全 文 ：免疫分析新方法在食品安全检测中的应用*
李兴霞1, 2 王国霞2 潘家荣2
( 1沈阳农业大学食品学院,沈阳 110161; 2 中国农业科学院农产品加工研究所
农业部农业核技术与农产品加工重点实验室,北京 100094)
摘 要: 免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、检测成本低、安全可靠等优点, 已成为现代生命
科学的重要研究手段,在食品安全检测中有着良好的应用前景。本文综述了近几年来出现的免疫分析新方法, 简
单介绍了它们在食品安全检测中的应用。
关键词: 免疫分析 食品安全
Application of New Immunoassay Methods in Food Safety
Li Xingxia1, 2 Wang Guox ia2 Pan Jiarong2
( 1 Coll eg e of Food S cience , S heny ang A g ri cul tu ral Univ ersi ty , S henyang , L iaoning 110161;
2 I nsti tute of A g ro-f ood S cience & Te chnolog y , CA A S, K ey L abor atory of A gr ic ul tur al
N uclear T echnology and A g ro-F ood P rocessing of MOA , B ei j ing 100094) )
Abstract: With character istics of high sensitivit y, high specificit y, rapid r esponse, easy handling , low cost ,
safety and reliabilit y, immunoassay has become an im po rtant research method in modern life science, w hich w ill be a
pr ospected method in food safety detection. In this paper , new immunoassay methods emerg ing for r ecent years wer e
reviewed.
Key words: Immunoassay Food safety
随着全球食品安全问题的关注程度越来越高,
食品中污染物和危害物的检测越来越重要, 这就需
要快速、准确、灵敏、能进行多组分分析的检测技术。
免疫检测技术是近几年发展起来的新技术, 是将免
疫反应和现代测试手段相结合而建立的超微量测定
技术。免疫分析法就是基于抗原、抗体的特异性识
别和结合反应为基础的分析方法, 它具有特异性强、
灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全
可靠等优点,已成为 21世纪最具竞争性和挑战性的
检测分析技术 [ 1]。目前, 应用到食品安全检测领域
的免疫分析方法除了传统的放射免疫分析、酶联免
疫分析、荧光免疫分析、发光免疫分析外, 还出现了
分子印迹技术、流动注射免疫分析、免疫-PCR 技
术、免疫传感器技术及多组分免疫分析等新方法。
1 免疫检测新技术
1. 1 分子印迹技术
抗体作为一种高选择性分析试剂, 是免疫分析
的关键物质。但是, 作为一种生物试剂(蛋白质) ,
抗体的研制过程复杂, 周期长,存在诸多难以预测
的生物因素;并且抗体的理化性质不稳定, 对一些
分析条件如酸、碱、有机溶剂、温度等耐受性差, 所
以,它的应用受到很大限制。
最近, 在分析化学领域出现了一种分子印迹技
术( mo lecule imprinting technique) ,它利用化学手
段合成一种高分子聚合物 分子印迹聚合物( mo-
lecularly imprinted polymer, M IP) , M IP 能够特异
性吸附作为印迹分子的待测物, 在免疫分析中可以
取代生物抗体,被科学家誉为塑料抗体。与生物
抗体比较, MIP 具有稳定性好、制备周期短、费用
低、易于保存和可在粗糙环境中应用等优势。它具
有以下几个特点:
( 1)预定性( predeterminat ion) ,指可以根据不
收稿日期: 2005-09-14
* 基金项目: 十五国家科技重大专项"食品安全关键技术"信息共享平台建设( 2001BA804A42)
作者简介:李兴霞( 1979- ) ,女,硕士研究生,主要从事食品安全检测关键技术的研究
通讯作者:潘家荣
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
同的目的制备不同的 MIPs, 以满足各种不同的
需要。
( 2)识别性( recognition) , 指 MIPs是按照模板
分子定做的,可专一地识别印迹分子。
( 3)实用性( pract icability ) , 指 M IPs既可以与
天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、
受体与激素相比拟,又具有天然分子识别系统所不
具备的抗恶劣环境的能力, 显示出高度的稳定性和
较长的使用寿命 [ 3]。
目前, MIP 的研究仍处于初级阶段, 但它在食
品安全检测中的潜力已引起人们的关注 [ 2]。Sieman
等的研究显示农药阿特拉津的 M IP 与阿特拉津单
克隆抗体的反应图谱类似 [ 10]。M IP 代替生物抗体
测定农药 2, 4-D, 检测限达到了 10-9 mol/ L。使用
MIP s 作为生物传感器的识别元件是 M IPs 另一具
有发展前景的应用。较之抗体、受体或酶, MIPs 制
成的传感膜有明显的优越性, 如适用范围广、能够
长期稳定、耐高温和耐腐蚀。Immer [ 8] 等利用分子
印迹聚合物固相萃取水样和土壤中氯三嗪农药, 回
收率为 80% , 最低检测量 0. 05~ 0. 2g/ L 。Stan-
ker 等研制的 M IP 可从牛肝中富集除草剂莠去津,
使得高效液相色谱法的精度得到提高, 检测限达 5
10-9。1968年日本的米糠油事件就是多氯联苯
( PCBs)污染造成的。日本学者 KenHosoya、Kim-i
hiro、Yoshizako等人利用邻、间、对三种二甲苯作为
模板,以EDMA 为交联剂兼功能单体合成M IPs, 来
研究此 MIPs对 PCBs 的识别能力, 研究发现以邻
二甲苯为模板合成的 MIP 对邻位具有氯原子的
PCBs有很好的识别效果, 而以对二甲苯为模板合
成的 MIP 对对位具有氯原子的 PCBs 有很好的识
别效果。
1. 2 流动注射免疫分析法
1980 年 Lim CS 等[ 11 ] 将速度快、自动化程度
高、重现性好的流动注射分析( f low inject ion analy-
sis , FIA) 与特异性强、灵敏度高的免疫分析 ( im-
munoassay) 集为一体, 创立了流动注射免疫分析
法( flow inject ion immunoassay , FIIA ) 。目前已
在药物分析、环境监测及农药残留检测等方面得到
了广泛应用。
FIIA具有很多优点。一是分析速度快,自动化
程度高。与其他免疫分析相比, 它无需耗时较长的
温育过程,加样及洗涤过程均可由流动注射装置自
动完成。计算机技术应用到流速控制、信号收集及
数据处理等过程,使自动化程度进一步提高。二是
应用可反复多次使用的固相抗原(抗体) , 节省了价
格昂贵的抗原(抗体)。三是测定的重现性比传统方
法有所提高。这得益于避免了过多的人工操作带来
的误差。四是可以根据不同的测定对象选择合适的
固相载体、检测器和免疫测定方法,更具灵活性和多
样性。五是灵敏度与检出限与传统方法相比毫不
逊色[ 12]。
Wor tberg[ 13]等报道了一种简便的测定三嗪类
除草剂的 FIIA。三嗪类衍生物固定在环氧乙烷丙
稀珠上作为亲和柱( 0. 8cm 4cm) ,并以 Eu( )鳌
合剂作荧光物的标记抗体所饱和。待测试样中的抗
原加入亲和柱后将与固相抗原竞争有限量的并结合
在固相上的荧光标记抗体,使部分标记抗体从固相
上洗脱下来,流出液中标记抗体的量与试样的加入
量成正相关。通过测定荧光强度可对试样定量。检
出限为 1g . L-1 , 分析时间不到 30min,与其他免疫
分析方法相比, 分析速度大大提高。M ihaela
Badea
[ 11]等人应用流动注射免疫分析法检测牛奶中
