全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
条浒苔(Enteromorphaclathrata)是重要的经济海藻,属绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、浒苔属,在我国
东南沿海均有分布。浒苔历来是食用大型海藻之一,特别受东南沿海人们喜爱[1]。浒苔含有藻胶及较多的碳
水化合物、维生素和氨基酸,同时还含有丰富的碘、钙、磷、钠、铁等其它微量元素;中医研究还认为,浒苔具
有凉血、泄热、消痰、软坚散结等诸多疗效,可见浒苔具有较高的食用和药用价值[2]。此外,条浒苔生长速度
很快,并被认为是一种比较理想的用于生态修复的大型海藻种类[3]。因此,开展浒苔基因工程研究,以培育
浒苔新品种和建立“海藻生物反应器”十分必要。
大型绿藻浒苔转化表达系统选择标记的筛选
叶静 1 张 2 李富超 2 秦松 2 何培民1
(1上海水产大学生命学院 教育部水产种质资源发掘与应用重点开放实验室,上海 200090;
2中国科学院青岛海洋研究所,青岛 266071)
摘 要: 主要研究了条浒苔对抗生素氯霉素和除草剂Basta的敏感性,以确定适合的阳性选择标记基因。应用不同
浓度氯霉素(0、25、50、75、100、125μg/ml)和Basta(0、5、12.5、25、37.5、50μg/ml)对不同发育时期条浒苔细胞存活率影响进
行了测定。实验结果表明:不同发育时期条浒苔对氯霉素和Basta的敏感性不同。其中最大浓度125μg/ml浓度的氯霉素
在15d内对条浒苔孢子和小苗两个不同发育时期的细胞均难以达到全部杀死效果,相对存活率仍分别为 1%和20%;而
Basta对条浒苔孢子和小苗均具有很强的杀生作用,其中 5μg/ml浓度的 Basta在 3d内可将条浒苔孢子全部杀死,
12.5μg/ml浓度下约一周时间可以将浒苔小苗全部致死。本实验结果提示bar基因有可能成为浒苔基因工程较理想的选
择标记基因。
关键词: 条浒苔 选择标记 氯霉素 Basta
ScreeningofSelectableMarkerforTransformationand
ExpressionSystem ofGreenSeaweedEnteromorphaClathrata
YeJing1 ZhangZhe2 LiFuchao2 QinSong2 HePeimin1
(1ColegeofAqualifeScienceandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090;
2InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao 266071)
Abstract: Inthispaper,theChloromycetinandBastasensitivitiesofsporesandseedlingsfrom Enteromorpha
clathrataweretested.DiferentconcentrationsofChloromycetin(0μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml,100μg/mland
125μg/ml)andBasta(0μg/ml,5μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,37.5μg/land50μg/ml)wereappliedforthesensitivity
test.TheresultsshowedthatE.clathratawasmoresensitivetoBastathanChloromycetin.After3culturedays,alspores
culturedwith5μg/mlBastaweredeadcompletely;andasforseedlings,12.5μg/mlofBastawasthelethalconcentration.
With125μg/mlChloromycetin,thesurvivalrateofsporesandseedlingswasabout1%and20%respectivelyin15days.The
experimentindicatedthatthebargene,whichencodesphosphinothricin-N-acetyltrensferase,wouldbeanideacandidateas
selectablemarkergene.
Keywords:Enteromorphaclathrata Selectablemarker Chloromycetin Basta
收稿日期:2006-03-31
基金项目:上海市重点学科建设项目资助(Y1101)
作者简介:叶静(1980-),女,硕士研究生,研究方向:从事海洋生物技术研究
