全 文 ：第 20 卷 第 1 期 集美大学学报 (自然科学版) Vol． 20 No． 1
2015 年 1 月 Journal of Jimei University(Natural Science) Jan． 2015
［收稿日期］ 2014 － 05 － 10 ［修回日期］ 2014 － 05 － 27
［基金项目］国家自然科学基金资助项目 (31171660) ;厦门市科技计划项目 (3502Z20121151) ;厦门南方海洋研
究中心项目 (201405220001;201505026;13GZP003NF09) ;海洋公益性行业科研专项 (201105027 －4)
［作者简介］时超岚 (1989—) ，女，硕士生，从事食品生物学研究． 通讯作者:刘光明 (1972—) ，男，教授，
博士，主要从事食品生物技术研究，E-mail:gmliu@ jmu． edu． cn．
［文章编号］1007 － 7405(2015)01 － 0014 － 09
龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究
时超岚1，2，曾润颖3，4，曹敏杰1，2，刘庆梅1，2，张凌晶1，2，苏文金1，2，刘光明1，2
(1． 集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021;2． 福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室，
福建 厦门 361021;3． 国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门 361005;
4． 国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005)
［摘要］为探究深海细菌 Flammeovirga pacifica降解龙须菜所产生的寡糖抗食物过敏功效，以龙须菜为
原料，通过发酵、超滤、Superdex Peptide HＲ 10 /300 柱层析等方法获得高纯度寡糖． 离子色谱结果显示:
分离纯化获得的寡糖主要为四糖和六糖，其质量分数分别为 48. 47%和 25. 69% ． 小鼠过敏模型实验结果表
明，腹腔注射该寡糖 (100 μg /只)能显著降低过敏小鼠血清特异性 IgE 和 IgG1水平，提高特异性 IgG2a水
平． 通过灌胃 (10 mg /只)能显著降低小鼠粪便中组胺的水平，且能有效缓解空肠组织过敏病理现象． 小
鼠脾淋巴细胞实验结果显示，该寡糖能在转录和转译水平上显著降低 Th2细胞因子 (IL － 4、IL － 5、IL －
13)含量，促进 Th1细胞因子 IFN － γ分泌． 说明该寡糖能有效调节辅助性 T 细胞的免疫功能向 Th1细胞转
换，从而抑制 Th2细胞主导的食物过敏反应．
［关键词］龙须菜;寡糖;纯化;抗食物过敏;原肌球蛋白;小鼠模型;Th2免疫反应
［中图分类号］ Ｒ 392. 8 ［文献标志码］ A
Ｒesearch on the Purification and Anti-food Allergic Activity
of Gracilaria lemaneiformis Oligosaccharide
SHI Chao-lan1，2，ZENG Ｒun-ying3，4，CAO Min-jie1，2，LIU Qing-mei1，2，
ZHANG Ling-jing1，2，SU Wen-jin1，2，LIU Guang-ming1，2
(1． College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2． Key Laboratory of Science
and Technology for Aquaculture and Food Safety，Fujian Province，Xiamen 361021，China;3． Third Institute of
Oceanography，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China;4． Key Laboratory of Marine Biogenetic
Ｒesources，State Oceanic Administration，Xiamen 361005，China)
Abstract:In order to investigate the anti-food allergic effect of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides
which were degraded by the deep sea bacteria Flammeovirga pacifica，the oligosaccharides were obtained from
