全 文 ：环孢菌素 A的研究进展及应用
刘阳 肖庚富
(武汉大学生命科学学院 ,武汉 430072)
摘 要: 环孢菌素 A 是从真菌中提取的一种新型免疫抑制剂,可选择性作用于 T 细胞, 抑制其活化,现主要
应用于器官移植时的排斥反应。工业上多以真菌孢子为原料, 发酵生产进而分离纯化的方法得到环孢菌素 A, 以
D-丙氨酸作为底物,在丙氨酸消旋酶和环孢菌素合成酶的作用下,通过复杂的 40 步反应也可以合成环孢菌素 A。
关键词: 环孢菌素 A 免疫反应 生物合成 应用
The Research Advances and Applications of CyclosporineA
Liu Yang Xiao Gengfu
( Biot ech nology Depar tment , Col leg e of L i f e S ci ence , Wuhan Univ er si t y , Wuhan 430072)
Abstract: Cyclo spo rineA is a new immunosuppressant ex tracted fr om To lypocladium inflatum which select ive-
ly inhibit s T cells activ ation and is primar ily applied in r ejection of o rgan tr ansplantation. Cyclospor ineA is obtained
in industry after fermentation of spores, futher iso lation and pur ification. T his rev iew focuses on its bio synthesis in
40 reactions in which D-alanine is the startam inoacid and cat alyzed by Cyclo spor ine synthases and its other uses for
the t reatment of immunity related diseases.
Key words: Cyclo spo rineA Immune reaction Bio synthesis application
免疫反应是机体排除外来物质如细菌、病毒和
动植物等的重要防御机制, 也是防止自身细胞变异
而致病的重要自稳机制。免疫调节是指在免疫反应
中,各种免疫细胞及其亚群间,细胞与各种细胞因子
间通过刺激和抑制,构成相互制约的调节网络来完
成对抗原的识别和反应。这种调节作用对维护机体
免疫机能的稳定和动态平衡十分重要。免疫抑制剂
是免疫调节剂的一种, 具有抑制与免疫有关细胞的
增殖和降低机体免疫反应功能的一类药物。
免疫抑制剂环孢菌素 A( CyclosporineA, CsA)
是一种从丝状真菌( Toly pocladium inf latum )培养
液中分离出的由 11 个氨基酸组成的环肽。该药发
现于 1969年, 1978 年首次应用于临床[ 1 ] 。1983年
美国 FDA 批准用于临床肾移植[ 2] 。瑞士诺华公司
于 1984年成功上市了环孢菌素 A 产品山地明, 并
于 1995年对山地明进行剂型改造,形成了现在临床
中广泛应用的新山地明。1991年,福建微生物研究
所与杭州中美华东制药有限公司合作取得了 CsA
生产许可,第一个国产环孢菌素 A 制剂正式上市,
并在 10多年来,创造了巨大的经济和社会效益。
本文对环孢菌素 A 的作用机理、生物合成、发
酵生产及应用做一简要论述。
1 环孢菌素 A的性质
1. 1 环孢菌素 A 的化学结构理化性质
环孢菌素代表着一族具有生理活性的物质,它
们是一组有 11个氨基酸残基组成的环肽,除环孢菌
素 A 外还有 B-G。
其分子量为 1 202[ 3]。由 NMR及 MS 测定结
果推断其分子式为 C62H111N 11O 12。
1. 2 环孢菌素 A 的免疫抑制活性及其作用机制
作为一种有效的免疫抑制剂, 环孢菌素 A 的主
要特点是抑制作用的选择性, 它主要作用于 T 细
胞,抑制其活化 [ 4] , 而在药理剂量下对 T 细胞的产
生没有抑制作用。环孢菌素A抑制T 细胞活化的
修回日期: 2005-12-23
作者简介:刘阳( 1984- )女,武汉大学生命科学学院生物技术系, E- mail : yangl005@ 126. com. cn
