全 文 ：收稿日期:2006-05-30
作者简介:李万云(1955-),男,四川双流县人,副研究员,农业部有突出贡献的中青年专家,主要从事高产、优质、抗病杂交油葵新品
种选育与栽培技术研究
外源基因导入技术在主要农作物育种上的应用进展
李万云 李培夫
(新疆农垦科学院,石河子 832000)
摘 要: 以国内科技期刊上发表的文献研究结果为依据,综述了农杆菌介导技术、基因枪导入技术、花粉管通道技术
与激光微束穿刺技术在小麦、水稻、棉花、大豆、油菜等主要农作物育种上的应用进展。同时,还简要介绍了其中主要外源基
因导入技术的基本原理,并评价了其优缺点。
关键词: 农作物 外源基因 导入技术 应用进展
DevelopmentandProgressintheApplicationofExogenousGene
TransductionTechniquicsinMainSeasonCropBreeding
LiWanyun LiPeifu
(XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Shihezi8320001)
Abstract: Basedontheresultsofinformationinvestigaton,thepaperbrieflyreviewsthe
developmentintheresearchandapplicationoftransgeniccropbreedinginmainseasoncropandsummarizestransgenetic
techniquessuchasAgrobacterium-mediatedparticleguntransduction;polentubechanneltransduction;lasermicobeam
riansgenictechniques;inmainseasoncropbreeding(wheat,paddyrice,maize,coton,soybeanandrape).Theprincipleand
thefeatureofexogenousgenetransductiontechniquicsarealsodiscused.Attheendofthepaper,therearesome
commentsontheadvantagesanddisadvantagesofexogenousgenetransductiontechniquics.
Keywords: Exogenousgene TransductiontechniquicsApplicationprogres
农作物外源基因导入技术是一种在分子水平上
的转基因育种技术。它是将人工分离出与修饰过的外
源基因移植或导入受体作物品种的细胞,使其能够进
行复制、转录、翻译与表达,使外源基因的优良遗传性
状在分化的再生植株及其后代中的稳定遗传,并从中
选育出符合育种目标需求的转基因作物新品种或新
物种。
国内外对农作物外源基因导入技术的研究与应
用始于20世纪70～80年代,自从1983年世界首例转
基因农作物新品种在烟草上育成以来,对转基因技术
的研究与开发应用,引起世界各国的高度重视。近25
年来国内外专家相继研究成功与开发应用的外源基
因导入技术有农杆菌介导技术、基因枪导入技术、花
粉管通道技术、激光微束穿刺技术,电激穿孔技术、碳
化硅纤维介导技术、显微注射导入技术、生殖细胞原
位转化技术、电泳转化技术、超声波转化技术、聚乙二
醇(PEG)介导 技术等12种外源基因导入技术[1]。
据国际农业生物技术产业应用服务中心统计,自
1996年以来,全球转基因作物种植面积连续 9年以
来20%的速度持续增长。2004年全球转基因种植面
积超过5×104hm2的国家达到14个,种植总面积达到