Gracilaria lemaneiformis through fermentation，ultra-filtration，and purified by Superdex peptide HＲ 10 /300
chromatography column． The oligosaccharides obtained are mainly tetrasccharide and hexaose，their contents
were 48. 47% and 25. 69% respectively as detected by ion chromatography． The results of the allergic mouse
model indicated that intraperitoneal injection of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides (100 μg /mouse)
第 1 期 时超岚，等:龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究
significantly suppressed serum specific IgE，IgG1 level，and promoted specific IgG2a level in mice． Gavage of
Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides (10 mg /mouse)decreased fecal histamine release and repaired the
pathology in the jejunum． The results of the mouse splenic lymphocytes experiment showed that Th2 cytokine
(IL － 4，IL － 5 and IL － 13)contents were reduced，while the Th1 cytokine (IFN － γ)content was up-regu-
lated by Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides in the transcription and translation levels． These results
suggested that Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides could cause the immune function of helper T cells to
convert to the Th1，so as to inhibit the food allergies dominated by Th2 cells．
Key words:Gracilaria lemaneiformis;oligosaccharide;purification;anti-food allergy; tropomyosin;
mouse model;Th2 immune response
0 引言
食物过敏是由免疫机制介导的食物不良反应，常伴随一系列速发症状［1］，包括胃肠道、皮肤、
呼吸道甚至全身过敏反应，有时会致命［2］． 流行病学调查显示，全世界约有 1%～ 2%的成年人和
5%～7%的儿童对食物产生过敏反应，主要的过敏食物分为牛奶、花生和甲壳类动物等八大类［3］． 在
中国，对水产品过敏的人数占到总人数的 49%［4］． 食物过敏大多为 IgE介导的 I型超敏反应，当过敏
原进入机体后，会激活 Th2细胞，使其分泌 IL － 4、IL － 5 和 IL － 13 等细胞因子，这些因子诱导 B 细
胞产生 IgE抗体，接着 IgE会与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的受体 FcεＲI 结合，使细胞脱颗粒，释
放贮存的炎症介质如组胺、白细胞介素等物质，从而使机体产生过敏反应［3，5］． 龙须菜(Gracilariopsis
lemaneiformis)是我国重要的经济海藻，在我国已成为继海带和紫菜之后的第三大栽培海藻［6］． 近年
来，在山东、浙江、福建、广东和海南等省的沿海进行大规模栽培［7］． 目前龙须菜主要作为提炼琼
胶的原料，仍处于低值化的初级利用阶段，所以需要探索能更加充分开发和利用龙须菜资源的途径．
龙须菜富含多种生物活性物质，如活性多糖和藻胆蛋白等，其多糖含量高达 30%左右［8］． 研究证实，
龙须菜多糖具有抗突变、抗氧化、抗肿瘤等生物活性［8 － 9］． 但许多天然多糖是高分子化合物，无法通
过机体屏障到达细胞而影响其生物学功能． 对多糖进行降解，得到适宜分子质量的多糖片断或寡糖，
