全 文 ：第 wu卷 第 t期
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林 业 科 学
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松材线虫携带的一株荧光假单胞细菌
致萎毒素的初步分离
赵博光 梁 波 徐 梅 赵林果
k南京林业大学森林资源与环境学院 南京 utssvzl
摘 要 } 用荧光染色显微生测法检测液体培养基的无细胞滤液毒性 o研究从松材线虫虫体上分离鉴定的荧光假
单胞 Š¦x p t„菌株在寄主体外培养的产毒现象 ∀结果表明 }Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液对黑松细胞的毒性
随培养天数增加而增强 o培养到第 w天时 o无细胞滤液的毒性开始进入相对稳定期 ∀因此 o在进行该菌株毒素的分
离鉴定工作中 o可将 w §作为其培养时间 ∀使用 ⁄ p vy透析膜对培养 w §的 Š¦x p t„无细胞滤液透析后的毒性
测定结果显示 }其膜内和膜外组分生测毒性分别与对照培养基的无细胞滤液毒性之间的 τ检验差异显著 o证明其
透析膜内 !膜外组分均有毒性 ∀该结果表明 }Š¦x p t„菌株的毒素不是单一化合物 o而是由比较多的物质组成 o其
中含有大分子物质 o如蛋白质 !多肽 !酶等 ~也有小分子有机化合物 ∀
关键词 } 毒素 ~荧光假单胞菌 ~松材线虫 ~透析 ~荧光显微生测法
中图分类号 }≥zyv1t{ 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussylst p sszx p sw
收稿日期 }ussw p tu p tv ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助的重点项目kvswvsx{sl ∀
Πρελιµιναρψ Παρτιτιον οφ τηε Τοξινσ οφ α Στραιν ιν Πσευδοµονασφλυορεσχενσ
ασσοχιατεδ ωιτη Βυσαπηελενχηυσ ξψλοπηελυσ
«¤² …²ª∏¤±ª ¬¤±ª…² ÷∏  ¬¨ «¤²¬±ª∏²
k Χολλεγε οφ Φορεστ Ρεσουρχεσ ανδ Ενϖιρονµεντo Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvzl
Αβστραχτ} ײ ¬¨³¯²µ¨ ·«¨ °¨ ¦«¤±¬¶°¶²© ³¬±¨ º¬¯·§¬¶¨¤¶¨ o¬± √¬·µ²·²¬¬± ³µ²§∏¦·¬²± ²© ¤ ¥¤¦·¨µ¬∏° ¶·µ¤¬±o Š¦x p t„
k Πσευδοµονασφλυορεσχενσl ¬¶²¯¤·¨§¤±§¬§¨±·¬©¬¨§©µ²° Βυσαπηελενχηυσ ξψλοπηελυσo º¤¶ ¬¨¤°¬±¨ §q ײ¬¬¦¬·¼ ²©·«¨ ¦¨¯¯ ©µ¨¨
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Κεψ ωορδσ} ·²¬¬±~ Πσευδοµονασφλυορεσχενσ~ Βυσαπηελενχηυσ ξψλοπηελυσ~§¬¤¯¤¼¶¬¶~©¯∏²µ¨¶¦¨±¦¨ °¬¦µ²¶¦²³¬¦¥¬²¤¶¶¤¼
在调查并鉴定了中国松材线虫病疫区的松材线虫k Βυσαπηελενχηυσ ξψλοπηελυσl携带的细菌种类及分布的基
础上 o对黑松k Πινυστηυνβεργιιl幼苗 !幼树及 z ∗ {年生大树进行了接种试验 ∀大量采样和分离的结果确定了
在中国健康黑松和马尾松k Πινυσ µασσονιαναl体内没有内生细菌的存在 ∀根据接种实验及病原的再分离结
果 o认为松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性相关 o并提出松材线虫病是松材线虫和致病细菌共同侵染
