全 文 ：工程菌酯酶 B1的纯化及性质研究
薛庆节 闫艳春* 姜红霞 刘萍萍 解秀萍 张洁
(山东农业大学生命科学学院 ,泰安 271018)
摘 要: 工程菌酯酶 B1 降解酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换柱层析、Sephadex G-150凝
胶过滤, 得到了分离纯化, SDS-PAGE 鉴定为单一组分。经 12. 5% SDS-PAGE 法测得分子量约为 56KD, 提纯倍数为
33. 3, 收率为 17. 9% ,比活力为 74. 7U/ mg。该酶的最佳作用条件是 37 e , pH= 7. 0,该酶作用于A-乙酸萘酯的 Km 为
1. 35@ 10- 3 mM, Vmax 为 2. 7@ 104L/ ml。酶在 pH6~ 9 范围内较稳定, 重金属 Cu2+ 对该酶具有明显的促进作用, 而
SDS 对酶具有抑制作用,对有机磷农药对硫磷( 1605)的降解率在 90min 内达 91. 5%。
关键词: 工程菌 酯酶 B1 纯化及性质
Purification and Properties of Esterase B1 from Engineered Bacteria
Xue Qingjie Yan Yanchun Jiang Hongxia Liu Pingping Xie Xiuping Zhang Jie
( College of Lif e Science, Shandong Agricuture University, Taian 271018)
Abstract: Esterase B1 was purified from engineered bacteria by ( NH4 ) 2SO4 precipitation, DEAE-Sepharose CL-6B,
Sephadex G-150 gel filtration with 33. 3 fold purification, 17. 9% recovery and 74. 7U/ mg specific activity. The purified enzyme
was homogenous on polyacrylamide gel electrophoresis.The molecular weight of the enzyme estimated with SDS-PAGE was 56KD,
The optimal condition for activity were pH7. 0, temperature 37 e ,Mcihaelis constant of the enzymewas 1. 35@ 10- 3 mM and Vmax
= 2. 7@ 104 L/ ml with A-NA as the substrate. The enzyme was stable over the range of pH6~ 9 , the activity was inhibited by SDS
and stimulated by Cu2+ . Degradation of 1605 by esterase B1 is 91. 5% in 90 minutes.
Key words: Engineered bacteria Esterase B1 Purification and Properties
目前,我国广泛使用的杀虫剂,长期大规模的生产和施用对环境造成了严重影响[ 1]。常规化学解毒方法
是利用强碱水解,但效率低下, 水解产物也会再次污染环境,因此迫切需要一种能在较温和条件下进行彻底
降解的方法。昆虫解毒酶是在农药的长期选择压力下,昆虫体内产生的一类可代谢农药的酶,该酶在消除农
药的环境污染方面有良好的应用前景, 为农药污染的生物治理提供了新思路和新方法。酯酶B1是与蚊虫抗
药性有关的 10种解毒酶中活性最高的一种[ 2, 3] ,可用于降解农药残留。闫艳春等[ 4]将抗性尖音库蚊五代亚
种( Culex pipiens quing-uefasciatus )的酯酶 B1基因克隆到质粒 pRL-439,然后转入大肠杆菌,构建成工程菌。研
究表明,该工程菌对有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等四大类农药都具有很强的降解能力[ 5]。本文
报道了工程菌表达产物酯酶 B1的纯化及其特性,并测定了其降解对硫磷的效果,为该酶的开发应用奠定了
理论基础。
1 材料与方法
1. 1 菌种、试剂、培养基