通讯作者:肖庚富,副教授,博士生导师,研究方向:分子医学病毒学, T el : 027-68756272, E- mail : gxiao@ w hu . edu. cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
早期,即作用于细胞周期的 G0-G1 期的界面, 阻止
细胞进入 G1期,抑制 T h产生 IL-2、IL-3、IFN-等
各种淋巴因子和 IL-2R的表达,或环孢菌素 A 抑制
植物凝集素( PHA)、Ca2+ 载体 A23187等引起细胞
内钙离子增加所诱导的淋巴细胞活化, 抑制 IL-2、
IL-2R等的基因活化和 mRNA 的转录, 从而抑制了
细胞毒 T 细胞( T c)的产生。另外,环孢菌素 A 对 B
细胞和巨噬细胞增殖和功能没有直接的抑制作用,
这一点对移植耐受性的形成很有意义[ 5]。
图 1 环孢菌素 A的化学结构
已有的研究表明小分子免疫抑制剂联合使用
时,作用位点相同的药物联合使用对疗效具有拮抗
作用,且毒性增加, 而联合使用作用机制不同的药
物,则能够降低毒性和提高疗效。
2 环孢菌素 A的生产
2. 1 环孢菌素 A 的生物合成
环孢菌素 A 的生物合成过程为 [ 6] : 一方面通过
丙氨酸消旋酶的催化作用,不断的提供 D-丙氨酸作
为底物;另一方面在环孢菌素合成酶的作用下,活化
底物氨基酸,并以硫酯的形式结合于酶上;然后在上
述两种酶的偶联反应里, 从 D-丙氨酸开始, 产生了
D-SKP( D-环 – D-丙氨酸-N-甲基-亮氨酸)。再由
此逐个依序加上环孢菌素的组成氨基酸, 延伸并形
成线状十一肽, 最后在合成酶的作用下迅速环化。
在环孢菌素 A的生物合成过程中, 至少包括如
下反应: 11个氨基酸的腺苷化反应 ; 11个转硫醇反
应; 7个 N-甲基化反应; 10个肽链的延伸反应和最
后的环化反应。所有的这 40步反应的催化反应都
是由环孢菌素合成酶完成。环孢菌素合成酶的一个
重要特性是特异性不强,因此,环孢菌素的生物合成
强烈的受发酵培养基中底物氨基酸种类的影响, 如
DL-氨基丁酸可以提高环孢菌素 A 的产量而抑制其
它环孢菌素组分的形成。但是, 生物合成的方法较
为复杂,现在仅处于实验室研发阶段,并未正式投入
生产。
2. 2 环孢菌素 A 的发酵生产
2. 2. 1 国内环孢菌素 A 生产基本流程 培育米孢
子→进入一级种子罐→进入二级种子罐→进入发酵
罐→放罐→过滤, 弃滤液, 用酒精浸提→收集浸泡
液,过柱浓缩,除杂质→萃取,除杂质,进一步浓缩→
结晶→环孢菌素粗粉→乙酸乙酯溶解, 真空减压蒸
出乙酯→过硅胶柱层析→纯的环孢菌素 A 组(精
粉)
2. 2. 2 对环孢菌素 A生产工艺的改进应主要在
菌种选育方面, 培育环孢菌素 A 高产突变株, 如根
据磷酸盐在环孢菌素合成过程中的重要作用,有人
建议通过紫外等诱变方法培育去磷酸盐调节突变
株,促进菌体本身较快地生长,获得较高浓度的环孢
菌素 A。
发酵方面,根据得到的高产突变株,对原有的斜
面、发酵配方以及装量、PH、灭菌时间、培养温度等
条件进行优化。另外, 发酵过程增加补料工艺, 适当
延长发酵周期或连续发酵可能取得较好的效果 [ 7]。
分离纯化方面,通过研究发酵液性质,发现环孢
菌素 A发酵液的单位有 30% 左右在胞外, 胞内含
70%左右单位。而环孢菌素是一种多肽类化合物,
不溶于水, 能溶于乙酯、甲醇和丙酮。根据这些性
质,选择最佳的萃取剂, 柱层析的载体和洗脱剂, 结
晶溶剂, 可以提高产品的含量和纯度。已有生产企
业采用乙酸乙酯作为萃取剂,萃取单位高,分层效果
好。结晶溶媒以丙酮为最佳,收率及质量均较理想。
也有人 [ 8] 应用高速逆流色谱法( HSCCC)对环孢菌
素的分离纯化进行研究, 选择石油醚- 丙酮- 水( 3
3 2, VV ) 为两相体系, 计算环孢菌素 A、B、C、D
在两相体系中的分配系数, 以上相为固定相, 下相
为流动相进行高速逆流色谱分离纯化, 高效液相色
谱法测定单组分纯度。实验结果表明一次高速逆流
22 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
色谱即可将环孢菌素粗品分离纯化, 得到纯度
9815% 以上的环孢菌素 A、B、C、D单组分, 收率达
85% 以上。
3 环孢菌素 A的应用
环孢菌素 A 的免疫抑制作用使其主要用于器
官移植时的抗排斥反应和移植物抗宿 主病
( GV HD)的治疗。随着对环孢菌素 A 作用机制的
不断认识, 以及临床某些疾病的发病机制的不断明
确, 目前环孢菌素A 已不仅应用于抗排斥反应。近
年来, 该药在治疗免疫系统有关的疾病方面, 特别
是自身免疫性疾病方面也得到了肯定的评价。
3. 1 器官移植