引起的复合侵染病害的假说k«¤² ετ αλqoussvl ∀谢立群等kusswl对接种松材线虫后黑松的不同发病阶段 o
树体内非接种枝上的线虫 !细菌的种类及数量变化动态进行了研究 o结果表明 }非接种枝上 o在发病早期就有
细菌检出 ~至发病后期 o病树基本枯死时 o线虫和细菌数量才迅速增加 ∀发病初期至中期 o细菌种类比较单
一 o最早出现的细菌为假单胞属的细菌 ∀随着病情的发展 o细菌不但数量迅速增加 o而且种类也增多 o但优势
菌群仍为假单胞属细菌 ∀此外 o还用电子显微镜和普通光学显微镜观察到线虫携带的细菌及其携带部位并
测定了线虫携带的细菌的数量k赵博光等 ousss ~谢立群等 oussul ∀
国内外均有报道证明 o无菌松材线虫失去致病性 o不产毒kŽ¤º¤½∏ ετ αλqot||z ~曹越等 ot||yl o接种无菌
线虫后不能使寄主松树发病k«¤² ετ αλqoussv ~赵博光等 oussw ~«¤±ª ετ αλqot||zl ∀然而 o生测表明松材线
虫携带的细菌产毒k«¤² ετ αλqoussv ~ ‹¤± ετ αλqoussv ~’®∏ ετ αλqot|{s ~Ž¤º¤½∏ ετ αλqot||y ~t||{ ~«¤±ª
ετ αλqot||zl o接种无菌线虫与细菌的混合物 o能导致寄主松树萎蔫k«¤² ετ αλqoussv ~赵博光等 oussw ~
Ž¤º¤½∏ ετ αλqot|||l ∀上述报道均为细菌参与松材线虫病提供了证据 ∀
关于松材线虫病的致萎机制 o目前多数研究者认为毒素在致病过程中起着重要作用 ∀但是对于毒素的
来源却有不同的看法 ∀ ’®∏等kt|{sl和 ’®∏kt||sl首先提出在松材线虫病的致病过程中有毒素的参与 o并从
感染松材线虫病的黑松 !赤松k Πινυσ δενσιφλοραl和多脂松k Πqρεσινοσαl的松树针叶和木材中提取 !鉴定致萎活
性的物质 }苯甲酸 o邻苯二酚 ou p氢松柏醇和 { p羟基香芹鞣酮 ~后来 …²¯ ¤¯等kt|{ul和 ≥«¤«¨ ±¨kt|{wl又从感
病的欧洲赤松k Πqσψλϖεστρισl上分离到了 ts p羟基马鞭草烯酮和 { p羟基香芹鞣酮 o经生测证明这些物质均
有致萎活性 ∀另据曹越等kusstl报道 o自然感病的 tx年生黑松和马尾松以及人工感病的黑松苗中有致萎毒
素物质苯乙酸和 u p甲氧基肉桂酸 ∀ Ž¤º¤½∏等kt||{l和 «¤±ª等k t||zl对松材线虫携带的细菌进行研究 o鉴
定出 v种对松树细胞产生毒素的细菌 o分别为蜡状芽孢杆菌k Βαχιλλυσχερευσl o枯草芽孢杆菌k Β q συβτιλισl和巨
大芽孢杆菌k Β q µεγατεριυµl o并且分离 !鉴定出这些细菌的代谢毒素为苯乙酸 ~’§¤±¬等kt|{xl等认为松材线
虫分泌的纤维素酶在早期致病过程中起到了关键作用 ∀严东辉等kt||zl对松材线虫体外分泌物的组成酶进
行了研究 o认为松材线虫病的初始病理反应不仅仅有纤维素酶的作用 o可能还有其他酶的参与 ∀Ž²­¬°¤等
kt||wl对松材线虫的分泌物进行了电泳分析 o认为纤维素酶在致萎机制中起重要作用 ∀
迄今尚未见与松材线虫相关的细菌产生的大分子物质参与松材线虫病的致萎作用的报道 ∀本试验对松
材线虫携带的假单胞菌 Š¦x p t„进行其致萎毒素的初步分离纯化 ∀
t 材料与方法
111 菌种
从松材线虫虫体上分离的荧光假单胞菌 Š¦x p t„ 菌株k Πσευδοµονασ φλυορεσχενσlk«¤² ετ αλqoussvl ∀
该菌株保存于南京林业大学森林保护系 ∀
112 获得无菌松材线虫
在南京伊刘苗圃感病枯死的黑松木段上采用贝曼漏斗法分离出野生松材线虫 ∀将得到的松材线虫用
v h过氧化氢处理 ts °¬±o再用 s qx h硫酸链霉素和 s qx h硫酸庆大霉素各处理 u «o每次处理后均用灭菌水冲