通讯作者:何培民,教授,E-mail:pmhe@shfu.edu.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
藻类基因工程研究中很重要的一个环节是确立合适的选择标记[4]。高等植物基因工程中采用的选择试
剂主要有抗生素类、除草剂类、氨基酸类和氨甲喋呤[5],但在藻类基因工程研究中,需要重新进行系统研究。
大型海藻的选择标记研究首先是从海带开始的,发现海带对潮霉素、氯霉素比较敏感[6],进而又实现了氯霉
素乙酰转移酶基因(cat)在海带中的稳定表达[7]。以 cat与乙肝病毒表面抗原(rmsAg)基因共转化,并以氯霉素
进行筛选,得到了表达rmsag的转基因海带[8]。之后,藻类选择标记的工作在紫菜、金藻、盐藻、螺旋藻等相继
得到开展[9~13]。
目前,浒苔基因工程研究尚处于起步阶段。获得的浒苔原生质体可以再生,且藻段再生能力也很强,藻
体成活率高。但阳性选择标记的研究几乎为空白。本文选用藻类基因工程常用的抗生素氯霉素
(Chloromycetin)和高等植物的除草剂(Basta)研究条浒苔对其敏感性,以筛选出适合于建立浒苔转化表达系
统的阳性选择标记基因。
1 材料与方法
1.1 材料和培养
条浒苔为 2003年 1月采自江苏如东海区紫菜栽培架上,经过清洗去除杂藻后,在 0.2%KI溶液内处理
10分钟,再用消毒过的自然海水将其冲洗干净,暂养于室内。从条浒苔藻体中挑选 30株进行单株分离和纯
化培养。叶片洗净后,经过一定特殊培养使其放散孢子并形成小苗,然后在显微镜下分离单个小苗进行单独
培养,并作为株系进行保存,编号为:YSJ01-30。试验材料来自 YSJ12,培养条件为:光照强度为 35～45Mmol·
m-2·s-1,18℃,光照周期为 2L:12D,充气培养。每隔 4～5天更新藻体培养液[14]。
1.2 抗生素和除草剂溶液的配制
氯霉素购自华美生物工程公司,除草剂Basta由中国科学院海洋研究所秦松教授提供。抗生素母液配置参
照萨姆布鲁克文献[15],氯霉素母液浓度为50mg/ml,Basta为100mg/ml,并采用微孔滤膜(孔径为0.22Mm)过滤器
除菌备用。在无菌条件下配制不同浓度梯度,以检测条浒苔对抗生素氯霉素和除草剂Basta的敏感性(表1)。
表1 培养液中氯霉素和Basta的终浓度(μg/ml)
组别 1 2 3 4 5 6
氯霉素浓度 0 25 50 75 100 125
Basta浓度 0 5 12.5 25 37.5 50
1.3 敏感性实验
1.3.1 条浒苔游孢子敏感性实验 收集条浒苔叶片刚放散的游孢子并计数,分别培养于含有不同浓度氯
霉素和 Basta的 VSE培养液培养皿中,每组实验设 5个平行样。孢子起始密度为 106/ml,培养条件为光强约
45Mmol·m-2·s-1,光周期 12L:12D,温度 18℃。定期观察条浒苔的生长情况,并更换含有相同浓度氯霉素或
Basta的 VSE培养液。按照以下公式计算存活率和相对存活率:
存活率(%)=加入氯霉素或 Basta后孢子存活数/孢子初始培养数×100%
相对存活率(%)=试验组孢子存活率/对照组孢子存活率×100%
1.3.2 条浒苔幼苗敏感性实验 收集孢子附着后萌发生长约一周的小幼苗,藻体长度约为 5mm左右,培养
于含不同浓度氯霉素和 Basta(见表 1)的 VSE培养液培养皿中,每组实验设 5个平行样。培养条件同上,定
期在倒置显微镜(10倍物镜)下随机观察 10个视野并计数,并按照以下公式计算出幼苗死亡率。
死亡率的计算:10个视野中死亡的小苗数/10个视野中总的小苗数×100%
2 结果
2.1 条浒苔游孢子对氯霉素的敏感性
表 2为条浒苔游孢子在不同浓度氯霉素条件下培养不同时间后的相对存活率。从表 2可以看出,随着
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氯霉素浓度的升高和时间的延长,孢子相对存活率越来越低。3d内,各浓度实验组的孢子相对存活率均在
40%以下,未能完全杀死;即使在 125μg/ml最高浓度下,15d后其相对存活率还有 0.90%±0.005。
2.2 条浒苔小苗对氯霉素的敏感性
图 1为条浒苔小苗在不同浓度氯霉素和不同培养时间后的死亡率。从图 1可以看出,随着氯霉素浓度
的升高和培养时间的延长,小苗死亡率逐渐增加。其中 125μg/ml最高浓度组在培养 15d后,小苗死亡率最
高可达到72.00%±0.01。
图 1和图 2分别为对照组和实验组 125μg/ml条件下第 15d的生长情况。从图中可以看出,氯霉素最高
浓度组(125μg/ml)小苗在 15d后死亡率最高可达到 70%以上,且其小苗生长明显不如对照组好。
表2 氯霉素浓度对条浒苔孢子相对存活率的影响
图1 氯霉素浓度和培养时间对条浒苔小苗死亡率的影响
表3 Basta浓度对条浒苔孢子相对存活率的影响
2.3 条浒苔游孢子对 Basta的敏感性