8100×104hm2,比1996年增长了47倍。据专家预计,
今后 10年中世界种植转基因作物的国家将会达到
25个,转基因作物种植面积将达到 1亿 hm2(10000×
104hm2)。转基因农作物种植面积在全球的迅速增长,
说明采用各种外源基因导入技术所育成的农作物品
种不仅实现了产业化、规模化与商品化,而且在农业
现代化建设中成为高新农业技术发展方向。现将上述
12种外源基因导入技术中应用较为普遍 4种技术,
在我国小麦、玉米、棉花、大豆、油菜等作物的开发应
用研究进展概述如下。
1 农杆菌介导技术开发与应用
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第6期·技术与方法·
2006年第6期
1.1 农杆菌介导技术的基本原理与特点
农杆菌是一种天然进行农作物外源基因导入的
载体。农杆菌介导技术(Agrobacteriumtechnique)是农
杆菌在侵染受体时细菌通过受体原有的病斑或伤口
进入寄主组织,但细菌本身不进入寄主作物细胞,只
是把Ti质粒的T-DNA片段导入作物细胞基因组中。
农杆菌介导技术目前应用的主要有根癌农杆菌(A-
grobacteriumefaciens)和发根农杆菌(Asrobacteri-um-
rhizogenes)两种,它们同属根瘤菌属革兰氏阴性菌。
农杆菌可将自己的一部分 DNA(T-DNA)转移入作物
细胞,并再生出植株。根癌农杆菌内含Ti质粒;发根
农杆菌内含有Ri质粒[2]。农杆菌介导技术因为具有转
育周期短、优良遗传性状变异幅度小、农艺性状和经
济性状受干扰少、遗传性状稳定快等特点,所以成为
目前我国农作物进行外源基因导入时最常用的技术。
在应用外源基因导入技术获得成功的实例中,有80%
左右是通过农杆菌介导技术实现的。
1.2 农杆菌介导技术在我国主要农作物上的开发
应用
农杆菌的天然寄主是双子叶植物,我国已在棉
花、大豆、油菜、甜菜、烟草、拟南芥、番茄等 100多种
双子叶作物上进行外源基因的导入与转化获得成功。
经过国内外专家不懈的研究,直到1992年以后,才在
小麦、水稻、玉米等单子叶作物上采用农杆菌介导技
术获得了转基因植株。现列举部分应用成功的实例,
说明该项技术较之其它外源基因导入技术所取得的
更大的进展。
据黄益洪等[3]报道,他们采用农杆菌介导技术,将
含有Bar基因和Gus基因的min-Ti质粒对LBA4404、
AGL、EHA105等小麦品种进行外源基因导入,获得了
70多个对 PPT产生抗性的植株,经 PCR等分子检
测,显示部分植株实现了外源基因的成功转化[3]。中国
农科院生物技术研究中心郭三堆等[4]采用农杆菌介导
技术,将 Bt基因导入中棉所 12号、泗棉 3号等黄淮
海棉区主栽的棉花品种中,育成了高抗棉铃虫的转基
因棉花新品种[4]。徐香玲等[5]采用农杆菌Ti质粒介导
技术将Bt·K—δ内毒素基因导入黑农37号、黑农39
号等大豆品种,从其胚轴与子叶诱导出芽并再生出植
株,经卡那霉素筛选,Opine检测和DNA分子杂交,证
明了外源DNA转入并稳定整合到核基因组中[5]。浙江
省农科院病毒与生物技术研究所利用自主克隆成功
的油菜PEP基因并构建成反义表达载体,通过农杆
菌介导技术,将其导入浙江省油菜品种“浙油758”和
“浙油1号”的基因组中,育成了转基因油菜新品种
“超油 1号”和“超油 2号”,经多年测定,这两个品种
的含油量分别稳定在 47%和 53%左右,其含油量比
受体品种分别提高15%和25%以上。据查新“超油 2
号”含油量的提高幅度为世界之最,使我国在油菜转
基因育种领域的国际竞争中处于领先地位[6]。
1.3 对农杆菌介导技术的评价
农杆菌介导技术与其它外源基因导入技术相比,