洗 v次 ∀处理后的松材线虫接至黑松愈伤组织上 o取部分松材线虫接到牛肉汤蛋白胨k‘…l琼脂平板上培
养 o以检验其是否为无菌松材线虫 ∀检验确认后 o每隔 tx §o用黑松愈伤组织进行继代培养 ∀
113 获得黑松愈伤组织细胞
采用 tΠu≥为基本培养基 o附加 ‘„„ s qx °ª#pt oŒ…„ s qt °ª#pt oŠ„v t qs °ª#pt ou ow p ⁄t qs °ª#pt o
‹ tss °ª#pt o蔗糖 vs ª#pt o用 t °²¯ 的 ‹≤¯ 和 t °²¯ 的 ‘¤’‹调节 ³‹值为 x q{y o分装于 tss °三角瓶中 o
于 tut ε !t1t ®ª#¦°pu灭菌 tx °¬±o得到黑松细胞振荡培养用的液体培养基k张海兰等 oussul ∀
挑选生长松散的黑松愈伤组织块 o在无菌操作室中机械粉碎 o接入 xs °液体培养基中 o置于 uy ε 恒温
振荡器ktu{ µ#°¬±ptl上培养 t §o静置 o待细胞沉淀后 o移去上清液 o得到黑松单细胞及小的细胞团 ∀
114 荧光素的配制
将 s qx ª双醋酸盐荧光素 ƒ⁄„k©¯∏²µ¨¶¦¨¬± §¬¤¦¨·¤·¨lk美国 ≥ŒŠ„公司l溶于 xs °丙酮中 o制成 ƒ⁄„母
液 o置于 w ε 冰箱中保存 ∀
115 荧光假单胞菌菌株 ΓχΜ5 − 1Α液体培养的无细胞滤液
将在 w ε 冰箱中保存的 Š¦x p t„菌株在无菌操作室中用接种环取一环k直径为 s1u °°l o接入 ‘…液
体培养基 xs °中 o置于 vs ε 恒温振荡器ktu{ µ#°¬±ptl上培养 u §进行菌种活化 ∀活化后 o将 Š¦x p t„菌
株接入 ‘…液体培养基中 o每 xs °‘…液体培养基中接入 t °活化菌株 o置于 vs ε 恒温振荡器ktu{ µ#
°¬±ptl上培养 z §∀之后 o每天取培养液离心 ts °¬±kw sssµ#°¬±ptl o取上清液用 s quu Λ°微孔滤膜过滤 o得到
细菌的液体培养的无细胞滤液 o置于 w ε 冰箱中保存 o备测 ∀
116 ΓχΜ5 − 1Α液体培养的无细胞滤液的透析
将 ⁄ p vy透析膜先用 xs h乙醇慢慢煮沸 t «o再分别用 xs h乙醇 os qst °²¯#pt碳酸氢钠溶液 os qsst
°²¯#pt∞⁄ׄ溶液依次洗涤 o最后用蒸馏水浸洗 v次 o以除去透析膜中对蛋白质和其他生物活性物质有害的
微量硫化物 !重金属和一些具有紫外吸收的杂质 ∀将处理好的透析膜置于 w ε 冰箱中保存 ∀
将 Š¦x p t„液体培养 w §后的无细胞滤液 ws °装入处理过的 ⁄ p vy透析膜中 o两端封住 o置于一
yz 林 业 科 学 wu卷
盛有约 uss °蒸馏水的烧杯中透析 u §o每 { «换一次蒸馏水 ∀收集透析膜外的蒸馏水约 t uss °∀透析后
测定透析膜内液体培养的无细胞滤液的体积 o将收集的透析膜外的蒸馏水用旋转蒸发器在 zs ε 减压浓缩至
与透析膜内滤液等体积 ∀
117 无细胞滤液的荧光染色显微生测
将荧光染色显微生测方法kŽ¤º¤¶∏ ετ αλqot||{l进行了改进 o即 }将待测的液体培养的无细胞滤液分别与
黑松细胞按 wΒt混和 o黑松细胞的浓度约为 y ≅ tsx 个#°∀置于 w ε 冰箱中 w §后 o镜检 o统计黑松细胞的存
活率 ∀镜检时 o取混和液少许 o滴到载玻片上 o再滴加用蒸馏水稀释 xs倍的 ƒ⁄„母液 o盖上盖玻片 o静置 x
°¬±后移至万能研究用显微镜k’¯ ¼°³∏¶…‹ p ul下 o随机挑选 w个视野 o分别在暗视野和明视野下统计活细胞
数和细胞总数 o计算各视野下黑松细胞的存活率k用 ≥°≥≥软件统计分析 o下同l ∀以 ‘…液体培养基为对照 ∀
将 ws °‘…液体培养基用灭菌水稀释至与透析后透析膜内的液体培养的无细胞滤液等体积 o以此为对
照 o把 Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液透析后的膜内组分和膜外组分以及对照分别与黑松细胞按 wΒt混