表 3为条浒苔游孢子在不同浓度 Basta条件下培养不同时间后的相对存活率。从表 3可以看出,随着
Basta浓度的升高和时间的延长,孢子相对存活率越来越低。1d内,各实验浓度下孢子存活率均达到 50%以
下;3d内,各实验浓度组的孢子相对存活率均为 0%。
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
2.4 条浒苔小苗对 Basta的敏感性
图 2为条浒苔小苗在不同浓度 Basta条件下培养不同时间后的死亡率。从图 2可以看出,随着 basta浓
度的升高和时间的延长,小苗死亡率迅速增加。15d内,12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml和 50μg/ml实验浓度
组的小苗死亡率达到 100%;即使是 5μg/ml低浓度 Basta对条浒苔小苗也有 20.30%+0.009的致死作用。
图版 1和图版 3、图版 4分别为对照组(Basta浓度为 0μg/ml)和实验组 5μg/ml、50μg/ml条件下培养 15
天后条浒苔小苗的生长情况。从图可以看出,在 50μg/ml高浓度下,15d后 Basta对小苗的致死作用为 100%;
在 5μg/ml低浓度 Basta选择压力下,条浒苔小苗的生长明显受到抑制,不如对照组。
3 讨论
抗性选择标记的确立,是阳性转化子大规模筛选和生产的前提条件,也是基因工程研究的基础[10]。现
在常用的选择试剂有抗生素、除草剂、氨甲喋吟和氨基酸[16]等。选用基因工程研究中常用的抗生素氯霉素和
除草剂 Basta对条浒苔孢子与小苗进行敏感性研究,发现除草剂 Basta对条浒苔孢子与小苗均有很好的致
死作用,可以参考作为浒苔基因研究中较合适的选择标记。
3.1 氯霉素对不同生长时期的条浒苔的影响
氯霉素干扰细胞内核糖体的蛋白质合成,抑制细胞生长并最终导致死亡,而 cat基因编码氯霉素乙酰
转移酶(chloramphenicolacetyltransferase,CAT),此酶使氯霉素乙酰化而失活。武建秋等[7]的研究表明海带对
Cm很敏感,cat基因可做为海带遗传转化的选择标记基因。在蓝藻中 Thiel等 [17]在转化鱼腥藻 M131
(Anabaenasp.M131)用 25μg/ml的 Cm筛选出了阳性克隆。沈怀舜[13]、张亚萍等[10]的研究亦表明,条斑紫菜
体细胞对氯霉索相当敏感,14d的半致死浓度小于 l00μg/ml。本实验研究表明,氯霉素对条浒苔孢子与小苗
的致死、抑制效力不同,但对两种材料均不能达到全部杀死的效果(见表 2、图 1)。在 125μg/ml氯霉素的压
力条件下培养 15d后,无论孢子或是小苗均有少部分材料存活下来,相对存活率分别为 1%和 20%。为了避
免在进行浒苔基因工程研究过程中假阳性藻株的出现,有必要选择另一种更有效的筛选剂。虽然氯霉素对
浒苔没有很好的致死作用,但它可能影响浒苔孢子的附着能力和条浒苔细胞的分裂,很多孢子因为无法附
着而最终死亡,而经氯霉素处理的幼苗的生长也明显不及对照组,这种现象有待于进一步研究。
3.2 Basta对不同生长时期的条浒苔的影响
Basta是一种高效、广谱的非选择性除草剂,它的作用机理是破坏叶绿体和抑制谷氨酰胺合成酶的活
性,从而抑制光合作用和导致氨的积累而使植株死亡[18]。bar基因作为选择标记基因已被成功地导入小麦、
大麦[19]、水稻[20]等 20多种植物中高等植物中[21]。秦松等[22]研究了孤雌生殖海带对除草剂草丁膦的敏感性,证
图2 Basta浓度对条浒苔小苗死亡率的影响
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明除草剂草丁膦可被作为海带基因工程的更为理想选择压力,bar基因可能成为更为有效的选择标记基
因。张贵星等[23]研究发现盐藻作为单细胞光自养绿藻对于草丁膦极其敏感,在液体培养基中 3μg/ml即可完
全抑制盐藻的生长。本实验研究表明,Basta对条浒苔孢子与小苗均具有很强的杀生作用,但不同生长时期
的条浒苔对 Basta的耐受时间和耐受浓度并不完全相同:孢子在含 5μg/ml Basta的培养液中培养 3d就全
部死亡,小苗则在含终浓度为 12.5μg/mlBasta的培养液中培养约一周均全部死亡。在进行 Basta对条浒苔
小苗的影响的研究中我们发现,5μg/ml的 Basta虽然对材料没有完全的致死作用,但对其生长的抑制作用
十分显然:该实验组存活的小苗(图版 I-3)生长速度及 15d后苗的大小明显低于对照组(图版 I-1),这可能
是由于低浓度的 Basta抑制了浒苔细胞的分裂。
综上所述,大型海藻海带、紫菜、浒苔均对氯霉素有很高的敏感性。然而,与氯霉素相比,Basta对大型绿
藻条浒苔有更好的致死作用,可被作为浒苔基因工程的更为理想选择压力,bar基因可能成为更为有效的
选择标记基因。
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