全 文 ：双向电泳应注意的几个关键问题
王凤茹1, 2
( 1中国科学院植物研究所 发育中心,北京 100093; 2河北农业大学生命学院,保定 071001)
摘 要: 着重介绍双向电泳的关键技术, 如样品的提取, 电泳条件的选择及双向电泳中应注意的关键问题
等,为蛋白组学工作者提供可以借鉴的方法和经验。
关键词: 蛋白组 双向电泳 固相 pH 梯度等电聚焦 SDS-PAGE
Several Key Problems on Two-dimensional Electrophoresis
Wang Feng ru1, 2
( 1 Inst itut e of Botany , T he Chinese Academy of S ci enses , B ei j ing 100093;
2 Ag ri cul tural Univ er sit y of H eB ei , B aod ing 071001)
Abstract: Combining the autho r s w orking experiences, w e int roduce here sever al key techniques on the two-
dimensional electrophor esis, such as the ex tr act ion of sample; the choices o f the condit ion of two-dimensional elec-
tr ophoresis and what should be pay attent ion to. We hope to pr ovide some methodo lo gies for those w ho do research
in pr oteomes.
Key words: Proteome T wo-dimensional electropho resis IPG SDS-PAGE
基因是遗传信息的携带者, 蛋白质则是生命活
动的执行者。实际上每一种生命运动形式, 都是特
定蛋白质群体在不同时间和空间出现并发挥功能的
结果。因此蛋白质组研究是我们理解细胞功能和疾
病发生发展过程的中心环节。如果不能共同致力于
蛋白质组的研究,那么基因组的研究成果将无法兑
现。DNA 序列所提供的信息仅仅是一种静止的资
源,而细胞的生命活动是通过各种蛋白质来实现的
一种动态过程。一个机体内所有不同的细胞都共享
同一基因组,然而同一个机体的不同细胞和不同组
织却有不同的蛋白质组, 而且机体在不同发育阶段,
直至最后消亡的全过程中蛋白质组也在不断交化。
因此,蛋白质组要比基因组复杂得多。所以, 利用基
因组的研究成果进行大规模的蛋白质组研究已经成
为必然[ 1~ 3]。
广泛存在基因组中的冗余性是限制遗传手段功
能基因研究的巨大障碍。而蛋白组学作为一个技术
手段,不受冗余性限制, 这是功能基因研究的有力
手段。
蛋白质组研究需要有足够的技术支撑, 如双向
凝胶电泳技术,质谱分析( M S) ,酵母双杂交系统,蛋
白质微阵列技术以及能够进行大规模数据处理的计
算机系统和软件等。现阶段蛋白质组的研究可分为
3个主要步骤: 应用双向凝胶电泳、双向高效柱层
析分离蛋白质; 应用氨基或组成分析、C-或 N-末端
氨基或序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质;
应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、
对比和分析[ 2, 4] 。
双向电泳技术是蛋白组学的基本技术, 双向电
泳的成功与否直接关系到后续操作。实际工作中蛋
白质的提取及双向电泳中的一些关键技术常常成为
得到好的电泳图谱的制约因素, 导致较长时间的重
复操作,耗费大量的人力、物力和财力。笔者在双向
电泳方面积累了一些工作经验, 现整理如下, 仅供
参考。
1 样品中蛋白的提取
1. 1 提取液
蛋白质的提取是双向电泳好坏的最关键的因
收稿日期: 2005-05-18
作者简介:王凤茹,女,研究生
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
素。只有好的样品才可能跑出好的电泳图谱。无论
采用何种方法提取何种性质的蛋白, 千万不要忘记
在所提取缓冲液中加入适当浓度的蛋白酶抑制剂
(如 EGTA, PMSF 等) , 否则不但部分蛋白会丢失,
而且很可能在处理和对照的电泳图谱上造成假的差
异点,从而导致严重的错误结果。
1. 2 转移
在样品研磨后要转移到离心管中, 这也是蛋白
丢失的一个关键步骤, 因为样品的研磨一般采用液
氮进行,而在转移过程中样品往往会部分粘在管口
而不能完全转移到离心管内, 笔者的经验是在转移
前, 先把离心管和转移样品的用具在液氮中冷冻一
下, 就能使样品非常容易的转移进入离心管而不会
粘在管口、管壁和转移所用用具上。
1. 3 蛋白样品的离子洗涤