的黄曲霉毒素( AFM 1) , 得到的黄曲霉毒素 M1的
动态的范围是 20~ 500 ppt , 最低检测限是 11 ppt,
RSD< 8% ,用这种方法对不同的牛奶样品分析的结
果与用 HPLC 的结果有很好的一致性。
1. 3 免疫-PCR技术
聚合酶链式反应 ( Polymerase chain r eact ion)
技术 1985年的问世,引起分子生物学的一场革命。
Sano[ 14] 等于 1991年首次将 PCR 技术引入免疫反
应,将抗原-抗体反应的高度特异性与 PCR 技术的
高灵敏度、高自动化、操作简便等特点结合起来, 形
成了免疫-PCR技术( Immuno-PCR) ,开创了免疫检
测技术的新时代。免疫-PCR 将抗原-抗体反应与
PCR强大的扩增能力结合在一起, 使免疫分析的灵
敏度进一步提高, 是目前为止最为敏感的检测方法,
理论上可以检测到一个抗原分子的存在。免疫-
PCR的基本原理与 ELISA 基本相似, 所不同的是
用一段可扩增的 DNA 分子代替 ELISA 中的酶来
放大检出信号。
432006年第 1期 李兴霞等:免疫分析新方法在食品安全检测中的应用
这种新技术具有以下优点: 特异性强, 因为形
成的免疫-PCR 是建立在酶联免疫吸附试验基础
上,所以具有抗原-抗体反应的特异性; 敏感性高,
免疫-PCR结合了 PCR惊人的扩增能力, 所以其敏
感性比较高; 操作简便, 不需特殊设备, 一般实验
室只要具有酶联免疫技术和最普通的 PCR技术就
可以完成。
吴自荣[ 10]等用聚乙烯亚胺( PEI)作为连接分子
成功的将特异性抗体直接与 DNA 分子连接, 构建
了 3种 Ab-DNA 基因探针, 组成了新的免疫-PCR
检测系统。这 3种特异性 Ab-DNA 探针可用于检
测 3种相应抗原, 检测 HSA 抗原的最低含量可达
1. 0 10- 10 mg/ m l,灵敏度比 ELISA 高 106倍。由
于具有高特异性和高灵敏度, 免疫- PCR技术有着
广泛的应用前景,如检测鸡肉中的弯曲菌属、鼠伤寒
杆菌及乳酪中的李斯特菌属等, 也可以用这一方法
来检测极微量的抗原,如毒素、毒物、有毒化学物质
等。例如有报道将免疫-PCR 用于大肠杆菌的检
测,取得了不错的效果。Whyte 等人分别采用传统
方法与免疫- PCR技术对生禽肉中沙门氏菌进行检
测发现,采用传统方法检出了 16%的样品被沙门氏
菌污染,而运用免疫-PCR 技术则检出了 19% 的污
染样品,可见免疫-PCR技术的敏感性更强。
1. 4 免疫传感器
免疫传感器 ( Immunosensor )是将免疫测定技
术与传感技术相结合的一类新型生物传感器, 其结
构与传统生物传感器相同,可分为生物敏感元件、换
能器和信号数据处理器三部分。生物传感器具有体
积小、成本低、灵敏度高、选择性及抗干扰能力强、响
应快等优点[ 5] ,正逐渐被应用。
免疫传感器的工作原理和传统的免疫分析技术
相似,即把抗原或抗体固定在固相支持物表面,通过
抗原抗体特异性结合来检测样品中的抗体或抗原。
不同的是,传统免疫测试法的输出结果只能定性或
半定量地判断, 一般不能对整个免疫反应过程的动
态变化进行实时监测, 并且所需测定时间较长。而
免疫传感器有能将输出结果数字化的精密换能器,
不但能达到定量检测的效果, 还能实时监测到表面
的抗原、抗体反应,有利于对免疫反应进行动力学分
析,同时缩短了测定时间。由于抗原与抗体的特异
性高,减少了非特异性干扰,大大提高了检测的灵敏
度和准确性,同时扩大了检测范围[ 4]。
T ahir [ 16]等人采用电化学免疫传感器技术检测
大肠杆菌 O157: H7, 可以在 10min 内完成分析, 检
测精度可达 10CFU/ m l。利用 SPR(表面等离子共
振)免疫生物传感器检测饲料、肉品中盐酸克伦特罗
残留,检测精度可达 0. 27g/ L ; 氯霉素的检测限为
0. 1g/ L,检测范围 1~ 10g / L ; Ase 等人用表面等
离子体共振免疫传感器快速测定了脱脂牛奶和生牛
奶中的硫胺二甲嘧啶残留物, 检测精度低于 1g/
m l
[ 7] 。T ahir 等人采用电化学免疫传感器技术检测
大肠杆菌 O157: H7, 可以在 10min 内完成分析, 检
测精度可达 10CFU/ ml。
Zhao 等人用多克隆抗 PCB体( Abs)制作光纤