可以提高多糖的生物活性［10］． 龙须菜寡糖是一类海藻寡糖，已有研究表明，海藻寡糖具有抗过敏、
抗肿瘤和调节免疫的作用［11 － 12］． 但有关龙须菜寡糖抗过敏活性的研究尚未见报道． 本文利用从西太
平洋深海沉积物中筛选到的一株可直接降解龙须菜生产寡糖的菌株 Flammeovirga pacifica，将菌株与
龙须菜共培养制备寡糖［13］，并采用超滤、柱层析等方法从龙须菜降解产物中纯化获得高纯度龙须菜
寡糖． 同时，利用甲壳类水产品主要过敏原原肌球蛋白 (Tropomyosin，TM)建立小鼠过敏模型，通
过动物实验和细胞实验评价龙须菜寡糖的抗食物过敏功效．
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
龙须菜粉末和菌株 Flammeovirga pacifica均取自于国家海洋局第三海洋研究所;拟穴青蟹 (Scylla
paramamosain)原肌球蛋白由本实验室制备;SPF级雌性 BALB /c 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限
公司;凝胶法鲎试剂内毒素检测试剂盒购自美国科德角公司;蛋白质测定试剂盒购自美国 Bio － Ｒad
公司;明矾佐剂购自美国 Thermo公司;HＲP 标记的羊抗鼠 IgE 抗体购自美国 Southern Biotech 公司;
HＲP标记的羊抗鼠 IgG1、IgG2a抗体购自英国 Abcam公司;小鼠淋巴细胞分离液购自深圳达科为生物
·51·
集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
技术有限公司;Trizol试剂购自瑞士 Ｒoche公司;细胞因子检测试剂盒购自美国 Peprotech 公司;荧光
定量 PCＲ试剂盒购自天根生化科技有限公司;苏木伊红染色试剂盒购自碧云天公司;其他试剂均为
国产化学纯或分析纯．
1. 2 龙须菜寡糖的纯化
菌株与龙须菜共培养制备寡糖的方法参照文献 ［13］． 向锥形瓶中加入 2. 5 g 龙须菜粉末、0. 5 g
NaCl和 50 mL蒸馏水，摇匀，高温高压灭菌后冷却至室温，接种 2. 5 mL 菌株 Flammeovirga pacifica，
置于恒温摇床 48 h (37 ℃，200 r /min)． 48 h后离心 (7500 r /min，15 min，25 ℃) ，将上清液通过
3 ku超滤装置过滤，除去多糖、蛋白质等大分子物质，将滤液冷冻干燥，获得龙须菜寡糖粗样粉末．
将粉末复溶于超纯水使其质量浓度为 20 mg /mL，上样于 Superdex Peptide HＲ 10 /300 (10 mm ×
300 mm)凝胶层析柱和制备型液相色谱蛋白分析仪，超纯水洗脱，流速为 0. 3 mg /mL，采用蒽酮硫
酸法检测洗脱液含糖量，收集含糖洗脱峰． 采用薄层层析法检测洗脱峰是否含有寡糖，即取一块硅胶
板，在离板边缘 1. 5 cm处分别用移液枪点上 0. 5 μL新琼二、四、六、八糖混合标准品和龙须菜寡糖
样品，晾干后重复点样 3 次． 将展层剂(V(正丁醇)∶ V(冰乙酸)∶ V(蒸馏水)= 1∶ 2∶ 1)倒入层析缸中，
将硅胶板放于层析缸中进行展层，待展层剂延伸至离板上端 1 cm 时取出硅胶板结束展层． 待硅胶板
完全风干后均匀地喷上显色剂(V(浓硫酸)∶ V(无水乙醇)= 1∶ 9) ，置于 90 ℃烘箱中显色 10 min，显
色完毕用凝胶成像仪拍照，收集含有寡糖的洗脱峰． 将含有寡糖的洗脱液上样于 Detoxi － Gel 内毒素
去除柱 (10 mm ×70 mm) ，以除去样品中的内毒素． 根据内毒素去除柱说明书所示，弃去上样后首
先流出的 90%柱体积的流洗液 (其中不含样品) ，然后开始收集直至 5 倍柱体积的流洗液 (含样品) ，
并将其冷冻干燥，从而得到高纯度龙须菜寡糖．
1. 3 龙须菜寡糖的成分分析
通过蒽酮硫酸法测定龙须菜寡糖中总糖的含量［14］;通过 DNS 法测定龙须菜寡糖中还原糖的含
量［15］;通过 Lowry法测定龙须菜寡糖中蛋白质的含量［16］;通过凝胶法鲎试剂盒检测龙须菜寡糖中内
毒素的含量．
用超纯水将纯化的龙须菜寡糖粉末配制成 100 μg /mL 的溶液． 将新琼四糖、六糖标准品分别用
超纯水配制成 10 、20 、50 、100、200 μg /mL的溶液． 将标准品和样品上样于离子色谱仪测定寡糖
的组成． 离子色谱分析参数:色谱柱为 Dionex CarboPac PA － 100 阴离子交换柱 (4 mm × 250 mm ) ;
淋洗液为 0. 1 mol NaOH 和 0. 15 mmol /L NaAc;流速为 0. 25 mL /min;进样体积为 25 μL;柱温为
25 ℃;检测器为脉冲安培检测器，金电极．
1. 4 小鼠体内食物过敏模型的建立
小鼠的免疫方案参照 Costa等的方法［17］． 以 6 ～ 8 周龄 SPF 级雌性 BALB /c 小鼠为研究对象，采