和 o置于 w ε 冰箱中 w §o用上述方法测定毒性 ∀
t q对照 ≤Ž u qŠ¦x p t„ v q膜内组分 ≤²°³²±¨ ±·¶
¬±¶¬§¨ w q膜外组分 ≤²°³²±¨ ±·¶²∏·¶¬§¨
图 u Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液
透析后膜内外组分的毒性测定
ƒ¬ªqu ײ¬¬¦¬·¼ ²©·«¨ §¬¤¯¼·¬¦¦²°³²±¨ ±·¶º¬·«¬±
¤±§²∏·¶¬§¨ ·«¨ ° °¨¥µ¤±¨ ²©·«¨ ¦¨¯¯ ©µ¨¨
©¬¯·µ¤·¨ ²© Š¦x p t„ ¦∏¯·∏µ¨
图 t Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液毒性随
培养天数的变化
ƒ¬ªqt ≤«¤±ª¨¶²©·«¨ ·²¬¬¦¬·¼ ²©·«¨ ¦¨¯¯ ©µ¨¨©¬¯·µ¤·¨ ²©
Š¦x p t„ ¦∏¯·∏µ¨ º¬·«¦∏¯·∏µ¬±ª§¤¼¶
u 结果与分析
211 无细胞滤液毒性随培养天数的变化
萤光假单胞菌菌株 Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液毒
性随培养天数的变化如图 t所示 ∀从结果可见 o当 Š¦x p t„
培养仅 t §时 o其液体培养的无细胞滤液与对照之间 τ检验
显示其差异显著 o可见 Š¦x p t„在 ‘…液体培养基中的产毒
很快并且产毒能力很强 ∀随着培养时间的增长 oŠ¦x p t„
液体培养的无细胞滤液的毒性逐渐增强 o当培养 w §时 o其毒
性进入相对稳定期 o再继续延长培养时间 o其毒性仅有小幅度
的升高 ∀据此 o在进行荧光假单胞菌菌株 Š¦x p t„ 细菌毒
素的分离鉴定工作中 o可将 w §作为 Š¦x p t„菌株的培养时
间 ∀
212 无细胞滤液透析及透析后各组分的毒性测定
对 Š¦x p t„菌株液体培养了 w §的培养基无细胞滤液
及其透析后各组分的毒性测定结果见图 u ∀经 τ检验 oŠ¦x
p t„液体培养的无细胞滤液的毒性与对照之间 oŠ¦x p t„
液体培养的无细胞滤液透析后其膜内和膜外组分毒性与对照
之间毒性差异均极显著 o但 Š¦x p t„液体培养的无细胞滤
液透析后其膜内组分和膜外组分之间的毒性 τ检验结果不显
著 o说明 Š¦x p t„液体培养的无细胞滤液在透析膜内 !膜外
组分均有毒性 o但都比未经透析的 Š¦x p t„液体培养的无
细胞滤液的毒性低 ∀该结果表明 }Š¦x p t„ 细菌毒素不是
单一化合物 o可能由比较多的物质组成 o其中含有相对分子质
量大于 { sss的大分子物质k膜内组分l o如蛋白质 !多肽 !酶
等 ~也有小分子有机化合物k膜外组分l ∀
v 结论与讨论
在对松材线虫携带的细菌所产生的致萎毒素的研究中 o
建立一种灵敏 !高效的生测方法是一个关键 ∀笔者所建立的细胞荧光染色显微生测法能真实地反映松材线
虫携带的细菌所产生的毒素对寄主的致病作用 o显示出了很高的灵敏度 ∀细菌液体培养的无细胞滤液与黑
松细胞的培养液按 wΒt的比例混和 o既保证了细菌液体培养的无细胞滤液不被过于稀释 o能够很好的作用于
黑松细胞 o又使得每次试验仅需很少量的细菌液体培养的无细胞滤液 o约为 u1w °o方法简单 o结果稳定 o为
今后在松材线虫携带的细菌的致萎毒素的分离 !鉴定工作打下了基础 ∀
根据本试验结果 o随 Š¦x p t„培养天数的增多 oŠ¦x p t„液体培养的无细胞滤液对黑松细胞的毒性
zz 第 t期 赵博光等 }松材线虫携带的一株荧光假单胞细菌致萎毒素的初步分离
逐渐增强 o当培养 w §时 o其液体培养的无细胞滤液的毒性的升高已进入相对稳定期 o因此可将培养 w §作为
假单胞菌 Š¦x p t„产毒的最佳培养时间 ∀试验中采用 ⁄ p vy透析膜 o可透过的相对分子质量为 { sss ∀