具有技术成熟、简便易行、转化与导入机理清楚、转化
率高,导入受体基因明确,进行农杆菌介导外源基因
时所适用的外植体非常广泛,可以采用叶片、茎段、胚
轴、叶柄、子叶、幼胚或成熟种子。
农杆菌介导技术与基因枪导入技术和花粉管通
道技术等直接导入技术相比,在直接导入技术中,外
源基因是被动被整合到受体作物染色体上,而农杆菌
介导技术确能够主动选择所导入的 Ti质粒 T-DNA,
将其主动的插入到受体作物染色体上,由于导入受体
作物的基因明确,所以转化成功率相对高于其它导入
技术。
2 基因枪导入技术的开发与应用
2.1 基因枪导入技术(Particlegun)的原理与优点
基因枪进行外源基因导入的基本原理是通过火
药爆炸、高压放电和高压气体驱动作为动力加速携带
有外源基因的金属颗粒(钨粉粒或金属粒),使其进入
带细胞壁的受体作物细胞,达到外源基因被整合到受
体基因组内,进而实现被表达与转化的目的。
基因枪导入技术的最大优点是可以转化多种组
织和器官,被转化作物品种的受体可以是胚性悬浮细
胞、愈伤组织、未成熟胚、分生组织、也可以是花粉和
茎尖等。该项导入技术不受作物种类、基因型和器官
的限制,但可靠性较差,整合率较低,稳定遗传表达效
率在所有 导入技术中也是最低的。
2.2 基因枪导入技术在我国主要农作物上的开发
应用
实验证明,基因枪导入技术是一种几乎全能的外
源基因导入与转化技术,由于该项技术的日臻完善与
成熟,在国外应用该技术对农作物进行外源基因导入
李万云等:外源基因导入技术在主要农作物育种上的应用进展 77
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
研究与应用也日趋商业化。基因枪导入技术在我国的
研究与开发应用尚不普遍,现对其研究与应用进展情
况简介如下。
据傅荣昭(1997)报道,他们采用基因枪技术轰击
小麦幼胚,将雄性不育基因导入小麦栽培品种豫麦8
号,获得转基因植株。中国农业科学院徐琼芳等采用
基因枪导入技术将外源基因导入北京地区主栽品种
京411的未成熟胚中,获得了转基因植株[7]。山东农科
院作物所管延安等[8]采用基因枪导入技术将外源基因
直接导入受体再生胚性愈伤组织,培育成功转基因抗
除草剂小麦新品种[8]。燕义唐等采用基因枪导入技术
将RSVCP基因(水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基因)导
入水稻悬浮系后,将该基因整合进了受体水稻品种的
基因组中,并获得了转基因植株[9]。贾士荣等采用国产
火药式基因枪将质粒pB1121导入玉米花粉粒,然后
将被转化了的花粉粒进行人工授粉,获得了转基因玉
米植株。另据谢迎秋等报道,他们采用基因枪导入技
术,将通过PCR扩增的CLCuV的AC2基因导入受体
作物棉花叶片细胞进行瞬时表达,在叶肉及叶脉微管
束的组织中有较高的活性,表明采用基因枪导入技术
在棉花上导入AC2基因获得成功[10]。
2.3 对基因枪导入技术的评价
基因枪导入技术近年之所以受到重视与广泛开
发应用,是因为它可以应用的受体范围广泛,能够通
过轰击细胞团和各种组织块使细胞穿孔,克服细胞壁
的障碍,单、双子叶作物均可采用。基因枪轰击容易操
作,一枪可以产生多个靶位点,并可打入不同层次的
组织细胞中。基因枪导入技术还可以避开组织培养过
程,直接转化受体作物植株。在火药爆炸、高压放电和
高压气体作为驱动力的基因枪中,高压放电和高压气
体驱动的基因枪进行外源基因导入的转化率高于火
药爆炸基因枪。
3 花粉管通道技术的研究开发与应用
3.1 花粉管通道技术的基本原理
花粉管通道技术(Polen-tubepathway)是利用农
作物授粉后所形成的天然花粉管通道(又称花粉管引
道组织)经珠心通道将外源DNA携带入胚囊,转化受