用拟穴青蟹原肌球蛋白 TM为过敏原敏化小鼠，建立小鼠食物过敏模型． 将小鼠分为 PBS 组、TM 组
和龙须菜寡糖组，每组 6 只小鼠． 在 0、14 d向 TM组和龙须菜寡糖组小鼠注射 TM 和明矾佐剂混合
液 (TM 100 μg /只) ，PBS 组小鼠注射 PBS (8. 00 g NaCl，0. 20 g KCl，2. 9 g Na2 HPO4·12H2 O，
0. 20 g KH2PO4，超纯水定容至 1 L，pH =7. 4)和明矾佐剂混合液作为阴性对照． 龙须菜寡糖组从致
敏前一周开始每周注射 3 次龙须菜寡糖 (100 μg /只) ，小鼠在 15 d 进行尾静脉采血，血液离心
(7000 r /min，10 min，4 ℃) ，收集上层血清． 从 28 d 开始，对 PBS 组、TM 组和龙须菜寡糖组 3 组
小鼠进行灌胃实验，TM 组和龙须菜寡糖组小鼠每隔 2 ～ 3 d 灌胃 TM (10 mg /只) ，共灌胃 10 次，
PBS组小鼠灌胃 200 μL PBS 作为阴性对照，灌胃 TM 前 1 h 向龙须菜寡糖组小鼠灌胃龙须菜寡糖
(5 mg /只)． 在 49 d灌胃结束后 1 h收集粪便． 在 50 d将小鼠处死获得空肠组织用于组织切片的制作．
1. 5 小鼠血清 TM特异性 IgE、IgG1和 IgG2a水平的检测
小鼠血清中 TM特异性免疫球蛋白的含量通过间接性 ELISA测定，参照 Li等的方法［18］． 将纯化
的 TM用包被液 (50 mmol /L Na2 CO3，130 mmol /L NaHCO3，3 mmol /L NaN3，pH = 9. 6)稀释为
·61·
第 1 期 时超岚，等:龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究
100 μg /mL，加入 96 孔酶标板中，100 μL /孔，于 4 ℃包被 16 h． 用 TBST (20 mmol /L Tris － HCl
buffer，pH =7. 5，包含 145 mmol /L NaCl)清洗 5 次，加入质量分数为 5%的脱脂奶 300 μL /孔，于
37 ℃封闭 2 h． TBST清洗后加入血清样品 (用质量分数为 1%的脱脂奶 1 ∶ 5 稀释)100 μL /孔，于
4 ℃孵育 16 h． TBST清洗后加入二抗 (IgE 按 1∶ 1000 稀释，IgG1按 1∶ 5000 稀释，IgG2a按 1∶ 1000 稀
释，用质量分数为 1%的脱脂奶稀释) ，100 μL /孔，于 37 ℃孵育 2 h． TBST 清洗后加入 TMB 显色，
100 μL /孔，于 37 ℃显色 20 min． 取出板加入 50 μL 2 mol /L H2SO4终止显色反应，用酶标仪于波长
450 nm处检测吸光度值． 小鼠血清中 TM 特异性 IgE 水平同时通过蛋白质印迹 (Western － blotting)
的方法进行测定，参照 Towbin等的方法进行［19］．
1. 6 小鼠粪便中组胺含量的测定
小鼠粪便中组胺的提取参考 Hwang等的方法［20］． 将 0. 8 g 粪便与 2 mL质量分数为 5%的三氯乙
酸混合，用组织捣碎机捣碎，离心 (9500 r /min，20 min，25 ℃) ，过滤获得上清液． 调节上清液 pH
值至 9. 5，将300 μL上清与 600 μL 丹磺酰氯溶液混合均匀，40 ℃水浴 20 min． 向混合液中加入
100 μL氨水以除去多余的丹磺酰氯，混匀，避光静置 30 min，用乙腈定容至 1. 5 mL，上样于高效液
相色谱仪 (HPLC)．
HPLC分析参数如下:色谱柱为 Agilent ZOＲBAX Extend － C18 色谱柱 (50 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;
流动相为 V(乙腈)∶ V(水)= 70∶ 30;流速为 1 mL /min;柱温为 35 ℃;进样量为 20 μL;紫外检测波长
为 254 nm．
1. 7 小鼠空肠组织的病理分析
小鼠空肠组织切片参照 Yehia等［21］的方法． 在 50 d 将小鼠处死，取出空肠组织，使用中性甲醛
溶液固定 1 h． 将固定好的空肠组织按横轴切断，长度为 5 mm 左右，石蜡包埋组织，使用切片机进
行石蜡切片． 使用乙醇梯度溶液使组织复水，用苏木精和伊红溶液分别进行染色，再将组织经过乙醇
梯度脱水和二甲苯透明后，置于光学显微镜下进行镜检．
1. 8 小鼠脾脏淋巴细胞过敏模型的建立
使用 6 ～ 8 周龄 SPF级雌性 BALB /c小鼠建立细胞过敏模型． 在 0、14 d向小鼠注射 TM和明矾佐
剂混合液 (TM 100 μg /只) ，在 17 d处死小鼠，分离纯化出脾脏淋巴细胞． 实验分为 PBS 组、TM 组
和龙须菜寡糖组． 在 24 孔细胞培养板中分别加入 940 μL 含脾脏淋巴细胞的培养液． PBS 组再加入