1. 1. 1 菌种 工程菌由山东农业大学生物农药研究室构建。
1. 1. 2 主要试剂 a) 99%对硫磷标准品, 购于成都化学试剂厂。b) DBLS溶液: 1%固蓝 B溶液加入5%
收稿日期: 2004-11-02
基金项目:山东省自然科学基金资助项目(Y98D16064)
* 通讯作用: E-mail: yanyc@ sdau. edu. cn
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
的 SDS溶液( 1%固蓝 B/ 5%SDS= 2/ 5)混合均匀, 该溶液易于氧化,应现配现用。c) Buffer A: 0. 05M NaH2PO4-
Na2HPO4缓冲液( pH7. 0) , 含 10g/ L Triton X-100, 5mmol/ L B-巯基乙醇, 1mmol/ L EDTA , 0. 5mmol/ L PMSF。d)
Buffer B: 同 Buffer A,但不含 Triton X-100。e) Buffer C: 0. 05M Tris-HCl缓冲液( pH8. 0) ,含 5mmol/L B-巯基乙
醇, 1mmol/ L EDTA , 0. 5mmol/L PMSF。
1. 1. 3 培养基 LB液体培养基( pH7. 0,含 100Lg/ml Amp+ ) , 按文献[ 6]配制。
1. 2 培养条件
以5%的接种量将活化好的工程菌转接到含有抗生素的 LB液体培养基中, 37 e 震荡培养 13h。
1. 3 酶的活力和蛋白质含量的测定
1. 3. 1 酶的活力测定 向试管中加入 1ml的 Buffer B、60Ll A-乙酸萘酯乙醇溶液( 0. 01g/ ml)、1ml酶液, 37 e
振荡反应 20min, 加入 0. 5ml DBLS 室温静置 15min, 测定 A 600,根据标准曲线计算酶的活力。每项试验重复 4
次,同时设不加酶处理作为对照。酶活力定义: 37 e , 20min水解 A-乙酸萘酯产生 1. 0LmolA-萘酚所需的酶量
为1个酶活单位数。
1. 3. 2 标准曲线绘制 向各试管中分别加入 1ml Buffer B和 250Ll不同浓度的A-萘酚标准乙醇溶液, 37 e 振
荡反应20min,加入 0. 5ml DBLS,室温静置 15min, 测定 A 600。
1. 3. 3 蛋白质含量的测定 按 Bradford方法( Bradford , 1970)。以 BSA作为标准, 考马斯亮蓝 G-250为显色
剂,用 752紫外光栅分光光度计测定溶液在 595nm的光吸收值。
1. 4 酶的分离纯化
酶的分离纯化均在 4 e 下进行。
1. 4. 1 细胞壁的破碎和酯酶B1的抽提 含工程菌的培养液离心( 5 000r/ min) 20min收集菌体,用 Buffer A洗
涤2~ 3次,将菌体悬浮于同一缓冲液中, 比例为 1g 湿菌体对 2. 5ml缓冲液, 置于冰浴用 JY92II超声波细胞
粉碎机探头处理 7. 5min, 离心( 10 000r/ min)除去细胞碎片,即得无细胞粗酶液。
1. 4. 2 硫酸铵分级盐析 破碎后的无细胞粗酶液边搅拌边加入碾细的硫酸铵分别至 10%、20%、30%、
40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的饱和度,将沉淀溶解于 Buffer B,分别测定各饱和度下沉淀酶活和
蛋白质浓度。
1. 4. 3 DEAE-Sepharose CL-6B 凝胶过滤 将硫酸铵为 40% ~ 80%饱和浓度的盐析收集蛋白质溶于适量的
Buffer C中,置于经 Buffer C平衡好的 DEAE-Sepharose CL-6B凝胶柱( 1. 8cm @ 30cm)上, 首先用Buffer C缓冲液
洗脱,然后用含 0~ 0. 80mol/ L NaCl的 Buffer C缓冲液洗脱, 分管收集,流速为1. 0ml/ min。测定蛋白质浓度及
酶活性,保留活性部分,装入透析袋,用蔗糖包埋浓缩至 3 ml,以备进一步纯化。
图 1 酶活力测定的标准曲线
1. 4. 4 Sephadex G-150分子筛层析 将 3ml浓缩的酯酶添加到经 Buffer C平
衡的 Sephadex G-150柱( 1. 8 @ 90cm)上过滤, 缓冲液流速为0. 5ml/ min,测定蛋
白质浓度及酶活性, 保留活性部分。
1. 4. 5 电泳分析 SDS-PAGE参照Laemmli等[ 7]的方法进行, 凝胶浓度为 12.