精卵和其前后的生殖细胞(精子、卵子),由于它们仍
处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态,并且正在
进行活跃的DNA复制、分离和重组,所以很容易将外
源DNA的片段整合到受体基因组中,达到遗传转化
的目的。所得到的转化体将是有活力的种子。这一项
技术可应用于任何一种开花农作物。
3.2 我国开发应用花粉管通道技术的农作物种类
花粉管通道技术是将供体总DNA片段直接导入
受体作物,通过筛选具有目标性状的优良后代培育农
作物新品种和新种质的现代农作物育种新技术。自从
20世纪 70年代根据周光宇教授提出的植物远缘杂
交中存在着“DNA片段杂交”假说,创立花粉管通道
外源DNA的直接导入农作物的新技术以来,该项技
术已在我国的小麦、水稻、大麦、棉花、大豆、茄子等
40多种农作物与蔬菜上得到开发与应用。
3.3 花粉管通道技术在我国主要农作物上的开发
应用进展
花粉管通道技术自创立以来,已在我国主要农作
物育种的应用上取得很大进展,现仅列举以下部分成
功的实例,说明应用进展情况。
据成卓敏等[11]报道,他们采用花粉管通道技术将
大麦黄矮病毒Gpy株系的外壳蛋白基因(CP基因)导
入小麦,育成了抗黄矮病毒Gpy的转基因株系[11]。甘
肃省农科院倪建福等[12]将远缘光合效率高的C4作物
玉米、高梁,以及抗逆行强的长穗偃麦草的总 DNA,
采用花粉管通道技术导入小麦栽培品种的基因组中,
选育成功抗逆行强的春小麦新品种 891222和 89137
[12]。何登骥等[13]采用花粉管通道技术将野生稻、茭瓜、
稗草、玉米、高梁、大豆等作物的DNA导入水稻品种,
获得了大量变异材料,其中用早籼稻90-519作为受
体导入茭瓜外源DNA,育成了HK4早籼新品系[13]。黑
龙江农科院雷勃钧等[14]通过采用花粉管道通技术,直
接导入外源DNA,育成高产、优质、高蛋白大豆新品种
“黒生101”[14]。吴小月[15]采用花粉管通道技术,将中棉
的DNA导入陆地棉品种,培育成功高产、优质、吐絮集
中、抗逆性强、耐渍涝、并耐枯、黄萎病的棉花新品种
“湘棉12号”[15]。
江苏农科院倪万潮等[16]采用花粉管通道技术,将
中国农科院生物技术研究中心郭三堆构建的 Bt+CP-
TI双价抗虫基因导入石家庄市农科院研究员赵国忠
培育的优质棉花新品种“石远321”中,育成了抗虫棉
新品种“SGK321”[16]。另据新疆石河子大学工程学院乐
锦华等[17]报道,他们采用花粉管通道技术,将菜豆几
78
2006年第6期
丁质酶基因与烟草 β-1,3葡聚糖基因双价植物表达
载体 pBLGC导入新疆棉花主栽品种 (系)550、822、
1304与引进品种“石远 321”中,通过卡那霉素检测、
PCT-Southem验证、抗黄萎病、枯萎病筛选,经过6～10
个世代选育,育成了抗枯萎病、抗(耐)黄萎病性能强、
遗传性状稳定的转基因抗病棉花新品系[17]。
3.4 对花粉管通道技术的评价
花粉管通道技术是利用整体植株的卵细胞、受精
卵和早期胚细胞对导入的外源DNA进行转化。在转
化过程中不需要对受体细胞、原生质体等进行组织培
育和诱导再生植株等一整套的人工培养过程。由于能
够在整株水平上对外源基因进行导入与转化,技术操
作简便易行,大田、盆栽、温室中均可进行。该项技术
不受受体限制,单胚珠与多胚珠的单、双子叶作物均
可采用。用来进行导入与转化的外源DNA可以是裸
露的、重组在质粒上的,也可以应用于重组分子的导
入。还可以任意选择目前生产上的主栽品种进行外源
DNA的导入,达到实现目的性状基因的转移。花粉管
通道技术与常规育种技术密切结合,还可以缩短育种
年限[18,19]。
4 激光微束穿刺技术的开发与应用
4.1 激光微束穿刺导入技术的原理