60 μL PBS溶液;TM组再加入 10 μL 1 mg /mL TM溶液，50 μL PBS溶液;龙须菜寡糖组再加入10 μL
的1 mg /mL TM 溶液，50 μL 的 2 mg /mL 龙须菜寡糖溶液． 置于细胞培养箱 (37 ℃，体积分数 5%
CO2)培养72 h，离心 (7000 r /min，10 min，4 ℃) ，上清液用于细胞因子蛋白转译水平的检测，细
胞沉淀用于 ＲNA提取及细胞因子基因转录水平的检测．
脾脏淋巴细胞上清细胞因子的检测按照 IL － 4、IL － 13 和 IFN － γ 试剂盒说明书操作． 细胞沉淀
通过 Trizol试剂提取出 ＲNA，将 ＲNA反转录成 cDNA，以 cDNA为模板，管家基因 HPＲT作为 IL － 4、
IL － 13 和 IFN － γ的内参，β － actin作为 IL － 5 的内参，利用荧光定量 PCＲ检测 Th1细胞因子 (IFN －
γ)和 Th2细胞因子 (IL － 4、IL － 5、IL － 13)的基因表达量． 所用引物的序列参考 Capobianco 等的
方法［22］．
1. 9 数理统计
实验中所有数据均采用 SPSS 16. 0 软件分析，用 ANOVA进行方差分析，显著性检验方法为 Dun-
can多重检验法，检验限为 0. 05，实验数据平行测定 3 次．
2 结果
2. 1 龙须菜寡糖的纯化
龙须菜通过发酵，超滤后上样于 Superdex Peptide HＲ 10 /300 层析柱，通过蒽酮硫酸法检测洗脱
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集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
液，洗脱曲线如图 1 所示，将获得的两个洗脱峰分别收集进行薄层层析，薄层层析结果显示，第一个
洗脱峰含有四糖和六糖，将第二个洗脱峰的收集液进行薄层层析，在层析板上无任何显色反应，说明
不含寡糖，所以将第一个峰的洗脱液进行冷冻干燥，从而得到纯化的龙须菜寡糖粉末．
2. 2 龙须菜寡糖的成分分析
纯化的龙须菜寡糖中总糖的含量占龙须菜寡糖粉末干重的 78. 58%，还原糖含量占干重的
17. 80%，通过蛋白质测定试剂盒检测蛋白质的含量占干重的 0. 2%，通过凝胶法鲎试剂内毒素检测
试剂盒检测内毒素的含量 ＜ 0. 03 EU /mg．
如图 2 所示，通过离子色谱法将纯化的龙须菜寡糖与新琼四、六糖混和标准品比对，可以看出龙
须菜寡糖中主要含有四糖和六糖，通过新琼寡糖浓度 －出峰面积的标准曲线得出纯化的龙须菜寡糖中
含有四糖 48. 47%，六糖 25. 69% ．
图 1 龙须菜寡糖的 Superdex Peptide HR 10/300 柱
层析纯化和薄层层析分析
Fig.1 Superdex Peptide HR 10/300 chromatographic
purification and thin鄄layer chromatography analysis of
Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides
图 2 龙须菜寡糖的离子色谱图
Fig.2 Ion chromatography diagram of
Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides
二糖 Disaccharide
四糖 Tetrasccharide
六糖 Hexaose
八糖 Octasaccharide
Marker 龙须菜寡糖 Marker 洗脱液
8
6
4
2
0
5 10 20 3015 25
Fraction No.(2 mL/tube）
龙须菜寡糖
新琼四、六糖混合标准品
四糖
Tetrasccharide 六糖Hexaose
0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
1100
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
二糖 Disaccharide
四糖 Tetrasccharide
六糖 Hexaose
八糖 Octasaccharide
Gracilaria lemaneiformis
oligosaccharide
Eluant
Gracilaria lemaneiformis
oligosaccharide
The mixed sugar standard of tetrasccharide and hexaose
t/min
A 6
30
峰
值
Pe
ak
va
lu
e/n
C
说明（Notes）：*—p<0.05; **—p<0.01;1—PBS；2—TM；
3—Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides.