5% ,标准蛋白为上海生化所东风生化技术公司生产的低分子量标准蛋白。
2 结果与分析
2. 1 酶活力测定结果
标准曲线的解析式 A 600= 0. 191C+ 0. 1, 测定酶活力时,根据此解析式可
由 A 600计算产物的生成量,然后根据酶活定义换算为酶活力。
2. 2 酯酶 B1的分离纯化
2. 2. 1 硫酸铵分级沉淀 如图 2所示,酯酶主要存在于 40%至 80%的硫酸铵沉淀中, 在以后提纯中直接取
40% ~ 80%的硫酸铵饱和度时沉淀出的蛋白质, 用 Buffer B溶解后再用同一缓冲液透析至无 SO42- 检出,用
40 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
图 2 不同饱和度时硫酸铵盐析沉淀物中
酯酶 B1 的酶活力
于下一步纯化。
2. 2. 2 DEAE-Sepharose CL-6B凝胶过滤 将硫酸铵分级盐析获得的
蛋白质样品透析后经 DEAE-Sephadex CL-6B离子交换层析可以洗脱出
4个峰,其中第一个峰为未挂柱的杂蛋白峰。收集各个峰的洗脱液经
酶活检测和蛋白含量的测定, 结果表明, 酯酶 B1主要存在于峰 4中。
合并降解活性较高的部分用蔗糖包埋浓缩, SDS-PAGE检测表明,此时
酯酶只有部分得到提纯, 需要进一步处理。
2. 2. 3 Sephadex G-150分子筛层析 经 Sephadex G-150分子筛层析
可以洗脱出3个峰,分别收集各峰峰值处的洗脱液并检测其酶活力和
蛋白质的含量, 结果表明峰 1具有很高的酯酶活性,由此可以推断出
图3 DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换层析
酯酶 B1存在于峰 1中。由洗脱峰峰
形可以看出, 目的蛋白含量较高, 且分
离完全, SDS-PAGE进行纯度检测也证
实了这一点。
2. 2. 4 纯化结果
2. 3 酶的性质
2. 3. 1 酶的纯度及分子量 将上述
各步骤提纯的样品进行电泳检测(图
5) , 表明经分子筛层析后, 该酶已达到
电泳纯度, 其大小约为 56KD(根据标
准蛋白回归分析拟合曲线)。
表 1 酯酶 B1的分离纯化
Purif ication
step
Total
act ivity/ L
Total
protein/ mg
Sp. act
/ (L/mg)
Recovery
/ %
Purification
fold
Crude extract 3270 1461 2. 24 100 1
(NH4) 2SO4 precipitat ion 2060 238. 9 8. 6 63 3. 84
DEAE-Sepharose CL-6B 1148 37. 8 30. 4 35. 1 13. 6
Sephadex G-150 582. 9 7. 8 74. 7 17. 9 33. 3
图 4 Sephadex G-150 分子筛层析
2. 3. 2 酶作用最适温度 在不同温度下测定酶活力,
得知该酶的作用最适温度为 37 e (图6)。
2. 3. 3 酶作用最适 pH 在标准反应条件下, 于0. 05
mol/L 的不同缓冲体系中测定该酶活力, 所用缓冲液分
别为Na2HPO4-柠檬酸( pH2. 2~ 8. 0) , Tris-HCl( pH8. 0~
9. 5) , Na2CO3-NaHCO3 ( pH9. 5~ 11. 0) , Na2HPO4-NaOH
( pH11. 5~ 12. 0) , 结果详见图 7, 该酶的最适 pH为 7. 0。
2. 3. 4 酶促反应动力学 采用双倒数作图法[ 8] , 如图
8,酶促反应动力学方程为:V= 2S/ 1+ 7. 4556S, S是底物
浓度, 最大反应 速度 2. 7 @ 104 L/ ml, 米 氏常数
1. 35 @ 10- 3 mM。
412005年第 1期 薛庆节等:工程菌酯酶 B1的纯化及性质研究
图 5 不同纯化阶段酯酶 B1 的 SDS-PAGE 电
泳
Lane 1 the total protein of E . coli DH5A
Lane 2 the total protein of E . coli DH5A/ pRL-B1
Lane 3 Fract ion from DEAE-Sepharose CL-6B
Lane 4 Fract ion from Sephadex G-150 gel filtrat ion
Lane 5 Low molecular marker
图 6 温度对酯酶 B1活力的影响
2. 3. 5 酶的酸碱稳定性
将用无离子水透析的酶液
稀释于 0. 05mol/ L 的 pH3~
10的缓冲液中,于 37 e 处理
24h, 取出后立即放置冰浴
中, 然后用 0. 2mol/L NaH2
PO4-Na2 HPO4 缓冲液调到
pH7. 0, 再测定酶活力, 由图
9可见该酶在 pH6~ 9范围
内较稳定。
图 7 pH 值对酯酶 B1 酶活力的影响
2. 3. 6 各种化学试剂对酶
活力和影响 在测定酶活
的反应体系中添加浓度为
0. 2 mmol/L 不同的金属离
子,每个实验重复两次。从
表 2可以看出, Cu2+ 对酶有
该激活作用, EDTA 对该酶
活无影响, 说明该酶不需要金属离子维持活性, SDS 及 Hg2+ , Ba2+ 等
图 8 酶促反应动力学曲线
对该酶有抑制作用。
表 2 各种化学试剂对降解酶活性的影响