激光是由激光发射器发出的一种与自然光不同
的辐射光,激光与普通光相比,具有能量高度集中、颜
色单一、方向性好、定向性强、亮度高等特性。由于激
光是一种相干性很强的单色射线,一定波长的激光经
显微聚焦,可以形成微米级光束,其直径为1μm左
右,用这种激光束对生物靶体,如对受体作物的细胞
壁和花粉粒进行穿刺,能引起细胞膜的可逆性穿孔。
以往激光微束主要用于细胞生物学与遗传学的研究,
进入20世纪80年代以后,随着现代生物工程技术的
发展,激光微束穿刺技术开始向基因与细胞工程渗
透。采用显微聚焦到微米级的激光微束对受体作物的
组织和细胞进行穿刺,就可以进行外源基因的导入。
4.2 激光微束穿刺技术在我国主要农作物上的应
用进展
我国对激光微束穿刺技术的研究开发与应用始
于1972年,由四川大学生物系率先在油菜上采用激
光诱变育种技术研究,并育成新品种之后,全国相继
有20多个省、市、区的科研单位开展了激光在农业上
的应用研究。据不完全统计,目前我国采用激光微束
穿刺技术,已在小麦、水稻、棉花、大豆、油菜、蚕豆、番
品、黄瓜、马铃薯、牧草、中药材、蚕桑等 20多种农作
物上共选育成功并大面推广的新品种100多个,育成
品种的数量与推广种植面积均居国际领先地位[20]。
在育成的小麦品种中,推广面积最大的为西北植
物研究所育成的“小偃6号”,累计推广种植面积超过
360×104hm2,已成为北方麦区的主栽品种,曾荣获国
家科技发明一等奖。在育成的水稻品种中,推广面积
最大的是湖南农科院育成的“湘早籼8号”,推广种植
面积达66.7×104hm2。在育成的棉花品种中,推广种植
面积较大的有“皖棉 1号”与“皖棉 8号”,其中“皖棉
1号”被列为国家优质棉新品种[20]。
4.3 对激光微束穿刺技术的评价
凡采用过激光微束穿刺技术的单位认为,该项技
术的最大优点是可以利用的外植体的种类较为广泛,
不受基因型的限制。利用显微镜聚焦瞄准靶细胞时定
位重复性好,受体细胞可以是花粉、单细胞、组织块或
微器官等,输出的能量可以控制,对受体细胞损伤小、
恢复快。单、双子叶作物均可采用。采用激光微束穿刺
技术进行外源基因导入与转化的效果和基因枪导入
技术相似,转化率可达0.2%～2.0%。
5 外源基因导入技术在世界各国主要农作物
育种中的应用进展
近20年来世界各国应用外源基因导入技术培育
优质、高产、抗病虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、抗盐碱作
物品种上取得了较大的进展,育成的转基因农作物品
种 已在越来越多国家的农业生产得到大面积推广应
用。
据不完全统计,世界各国通过各种外源基因导入
技术培育成功小麦、水稻、玉米、棉花、大豆、向日葵、
油菜、甜菜、烟草、马铃薯、苜蓿、胡萝卜、番茄、黄瓜、
芹菜等60多种转基因农作物品种,各种作物进入田
间试验的转基因植株已超过45000株,经各国批准
进行商品化生产的各种转基因农作物已超过100种,
其中美国已达到53种。
1999年全世界种植转基因农作物品种的国家有
12个,种植总面积达 4000×104hm2,其中大豆面积为
2160×104hm2;玉米为 1120×104hm2;棉花为 370×
104hm2。到2004年全世界种植转基因农作物品种的
李万云等:外源基因导入技术在主要农作物育种上的应用进展 79
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
国家有18个,种植总面积达8100×104hm2,其中仅美
国转基因农作物品种的种植面积就达4280×104hm2。
2001年世界转基因农产品销售额为 30.44亿美元、
2003年时达到 47.5亿美元、2005年时超过 80亿美
元[20]。