图 3 龙须菜寡糖对小鼠血清特异性 IgE、IgG1 和 IgG2a 的影响
Fig.3 Effect of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharide
on the TM-specific IgE、IgG1 and IgG2a
IgE IgG1 IgG2a
0.6
0.4
0.2
0
A 4
50
TM
龙须菜寡糖
Gracilaria lemaneiformis
oligosaccharide
**
**
*
- + + - + + - + +
- - + - - + - - +
1 2 3 1 2 3 1 2 3
2. 3 龙须菜寡糖对小鼠血清 IgE、
IgG1和 IgG2a的影响
第二次注射 TM 24 h 后采血，通
过 ELISA检验血清中 TM 特异性 IgE、
IgG1和 IgG2a的水平，结果如图 3 所
示． 由图 3 可见，从第一次注射 TM
前开始注射龙须菜寡糖的小鼠血清中
IgE水平较 TM组有显著的下降，而血
清中 IgG1水平与 TM组相比显著下降，
IgG2a水平显著上升． Western － blotting
对 IgE的检测结果与 ELISA结果相同．
2. 4 小鼠粪便中组胺的水平
通过 HPLC检测粪便中组胺含量，
组胺的保留时间为 5. 6 min (见图
4a)． 于 49 d 最后一次灌胃小鼠，1 h
后收集小鼠粪便，通过 HPLC检测粪便中组胺的含量，如图 4b 所示，PBS 组小鼠粪便中组胺含量为
90. 68 μg /mg，TM组组胺含量上升至 187. 48 μg /mg，而灌胃了龙须菜寡糖的小鼠粪便中组胺含量降
低为 133. 52 μg /mg．
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第 1 期 时超岚，等:龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究
a 组胺的 HPLC 图谱
The HPLC diagram of histamine b 小鼠粪便中组胺的含量
The histamine level in mouse fecal samples
说明(Notes)：*—p<0.05; **—p<0.01.
图 4 龙须菜寡糖对小鼠粪便中组胺的影响
Fig.4 Effect of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides on the mouse fecal histamine level
峰
值
Pe
ak
va
lu
e/
m
AU 70
60
50
40
30
20
10
0
Histamine
标准品
Standard
TM
龙须菜寡糖
Gracilaria lemaneiformis
2 4 6 8
t/min
c（
H
ist
am
in
e)
/
(μ
g·
m
L-
1 )
200
100
150
50
0
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
*
2. 5 小鼠空肠组织切片
在 50 d将小鼠处死，取出空肠组织进行组织切片，再通过苏木精 －伊红染色观察组织病理． 从
图 5 可以看出，PBS组小鼠的空肠组织正常，没有病理现象;TM 组的空肠组织可以看到明显的水肿
(实线箭头)以及淋巴细胞浸润 (虚线箭头)的病理现象;而龙须菜寡糖组的小鼠空肠组织没有明显
的病理现象．
图 5 龙须菜寡糖对空肠组织的影响
Fig.5 Effect of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides on the jejunum tissue
a PBS b TM c 龙须菜寡糖
Gracilaria lemaneiformis
oligosaccharides
2. 6 龙须菜寡糖对 IL － 4、IL － 13、IFN － γ转译水平的调节作用
小鼠在第二次注射 TM 72 h后处死，获得脾脏淋巴细胞，分别加入 PBS、TM、TM +龙须菜寡糖
刺激培养 72 h，使用 IL － 4、IL － 13、IFN － γ细胞因子检测试剂盒测定细胞上清中细胞因子的含量，
结果如图 6 所示． 由图 6 可见，PBS组 IL － 4 质量浓度为 100. 83 pg /mL，经过 TM 刺激后 IL － 4 质量
浓度上升为 133. 36 pg /mL，而加入龙须菜寡糖组的细胞 IL － 4 恢复到了正常水平 (70. 57 pg /mL)．