Chemicals Chemicals Relative act ivity/ % Relat ive activity/ %
Control Mn2+ 103. 1 100
EDTA Zn2+ 95. 9 99. 8
SDS Fe3+ 79. 8 53. 5
Ca2+ Pb2+ 75. 7 106. 2
Mg2+ Ba2+ 47. 9 108
Cu2+ Hg2+ 40. 1 119. 7
2. 3. 7 酯酶 B1对农药对硫磷( 1605)
图 9 不同 pH 对酶稳定性的影响
的降解 鉴定酯酶 B1 岛津对农药的降解作用, 我们使用了
GC-2010 气相色谱仪, 检测条件: 检测器为氢焰光度检测器
(FID) 色谱柱: ( 125-503jdb-5) 操作温度: 柱温 210 e , 汽化温
260 e ,检测温 260 e 。柱流量: 10ml/min载气为高纯氮气(纯度
大于 99. 99%)。
将比活力为 3. 25L/mg 的粗酶液 10ml 加入 50ml三角瓶
中,加入 8ml的 Buffer B , 及 100ppm 的对硫磷标准溶液 2ml,置
于25 e 的摇床上振荡反应,每隔 10min取出 1ml的处理液置于
5ml试管中, 1ml样品中加入 1ml的重蒸正已烷, 在混旋器上振荡 3min充分混匀, 6500r/ min离心 15min,取上
清液留作检测用,取出上清液后的剩余部分再加入 1ml重蒸正已烷, 在混旋器上振荡 3min充分混匀; 6500r/
min离心 15min,取上清液与上次取出的合并后作为检测样品; 转空载体菌株提取酶为对照。
由图 10可知, 酯酶 B1 对 1605快速降解, 对有机磷农药对硫磷( 1605)的降解率在 30min 内达 53. 8%,
90min内达 91. 5% ;对甲基对硫磷的降解率在30min内达 89. 2% ,效果优于对硫磷(图未给出)。而转空载体
42 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
菌株提取酶后对 1605很少降解。
图 10 酯酶 B1 对农药 1605的降解
3 讨论
将抗性库蚊的解毒酶基因克隆到大肠杆菌
中,得到工程菌, 该工程菌的表达产物酯酶 B1能
高效降解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、菊酯等四
大类农药,并已应用于实验室农药污水的处理,取
得了很好效果。本文将它的表达产物酯酶 B1分
离纯化,并测定了酶的性质及其降解特性, 旨在开
辟新的应用领域, 为酯酶直接用于生产中农药残
留的降解, 最大限度地减小农药对环境的影响。
将酯酶 B1纯化至电泳纯,为进一步得到结晶及研
究该酶的结构建立了坚实基础。目前, 其结晶的
研究正在顺利进行。工程菌具有产酶量大,易于培养的特点, 其产物酯酶 B1具有酸碱稳定性好、易于纯化、
酶促反应快等优点, 在生产上应用时,可将其初步分离纯化,简化工艺、提高收率,应用于瓜果蔬菜及环境中
农药残留的降解。也可将酶固定化后直接用于农药残留的处理(已另文发表)。
参 考 文 献
1 谭亚军,李少南,等.农药, 2003, 42( 12) : 12~ 18.
2 Fournier D, Bride JM, Mouchs C, et al. Pestic Biochem Physiol, 1987, 27(2) : 211~ 217.
3 PoiriM,RaymondM, Pasteur N. Biochem Genet , 1992, 30( 1) : 13~ 26.
4 闫艳春,乔传令,等.微生物学报, 2000, 40( 2) : 126~ 131.
5 闫艳春,姚良同,等.中国环境科学, 2001, 21( 5) : 412~ 416.
6 Sambrook J, FritschEF, T. ManiatisT.MolecularCloning. Beijing: Science publishing house, 1992.
7 Laemmli UK. Nature, 1970, 277: 680~ 685.
8 王镜岩,朱圣庚,等.生物化学(上) .第三版.北京:高等教育出版社, 2002, 355~ 363.
#国外动态#
全基因组扩增试剂盒
BioscienceTechnology 2003年7月31页报道: 美国Amersham Biosciences公司最近推出GenomiPhiTM DNA扩
增试剂盒。利用这种试剂盒可从有限的生物材料制备高质量的 DNA。这是一种简单的等温扩增技术,它不
需要使用热循环器。原材料可以是来自全血、颊面拭子、细胞印迹纸、植物组织和微生物的纯化的 DNA, 也
可是这些材料中的溶解的细胞。扩增的 DNA保持了原始单核苷酸多态性( SNP)信息,可供各种目的使用。
细菌 RNA分离试剂盒
Bioscience Technology 2003年 6月 26页报道:美国Ambion公司最近推出MICROBEEnrichTM试剂盒。这种
试剂盒可用于从宿主-细菌 DNA混合体中增富细菌 RNA, 选择性消除哺乳动物(宿主细胞) RNA,即:可消除
> 90%的哺乳动物 RNA,而保留高度增富的细菌 RNA。适用于全部细菌属种, 使用简便, 可在< 2小时内获
得结果。 汪开治
432005年第 1期 薛庆节等:工程菌酯酶 B1的纯化及性质研究