在我国农业生产上得到大面积种植的转基因农
作物品种有小麦、水稻、棉花、大豆、油菜与各种蔬菜,
2000年仅转基因抗虫棉的种植面积达 125.9×
104hm2,2003年时上升到300×104hm2,占到当年棉花
种植总面积的48%。到2004年,所育成的20多个转
基因小麦、水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、烟草、番茄的
种植面积迅速扩大到466.7×104hm2[20]。
6 外源基因导入技术的发展趋向与应用前景
通过以上的阐述,使我们了解到外源基因导入技
术是利用重组DNA技术与建立的转化体系与各种转
化途径,将外源基因导入受体作物细胞与组织,育成
转基因农作物的新品种的现代育种新技术。从以上所
介绍的4种外源基因导入技术,我们可以将其分为两
大类,一类是通过农杆菌介导的间接导入技术;另一
类是通过基因枪、花粉管通道、激光微束穿刺等外源
基因直接导入技术。
上述外源基因导入技术目前研究与应用上总的
发展趋势是对受体农作物表达载体的构建更加多样
化,多基因同时导入更加受到重视,其中有的导入技
术为其使转化程序更为简化,转化效率进一步提高,
可导入的外源基因更为广泛,对其开发应用更为集
中。此外,以上所介绍直的接导入外源基因技术所用
的受体材料也更加多种多样,已由原来的离体培养导
入系统发展到不依赖再生的原位转化系统。
未来农业生产的发展,对农作物新品种的选育目
标提出了更高的要求,不仅要求高产、优质、低耗、还
要求多抗,具有多种用途。要实现上述育种目标,仍采
用常规育种技术是难以达到的,采用外源基因导入技
术,不仅可以打破种属间杂交障碍,扩大物种杂交范
围,提高物种变异频率,拓宽育种领域,缩短育种周
期,提高育种水平。因此,在现代农作物新品种的选育
上,外源基因导入技术具有更为广阔的开发应用前
景。
参考 文献
1 荞克强主编.农业生物工程(第二版)[M].北京:化学工业出版
社,2004,106～127.
2 吕彦,王平荣,孙亚盈,等.分子植物育种,2005,3(2):543～
549.
3 黄益洪,周森平,叶兴国,等.作物学报,2002,28(4):510～515.
4 郭三堆,崔洪志,倪万潮,等.中国农业科学,1999,32(3)1～7.
5 徐香玲,高晶,刘伟华,等.大豆科学,1997,16(1)6～11.
6 王德平,王丽伟.农业科技管理,2004,23(5):7～10.
7 徐琼芳,李连成,陈孝,等.中国农业科学,2001,34(1):5～8.
8 管延安,李根荣,隋新霞,等.山东农业科学,2002,(5):42～45.
9 杨奇志,赵琦,孔建强,等.生物技术通报,2003,(6):14～17.
10 孙善君,李仕贵,朱生伟,等.分子植物育种,2005,3(2):233～
239.
11 成卓敏.植物保护,1996,(3):18～20.
12 倪建福,周文麟.甘肃农业科技,1999,(3):31.
13 何登骥,詹庆才,曾曙珍.作物研究,2002,(2):100～101.
14 雷勃钧,钱华,李希臣,等.作物学报,2000,26(6):725～730.
15 吴小月,周光宇,农业分子育种研究进展 [C].北京:中国农业
出版社,1993,125～128.
16 倪万潮,张震林,郭三堆.中国农业科学,1998,31(2):8～13.
17 乐锦华,祝建波,崔百明,等.石河子大学学报(自然科学版),
2002,6(3):173～178.
18 欧巧明,陈玉梁,张正英,等.中国农学通报,2005,21(1):
41～45.
19 于晶,任朝阳,闵丽,等.东北农业大学学报,2006,37(1):
130～134.
20 李万云,李韬.中国农学通报,2005,21(12):166～169.
80