PBS组 IL － 13 质量浓度为 361. 82 pg /mL，经过 TM刺激后 IL － 13 质量浓度上升为 980. 74 pg /mL，向
TM刺激后的细胞中加入龙须菜寡糖其 IL － 13 含量显著下降 (813. 72 pg /mL)． PBS组细胞 IFN － γ的
质量浓度为281. 33 pg /mL，TM 组细胞 IFN － γ 质量浓度为 327. 903 pg /mL，加入龙须菜寡糖的细胞
IFN － γ质量浓度显著上升为 857. 36 pg /mL．
2. 7 龙须菜寡糖对 IL － 4、IL － 13、IL － 5 和 IFN － γ转录水平的调节作用
第二次注射 TM 72 h后处死小鼠，获得脾脏淋巴细胞，分别加入 PBS、TM、TM +龙须菜寡糖刺
激培养 72 h，离心获得细胞沉淀，提取细胞 ＲNA 并反转录成 cDNA，从而检测 IL － 4、IL － 5、IL －
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集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
13、IFN － γ的表达量，结果如图 7 所示． 由图 7 可见，与 TM 组相比，龙须菜寡糖能够显著抑制
IL － 4、IL － 5、IL － 13 的 mＲNA表达水平，且显著促进 IFN － γ的 mＲNA表达水平．
说明（Notes）：*—p<0.05; **—p<0.01.
图 6 龙须菜寡糖对 IL-4、IL-13 和 IFN-γ 转译水平的调节作用
Fig.6 The regulation of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides on IL-4, IL-13 and IFN-γ in the translation level
PBS TM龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
160
120
80
40
0c（
IL
-4
） /
(p
g·
m
L-
1 )
c（
IL
-1
3）
/(p
g·
m
L-
1 )
**
1200
900
600
300
0
*
c（
IF
N-
酌）
/(p
g·
m
L-
1 ) 1000
750
500
250
0
说明（Notes）：*—p<0.05; **—p<0.01.
图 7 龙须菜寡糖对 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-γ 转录水平的调节作用
Fig.7 The regulation of Gracilaria lemaneiformis oligosaccharides on
IL-4, IL-5, IL-13 and IFN-γ in the transcription level
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
PBS TM 龙须菜寡糖
Gracilaria
lemaneiformis
oligosaccharides
2.5
1.5
0.5
2.0
1.0
0
IL
-4
相
对
表
达
量
Ra
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
of
IL
-4
IL
-5
相
对
表
达
量
Ra
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
of
IL
-5 8
6
4
2
0
**
*
IL
-1
3
相
对
表
达
量
Ra
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
of
IL
-1
3
4
3
2
1
0
IF
N-
酌
相
对
表
达
量
Ra
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
of
IF
N-
酌
4
3
2
1
0
*
*
a IL-4 b IL-5
c IL-13 d IFN-酌
3 讨论
目前对于海藻寡糖的提取，通常都要先对海藻多糖进行提取，再通过强酸或酶将多糖降解为寡
糖［23］． 该操作过程步骤较多且成本高，大大限制了海藻寡糖的应用发展，而过程中又需要用到强酸
和有机溶剂，对环境也造成了污染． 本文采用菌株 Flammeovirga pacifica 与龙须菜共培养制备龙须菜