样品中的离子浓度过高会造成双向电泳的第一
向等电聚焦电泳不能很好的聚焦,影响分离效果(如
图 1)。所以一般用丙酮来沉淀蛋白清洗离子,清洗
时,丙酮中一般要加 0. 3%的 DT T 来尽量消除丙酮
可能造成的蛋白的甲基化, 而且清洗要彻底, 一般 3
次以上。
图 1 第一向聚焦不完全跑出的电泳图谱
1. 4 样品的溶解
溶解的目标: ( 1)完全破坏样品中非共价结合的
蛋白质复合物和聚积体, 从而形成各个多肽的溶解
液(否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使 2-DE
中出现新的蛋白点, 相应的表示单个多肽的点的强
度会下降) ; ( 2)溶解方法必须去除可能干扰 2-DE 分
离的盐、脂类、多糖和核酸等物质; ( 3)溶解方法要保
证样品在电泳过程中保持溶解状态。变性剂可通过
改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏
水中心完全暴露, 降低接近疏水残基的能量域。其
典型代表是尿素和硫脲。
表面活性剂经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏
水基团后, 还常需要至少一种表面活性剂来溶解疏
水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂 SDS、非
离子去污剂 Triton X-100 和 NP-40、两性离子去污
剂 CHAPS、OBG 等。其中 CHAPS 和 SB3-10 最
好。
在变性剂和表面活性剂联用条件下, 加用还原
剂可使已变性的蛋白质展开更完全, 溶解更彻底。
常用含自由巯基的 DT T 或 b-巯基乙醇,以及不带电
荷的三丁基膦( TBP)进行还原。
推荐使用的蛋白溶解液是: 7M 尿素, 2M 硫脲,
2%CHAPS, 1%DTT 和 2%两性电解质。
1. 5 样品的存放
蛋白质溶解后, 可于-20 保存, 一定注意不能
反复冻溶,否则会造成蛋白的降解。
2 第一向电泳等电聚焦电泳
聚焦步骤可根据不同的样品选择, 一般采用所
选 IPG干胶条的说明再结合实验进行选择。对于聚
焦时间,理论上讲,要获得最好的图谱质量和重复性
所需最佳时间是 IEF 分离达到稳定态所需的时间。
聚焦时间太短, 会导致水平和垂直条纹的出现。过
度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移, 但会因为
活性水转运而导致过多水在 IPG胶表面渗出(电渗)
而造成蛋白图谱变性, 在胶条碱性端产生水平条纹
以及蛋白丢失(图 2, 3)。
图 2 电内渗
632005年第 6期 王凤茹:双向电泳应注意的几个关键问题
3 平衡
一维结束后可马上进行二维电泳, 也可保存在
两片塑料膜间于-80 保存数月。但在二维电泳前
一定要进行胶条的平衡, 以便于被分离的蛋白质与
SDS完整结合,从而在 SDS-PAGE 上电泳能顺利进
行。一般进行两次平衡, 先用 DTT 平衡, 再用碘代
乙酰胺进行二次平衡取消 DTT 的影响。
图 3 碱性端水平条纹
4 第二向电泳: SDS-PAGE
4. 1 胶面要平
进行 SDS-PAGE 时, 使用预制胶方便、快捷且
重复性好。但由于价格昂贵, 现在大部分实验室还
是自己灌胶, 如果方法掌握得好是能得到很好效果
的。但必须指出的是, 灌制胶时,胶面一定要平, 否
则第一向的胶条不能很好的和胶面接触, 影响电泳
效果。所以放置灌胶模具的桌面一定要平。
4. 2 胶条底部不能有气泡
把第一向的胶条放置在第二向的胶面上后, 一
定要保证两胶之间不能有气泡, 否则有气泡部分的
蛋白不能很好的分离。解决气泡的方法是可以把剪
成尖角的滤纸慢慢赶走, 但注意不要损伤胶条,以避
免胶上蛋白的丢失。
4. 3 密封
密封液的用途是把胶条和第二向的胶很好的结
合起来,而且密封液中的溴酚蓝在电泳中起指示作
用。但密封液不能加的太多, 以刚刚盖过胶条为佳。
5 染色
染色液最好过滤一下,去掉未溶解的染料,否则
会造成染色不均匀, 影响图谱的效果(图 4,图 5)。
图 4 染色不均匀的图谱
图 5 染色较好的图谱
综上所述, 当我们在实际操作过程中遇到电泳
图谱不理想时, 可以留意一下操作过程中是否注意
了上述关键问题,以便加以改进获得理想的结果。
参 考 文 献
1 FQ Yang, Y Ito. J Liq Ch rom a Rel Tech, 2004, 27: 2979.
2 H uang F, H edman E, et al. M ol Cell Proteomics , 2004, 3: 586.
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64 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期