免疫传感器对其测定,检测下限为 10mg/ L。近几
年,免疫传感器检测食品中毒素有较多研究,并取一
些进展。Wayne 等人用表面等离子体振子共振免
疫传感器来检测玉米抽提物中的伏马菌素 B1
( FB1)浓度, 检测下限为 50 ng / ml, 分析时间为
10min; T rachan等人用传感器 颗粒基免疫传感
器来检测食品中的黄曲霉素 ( AFB1) , 检测下限为
4ng/ g,整个过程只用 8m in。还有葡萄球菌毒素、肉
毒毒素、蓖麻毒素等已有相应的免疫传感器被研制
出。
1. 5 多组分分析物免疫分析
多组分分析物免疫分析 ( Mult ianalyte immu-
noassay, MIA)是指在同一份样品中, 同时测定两种
或两种以上的相关分析物的免疫分析技术。这种技
术的应用对需要检测多种物质的综合测定提供了重
要信息,有利于环境、食物的多种农药残留和职业中
多种农药接触检测, 特别是对混配农药接触分析以
及对其联合作用及体内代谢动力学的探讨和研究具
有重要意义。
由于抗体的特异性,一种抗体一般只能检测一
种抗原,当进行多组分分析时,就得同时使用多种抗
体,多组分免疫分析技术现在有两种设计方式: (一)
多探针标记法 它基于用不同标记物对多种抗原或
半抗原标记,用竞争法测定各物质的量。(二)多组
分定位包被空间分辨分析法 即利用空间的不同位
置标记同种标记物来测定,在不同的固相体系或同
44 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
一固相载体上的不同反应区带上包被不同抗体, 用
于固相免疫同时测定。目前, 该法已取得了相当成
功的应用成果[ 18] 。
Muldoo等 [ 19]评价了用多组分分析物 ELISA
分析法分析三嗪类农药, 他们制备了 5种三嗪特异
性单克隆抗体来检验莠去津、西玛津和氰草津的反
应性和灵敏性, 其中 3种抗体表现出相同的反应方
式,而另两种各表现独自的反应方式,然后选 3种反
应方式各不相同的抗体, 同时进行莠去津、西玛津和
氰草津及总三嗪类的含量检测, 并把这种免疫分析
结果与高效液相色谱分析结果进行对比分析, 发现
莠去津、西玛津和氰草津和总三嗪量其各自相关系
数分别为 0. 94、0. 90、0. 92和 0. 85。王敏灿[ 7] 等人
用Eu3+ 和 Sm3+ 的二乙三氨五乙酸的配合物标记
小分子药物-苯巴比妥和苯妥英钠, 用二抗包被, 通
过竞争法对苯妥英钠苯和苯巴比妥进行同时测定,
其灵敏分别可达 50ng/ m l和 20ng/ m l。
2 问题与展望
食品安全问题已成为 21 世纪消费者面临的首
要问题。为了保证食品的安全,研究快速、灵敏的检
测技术尤为重要。目前, 传统的检测方法存在样品
前处理时间长, 所需要的仪器设备昂贵,技术人员的
要求较高等弊端。免疫检测技术以其明显的优势处
于检测技术的前沿。
目前尽管这些新技术发展比较快, 而且也得到
比较广泛的应用,但仍然存在许多问题有待于进一
步解决,例如在水溶液或极性溶剂中进行分子印迹
和识别仍是一大难题, 分子印迹聚合物中残余的印
迹分子难以除尽会影响分析结果; F IIA 一次只能分
析一个试样,很难满足环境和食品检测分析中大批
量试样分析的需要。免疫-PCR 虽然还处于实验阶
段,但它检测的灵敏度很具有吸引力。寻找一种来
源方便、高效、专一的连接分子将会是此研究方向的
一个热点。使用更简单、更实用的新型固定化技术
和性能更优越的载体材料以促进固定化生物活性单
元获得更多的实际应用仍是生物传感器今后的研究
热点和难点。多组分分析物免疫分析中的几种标记
物的测定条件必须相互妥协,所以测定的灵敏度和
组分数均受到限制, 同时多组分定位的包被和检测
也将是该领域的研究难点。另外,从目前的研究看,
这几种新技术主要应用在农药残留特别是三嗪类农
药的检测中,对细菌、毒素、兽药残留和重金属残留
等其他污染物的研究比较少,所以这也将是今后的
研究热点。
本文所论述的几种免疫检测新技术主要是针对
免疫检测的主要环节和今后食品安全检测的发展要
求,将这几种技术运用到食品安全检测中必将提高
食品安全检测的有效性和实用性。
参 考 文 献
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