应用最为广泛。
4 高等生物中海藻糖的发现及外源海藻糖
对植物的保护作用
高等植物体海藻糖最初是从 S. lep idop hy l la
中分离得到的, 在极度干旱条件下,体内海藻糖含量
达到 20%。在抗干燥的被子植物 M . f label l if ol ius
中也检测到海藻糖的存在, 且体内海藻糖含量和失
水程度有关。为在植物中找到产海藻糖的 DNA 序
列,科研人员将大肠杆菌和酵母菌的海藻糖合成酶
基因序列同植物基因数据库进行比较, 他们发现, 拟
南芥和水稻中的某些克隆同大肠杆菌和酵母有高度
同源的序列表达标签( EST ) [ 26]。1998年, vog el 等
用拟南芥的 cDNA 文库在酵母的 T PS2突变体中表
达,结果这个对温度极其敏感的突变体在 38. 6 的
高温下存活。在拟南芥中, 他发现了两种基因, 即
AtTPA 和 AtT PPB,二者均能编码 6-磷酸海藻糖磷
酸酯酶而与酵母 T PS2 突变体进行功能互补 [ 27]。
以上实验结果证明某些植物中也具有合成海藻糖的
能力。这就为把海藻糖合成酶基因导入植物并使其
在植物中表达提供了一定的科学前提。
外源海藻糖对生物体的保护作用多用微生物和
藻类为试验材料, 以植物为材料的研究报道很少。
邓如福试验表明: 1%海藻糖浸种, 经 2 和 6 低温
处理后,水稻幼苗细胞电解质渗透率远比对照低, 淀
粉酶活性及幼苗可溶性糖含量则远比对照高, 寒害
修复也比对照快;处理温度越低,海藻糖相对效应越
明显[ 22] 。丁顺华等以盐敏感小麦品种鲁麦为材料,
分别用完全 Hoag land营养液、150mmol/ L NaCl和
150mmol/ L NaCl+ 海藻糖处理小麦幼苗,测定小麦
幼苗生长、离子含量、根系质膜 H +-ATPase、SOD
活性、MDA 含量等指标, 结果表明: 外源海藻糖可
明显缓解盐胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用;明显
提高 NaCl胁迫条件下小麦幼苗叶片中 K + 的含量,
降低 Na+ 的含量;降低其 N a+ / K + ;提高 NaCl胁迫
条件下小麦幼苗 SOD活性;降低 MDA 的含量; 降
低细胞质膜透性; 缓解根系质膜 H +-AT Pase 活性
抑制[ 29]。以上研究表明,海藻糖在植物幼苗遭受低
温、盐害而脱水时,可以提高作物幼苗对低温和高盐
的抗逆能力。
5 海藻糖相关合成酶基因向植物中的遗传
转化
早期的分子生物学研究利用海藻糖基因转化植
物多以烟草为受体材料。Pilon-Sm its 等利用 Os-
tA, OstB转化烟草得到转基因烟草, 干旱胁迫下,转
基因烟草的产量提高, 叶片具有较高的光合速率,离
体叶片具有更好的保水性, 且具有较低的渗透势,含
较高的葡萄糖、果糖和蔗糖 [ 30]。Kjel-l Ove Holm-
strom 等利用来源于酵母中的 T PS 1 基因转化烟
草,以 1 , 5-二磷酸核酮糖羧酶加氧酶( Rubisco)的
小亚基引物控制其转录, 转基因烟草中积累了少量
的海藻糖,但是海藻糖的积累明显抑制了植株的生
长,离体叶片的保水性与用大肠杆菌海藻糖合成酶
基因转化的结果基本一致 [ 31]。王自章等利用农杆
菌介导法将从担子菌灰树花中克隆得到的海藻糖合
酶基因( T Sase )导入甘蔗, 明显提高了甘蔗对渗透
胁迫的能力[ 32] 。
尽管以上研究表明转海藻糖合成酶基因的植物
在抗逆性方面有所提高,但同时也看到,这些转基因
植物在提高抗逆性的同时,其表型也发生了一定的
变化,如转基因烟草植株变矮、茎变细; 转基因小麦
出现叶片变长、叶色浓绿、茎杆粗壮等特征。这些都
表明,转基因植物中海藻糖的表达及其相关代谢产
物的积累对植物的生长发育有一定的影响。为减少
这些不利影响,使海藻糖在植物体内诱导表达是一
个前提。
6 展望
以前由于种种因素,海藻糖的特性并不为人们
32 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
所熟知,但随着海藻糖生产方法的不断开发, 生产成
本的不断降低, 海藻糖的各种性质正逐渐被人们认
识与利用,海藻糖的应用领域也越来越广。目前, 海
藻糖相关酶的基因工程研究也成为热点, 将海藻糖
合成酶基因转入植物, 在提高植物本身抗逆性的同
时,植物体含海藻糖的量也提高了,这无疑又是一条
生产海藻糖的新路。芦荟是重要的经济植物, 由于
其在医疗、保健、食品、化妆品等领域的潜在价值, 越
来越受到人们的青睐, 逐步成为了生物工程研究的
对象。芦荟虽耐旱, 但不耐寒, 在贫瘠、干旱的土壤
生长缓慢、产量低。食用芦荟品种味苦、味感差, 这
些均构成了影响芦荟产业化的因素。虽然芦荟属内
资源丰富,但是芦荟开花不结实, 或结实率极低, 且
种子育苗成苗率低, 技术复杂。部分性状的改良不
能靠常规育种达到, 需要基因工程途径。本文作者
正试图将大肠杆菌海藻糖合成酶基因导入芦荟, 以
期提高芦荟生长阶段的抗寒, 耐盐能力,从而扩大芦
荟种植范围;并且, 可以增强芦荟医疗、保健产品的
功效和稳定性, 改善芦荟食品的口感,延长芦荟食品
保鲜期,提高芦荟化妆品的保湿、防止紫外线效果,
扩展芦荟美容产品的功效, 使人们通过芦荟产品来
享用海藻糖的特殊功效。目前已得到一些抗性植
株,有待进一步的分子和生物学检测。
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