试验结果显示 oŠ¦x p t„液体培养的无细胞滤液透析后其膜内和膜外组分均有毒性 o据此可推测 oŠ¦x p
t„细菌毒素并不是单一化合物 o而且有可能由比较多的物质组成 o其中含有相对分子质量大于 { sss的大分
子物质 o如蛋白质 !多肽 !酶等 ~也有小分子有机化合物 ∀本结果同时表明 o松材线虫携带的致病细菌是导致
寄主萎蔫的毒素的来源 ∀
接种试验已经证明松材线虫携带的致病细菌在寄主体内可以产生毒素k«¤² ετ αλqoussv ~Ž¤º¤½∏ ετ
αλqot||{ ~«¤±ª ετ αλqot||zl ∀本试验的结果证明松材线虫携带的致病的荧光假单胞细菌在寄主体外也可
以产毒 o其产毒数量随培养时间的增加可分为上升阶段和相对稳定阶段 ∀结合有关无菌松材线虫体外培养
不能产毒k曹越等 ot||yl及接种后不能诱导萎蔫症状k«¤² ετ αλqoussv ~Ž¤º¤¶∏ ετ αλqot||zl的报道 o说明了
松材线虫携带的致病细菌才是产生萎蔫病状毒素的来源 ∀
通过组织培养结合毒素诱变筛选抗病突变体是抗病育种的一条新途径 ∀在松材线虫寄主树种的愈伤组
织或细胞的培养液中加入不同浓度的毒素作为选择压力 o选择对松材线虫病具有明显抗性的后代 o并可进一
步与育种工作结合 o就有可能培育成抗性品系 ∀
Š¦x p t„细菌毒素的分离工作可分两方面进行 }以生测跟踪 o对小分子及大分子组分进行致萎毒素的
分离鉴定 ∀松材线虫所带致病菌产生毒素的分离 !鉴定将为阐明松材线虫病的分子致病机理奠定基础 ∀
参 考 文 献
曹 越 o韩正敏 o李传道 qusst q松材线虫病感病松树中致萎毒性物质的研究 q林业科学 ovzkwl }zx p z|
曹 越 o沈伯葵 qt||y q人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究 q南京林业大学学报 }自然科学版 ouskwl }tv p ty
谢立群 o赵博光 o巨云为 o等 qussu q松材线虫携带细菌的光镜观察与数量测定 q浙江林学院学报 ot|kwl }vwy p vw|
谢立群 o巨云为 o赵博光 qussw q松材线虫病程中树体内线虫和细菌种群数量的动态变化 q林业科学 owskwl }tuw p tu|
严东辉 o杨宝君 qt||z q松材线虫体外酶组成分析 q林业科学研究 ots kvl }uyx p uy|
赵博光 o郭道森 o高 蓉 qusss q松材线虫携带细菌部位的电镜观察 q南京林业大学学报 ouw kwl }y| p zt
赵博光 o郭道森 qussw q松材线虫携带的一株细菌的分离及其致病性 q北京林业大学学报 ouyktl }x| p yv
张海兰 o林晓佳 o赵博光 qussu q激素对黑松愈伤组织褐变和增殖的作用 q山东农业大学学报 }自然科学版 ovvkwl }wtv p wtz
…²¯ ¤¯ • o≥«¤«¨ ±¨ ƒ o •¬±·¨µ• qt|{u q°«¼·²·²¬¬± ³µ²§∏¦¨§¬± Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσp¬±©¨¦·¨§ ΠινυσσψλϖεστρισΠΠ„³³¯ ¥¨¼ ∞o ¤¯ ®¨ • … q°µ²¦¨ §¨¬±ª¶²©·«¨
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Ž¤º¤½∏ŽoŽ¤±±¨ ®² ‘qt||z q„¶¨³·¬¶¬¶²©·«¨ ³¬±¨ º²²§±¨ °¤·²§¨ ¬¶²¯¤¨ ’Ž⁄p v ¦¤∏¶¨¶¬··² ²¯¶¨ ¬·¶³¤·«²ª¨ ±¬¦¬·«q¤³¤±¨ ¶¨ ²∏µ±¤¯ ²© ‘¨ °¤·²¯²ª¼ ouzkul }
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k责任编辑 朱乾坤l
{z 林 业 科 学 wu卷