机体的排斥反应是器官移植过程中最常见的也
是决定移植成功与否的重要因素之一。环孢菌素 A
的问世是现代器官移植的一座新的里程碑, 它的临
床应用是 20多年来器官移植的最重大进展。在肝
脏移植中联合应用环孢菌素 A 和强的松,多数接受
移植者能够存活相当长的时间。环孢素菌 A 的出
现也使心肺联合移植以及胰、骨髓等器官移植等得
以实现。该药的研究与应用给临床器官移植带来了
很大转变, 对改变移植医学面貌有很大意义。
3. 2 再生障碍性贫血( AA )
异常免疫介导的造血抑制被认为是 AA 的重
要发病机制。40%~ 70% 的 AA 患者存在免疫
异常, T 细胞异常, T 4 / T 8比例倒置, T 8活性
增高, 造血负调节因子增加。研究证明, 环孢菌素
A 是治疗 AA 的有效药物, 有效率约为 50% [ 9]。
3. 3 肾病综合征
肾病综合征由多种肾小球疾病引起, 其发病均
与免疫有关。近年来已开始应用环孢菌素 A 治疗
激素抵抗或激素依赖性肾病综合征, 并取得了一定
疗效。临床应用环孢菌素 A 后多数患者蛋白尿显
著减少。环孢菌素 A 主要通过提高肾小球基底膜
的孔径选择性和电荷选择性, 以减少蛋白尿的产
生, 并可能通过抑制细胞因子 IL-2 的产生, 影响肾
小球基底膜的通透性, 以减少尿蛋白排除。有报
道[ 10]用环孢菌素 A 治疗难治性肾病综合征, 总有
效率为 92. 3%。
3. 4 类风湿性关节炎( RA )
最近对 RA 的病理研究表明, 引起 RA 关节破
坏的因子为类风湿滑膜产生的细胞因子, 如白介素
( IL 21, IL 26) 和肿瘤坏死因子( TN F) 等, 也称
为前炎症性细胞因子。CsA 有抑制细胞因子合成
的作用, 见效快, 可用于急性、难治性病例[ 11] 。
3. 5 银屑病
银屑病患者存在免疫功能紊化, 患者血液中 T
抑制细胞明显下降, T 辅助细胞明显升高。环孢菌
素 A 能调节 T 细胞亚群比例, 治疗银屑病症显著
改善, 总有效率高, 在其它疗法不能控制病情时可
应用[ 12]。
4 展望
我国器官移植事业近年来正处于快速发展阶
段,器官移植水平已跃居亚洲首位,国内 100多家重
点医院能进行 20多种同种异体器官移植,其中肾移
植处于首位。自 2000年以来,我国肾移植每年在以
5 000余例次递增,到 2003年底,已累计完成肾移植
5万多例次, 肾移植年移植量仅次于美国。促进器
官移植事业蓬勃发展的因素除了医疗技术水平的不
断提高之外,还有两个不容忽视的因素,那就是免疫
抑制剂的更新换代和其在临床上的广泛推广。在器
官移植进程中,免疫抑制剂环孢菌素 A 起到了重要
的作用。
4. 1 市场结构中合资产品占主导
新型免疫抑制剂临床应用不断扩大, 已经成为
市场的主流。2002 年, 我国免疫抑制剂市场为 45
亿元,占了我国免疫调节剂市场的 64%。
环孢菌素 A 是诺华公司开发的产品, 于 1986
年在日本上市, 商品名为新山地明。新山地明于
1997年在我国获得生产批文, 主要剂型有注射剂、
胶囊和口服液。目前我国市场上环孢菌素 A 制剂
产品是主要由以下厂商的产品构成: 诺华的新山地
明口服液、注射液,中美华东的赛斯平、华北制药的
田可软胶囊、口服液,丽珠集团的丽珠环明软胶囊。
诺华和中美华东制药的市场份额较大, 两家占据了
近 90%的市场份额, 诺华公司的环孢菌素 A (商品
名新山地明) 2004年在中国的销售额约为 1. 5 亿
元,预计 2005年将有超过 20%的增长,销售额将达
到 1. 8亿元。目前环孢菌素 A 的市场基本上被合
资厂家所控制,国内企业约占 10%左右。
232006年第 2期 刘阳等:环孢菌素 A的研究进展及应用
4. 2 改进生产工艺,国内企业有望超过合资厂家
国内环孢菌素 A 生产厂家的环孢菌素发酵单
位和有效组分含量普遍较低 ( 发酵单位约在
1 500g / ml左右,有效成分含量在 70%左右) , 而根
据国外有关文献报道, 用 T olypocladium inf latum
发酵生产环孢菌素 A 的发酵单位在 1994年就达到
了 1 500g / m l, 近年来也有生产水平达到和超过
3 000g / ml,有效成分在 85% 以上的例子。所以,
国内外生产水平还有一定的差距。但是, 环孢菌素
A市场潜力巨大,与环孢菌素 A 相关的研究也是药
物研发领域的热点。通过筛选高产菌株和优化生产
工艺,相信环孢菌素 A 生产水平会不断提高, 同时
也创造巨大的经济和社会效益。
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