寡糖的方法，过程简便，有利于大规模生产，且不会对环境造成危害． 龙须菜与菌株共培养后发酵液
还原糖质量浓度为 2 ～ 3 mg /mL，与万纬等的研究结果相符［13］． 将发酵液冷冻干燥，通过蒽酮硫酸法
测定其总糖质量分数为 50%左右，纯度还不够理想． 所以，为了得到较高纯度的龙须菜寡糖，本研
究还通过发酵、超滤、Superdex Peptide HＲ 10 /300 柱层析等方法进一步纯化发酵液中的龙须菜寡糖，
使龙须菜寡糖得到了较好的纯化，纯化后的龙须菜寡糖其总糖质量分数为 78. 85%，还原糖质量分数
为 17. 80%，蛋白质质量分数为 0. 2% ． 通过离子色谱测定纯化的龙须菜寡糖主要为四糖和六糖，质
量分数分别为 48. 47%和 25. 69% ．
·02·
第 1 期 时超岚，等:龙须菜寡糖分离纯化和抗食物过敏功效的研究
通过对小鼠腹腔注射 TM建立 Th2型动物过敏模型，从而探究龙须菜寡糖对血清中 TM 特异性抗
体 IgE、IgG1和 IgG2a的调节作用． 其中，IgE是评价机体过敏状况的决定性指标． 机体过敏时，IgE会
与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的受体结合，导致炎症介质和 IL － 4、IL － 5、IL － 13 等细胞因子的
释放［24］． 而 Th1型特异性指标 IgG2a与 Th2型特异性指标 IgG1的测定，也能够很好地表示 Th1 /Th2的极
化情况，从而指示机体的过敏情况［25］． 本实验从小鼠致敏前 7 d 开始注射龙须菜寡糖，于第二次免
疫后检测小鼠血清中 TM特异性抗体水平，结果显示，龙须菜寡糖能够显著抑制血清中 IgE 和 IgG1的
水平，显著促进小鼠血清中 IgG2a的水平，说明龙须菜寡糖是一种抗食物过敏预防剂．
最后一次灌胃小鼠后 1 h，收集小鼠粪便，经过处理后上样于 HPLC，从而检测粪便中组胺的含
量． 结果显示，与 TM组相比，龙须菜寡糖组的小鼠粪便中组胺含量显著降低． Schiavi等人的研究中
通过灌胃虾的 TM建立小鼠食物过敏模型，在最后一次灌胃 TM 后收集粪便检测组胺含量，结果显
示，所研究的益生菌混合物能够很好地抑制粪便中组胺的含量，且抑制率与本研究的结果相同［26］．
食物过敏经常会引起胃肠道的炎症病理现象，而空肠是容易产生过敏病理反应的肠道部位之一．
本实验中，经过连续 10 次的灌胃后，处死小鼠，取出空肠组织进行组织切片观察． 结果显示，PBS
组小鼠的空肠组织正常，没有病理现象;TM组的空肠组织可以看到明显的水肿以及淋巴细胞浸润的
病理现象;而灌胃龙须菜寡糖组的小鼠空肠组织没有明显的病理现象． Birmingham等人建立小鼠的坚
果过敏模型，发现坚果致敏的小鼠空肠会出现水肿、淋巴结充血等症状［27］． Chen 等人建立了大米过
敏的小鼠模型，发现过敏小鼠的空肠组织会出现淋巴细胞浸润、绒毛萎缩、杯状细胞增生等炎症现
象［28］． 组织切片结果说明龙须菜寡糖能有效缓解空肠组织的过敏病理现象．
当机体过敏时，Th2细胞会产生 IL － 4 和 IL － 13，从而诱导 B 细胞产生 IgE 等抗体，所以 IL － 4
和 IL － 13 的含量是评价食物过敏的重要指标［5］． 而 Th1型细胞的特征是大量分泌细胞因子 IFN － γ，
IFN － γ能够缓解炎症反应和抵抗病原体的入侵［29］． 本研究通过建立体外的细胞模型进一步研究龙须
菜寡糖对食物过敏相关细胞因子的调节作用，并通过转录水平和转译水平两个方向同时验证． 通过荧
光定量 PCＲ测定小鼠脾脏淋巴细胞 ＲNA的相对表达量，龙须菜寡糖能在转录水平上显著促进 Th1细
胞因子 IFN － γ的含量，且能显著抑制 Th2细胞因子 IL － 4、IL － 5 和 IL － 13 的含量． 通过 ELISA对小
鼠脾脏淋巴细胞上清液中 IL － 4、IL － 13 和 IFN － γ 含量在转译水平的检测，也能得到相似的结果．
本实验室王有朝等［30］已通过建立小鼠食物过敏模型研究了坛紫菜中 Ｒ －藻蓝蛋白的抗食物过敏活性．
而本研究利用建立的食物过敏动物模型，测定了更多的过敏相关指标，如 IgG1、IgG2a、组胺、空肠
切片以及相关的细胞因子，更加全面证实了龙须菜寡糖是作为一种食物过敏预防剂而起到了抗过敏的
作用．
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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)
·22·