全 文 ：2 田 5年 9 月第2 8卷第3 期
阮 p.( 2 】) 5, V o l . 28 , No . 3
成都中医药大学学报
oJ unr al of C h
e n g d
u 漏~ i yt of 冗M
青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响
高永翔 龚立 田艳勋 杨 雪 汤 洪萍
(成都中医药大学 , 四川 成都 61 田 75 )
摘 要 : 目的 研究青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞 ( ds n idr it 。 。el D )C 免疫功能的影响 。 方法 小 鼠骨
髓细胞用 GM 一 CS F 培养 7 d ,再加入不 同浓度青藤碱培养 12 h 。 流式细胞仪检测 细胞表达 H LA 一 DR 的能
力 , E L IS A 检测细胞产生的细胞 因子 ,混合淋巴细胞培养检测细胞提呈杭原的能力 。 结果 青藤碱刺激后的
DC 细胞表达 H LA 一 DR 、 产生细胞因子和刺激 同种同基 因 T 细胞增殖的能力显著低于正常 DC 细胞 。 结论
青藤碱可抑制 p C 的发育成熟和免疚应答功能 。
关 键 词 : 青藤碱 ;树突状细胞 ;免疫应答
中图分类号 : 2R 85 . ;5 3R 92 . 32 文献标识码 : A 文 章 编 号 : 1以科一06 6 8( 20 5) 0 3 一0 13一03
E fe
c st o n S i n o m e ul n e o n t h e Im m u n o l o g i e F u n c t i o n o f
M u r i n e B o n e M a
r r o w 一 D e r i V e d D e n d r i t i e C e l l S
GA O oY gn
一 x 勿gn , G口N G 互 , 刀风N aY n 一 xu n , et al
( Ch
e n目 u U n i v e sr i t y of T r出 li it on al Chi n e se M司 i e i n e , S i e hu an , 6 1X() 7 5 , C卜i n a )
A加如 c t : 0 讨ce it ve : OT s tu d y ht e e fe e t o f s in o m e n i n e s t im u l a ti o n ot ht e im u n ol o ig e fnU e t io n o f mu ir n e 比 n e
~
w 一 d e ir v e d d e n面 it e e e l ls ( B M DC s ) . Me ht ods : BM DC s w e re e u l tu re d in MG 一 C S F ofr 7 d叮 5 an d i n GM 一 C S F
iw ht
s i
onm
e n i n e o f d i fe re
n t e o n e e n tar t ion s of r an o ht e r 12 ho u rs
.
ExP 珑 s s io n of s u arf e e om lce u l e s HL A 一 DR aws m
e as u dre
场 n o 、 v e yt ome tw
.
C yt o k in e s re l e as de 勿 B M D Cs w e re d e te e tde 场 EL IS A a n 习 y . hT e an ti罗 n p o se n t in g 场 B M D C s w as
e v al u a t de b y Iin x e d l” l phocs t e re s pe n s e s
.
R es u l ts : B M DC s e u l ture d i
n ht e p re s e n e e o f s in oln
e n i n e xen re s
e d low l
e v e l s o f
HLA
一 DR 、 TN下 一 a an d IL 一 12 an d e xh ib i t de w e a k a e t iv i ty i n s timu l a ti n g ht e Por li fe ar tion o f a l o罗n i e T e e ll s
.
C o耐心on : s in omen i
n e e x e rt s a n e ga it
v e e
fe
e t o n ht e rn a tu ar it o n an d ~
u on l o ig e fun
e t ion s o f DC
.
K e y ow 心 : S ionm e n i n e ; d e n dir ti e e e l s : imln u n e re s p o n s e
树突状细胞 ( D )C 是一种数量少但分布广泛并
可迁移的抗原递呈细胞 ( AP C ) , 来源于 CD、 十骨髓干
细胞 ,是 目前已知功能最强的专职 AP C 。 DC 可调节
各种效应细胞的功能并在调控免疫应答中起核心作
用 ,最大的特点是捕获外来抗原 ,并迁移至引流淋巴
结发育成熟并递呈抗原 , 启动和诱导 T 细胞分化产
生免疫反应或直接激活 B 细胞及产生免疫记忆 。
青藤碱 ( s in ~ in n e )为青风藤的主要有效成分
,
具有抗炎 、免疫抑制 、镇痛 、降血压 、 抗心律失常等药
理作用 ,临床使用青藤碱治疗类风湿性关节炎等各
种风湿自身免疫疾病取得较好疗效。 但不清楚青藤
碱是否通过 D C 而发挥药理作用 。 本实验将研究青
藤碱对 DC 表面白细胞抗原 一 D (R H LA 一 D )R 表达水
平和细胞因子产生及 DC 免疫功能的影响 ,并进一
步探讨该影响在青藤碱调节机体免疫状态中的可能
作用 。
1 材料和方法
1
.
1 主要试剂
溯GM 一 CSF 和 m l l L 一 4 均购自 eP p or’ 几 c h E C 公
司 ; pR M x 一 l麟。 购自 e i cb 。 公司 ; 。 t an ti 一 mo u s e H LA
一 D R 单克隆抗体 ( M c -bA )和异硫氰酸荧光素 ( F Tr C )
为 iS 乡1班公司产品 ;小 鼠 NT F 一 。 和 IL 一 12 EH s A 检
测试剂盒购自深圳晶美生物技术公司 ; 3 H 胸腺嗜咤
脱氧核昔 ( 3H dT R )为中国科学院上海核技术开发
基金项目 : 四川省科学技术厅科研基金应用基础研究项 目 (编号 : 05j 迎 9 一07 今 l)作者简介 : 高永翔 , 男 , 1965 年 10 月生 ; 医学博士 , 副教授 ;研究方向 : 中医药与免疫 。
DOI : 10. 13593 /j . cnki . 51 -1501 /r . 2005. 03. 004
成都中医药大学学报 2X (J5年第 28卷
公司产品 。
1
.
2实验动物
A / B LB。 小 鼠 , 含 , 6 一 8周龄 , 20 一 2 2 9 , 由成都中
医药大学动物实验中心提供 。
1
.
3 骨髓 D C ( B MD C )的分 离与纯化
颈椎脱位法处死小 鼠 , 放人 75 % 酒精浸泡 10
而 n ,在超净工作台下无菌取小鼠后肢股骨 、胫骨 ,利
用 P Bs 液 ( p H = 7 . 2) l mL 注射器冲洗出骨髓细胞 ,
用 irT 一N氏CL 溶去红 细胞后 , BP S 洗 2 次 , 用含
m 1GM 一 e s F ( 15 n g/ mL )
、 助几 一 4 ( 1 gn/ mL )的完全培养基重悬至 1 . 0 x l护个 / mL ,铺于 24 孔培养板上 , 1
l证J 孔 , 于 37 ℃ , 5% c仇 培养箱中培养 。 第 3 d 轻轻
晃动培养板 ,吸弃全部上清 , 去除 T 、 B 和粒细胞 ,及
时补人含细胞因子浓度相 同的完全培养基 , 第 6 d
轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体 , 置于培
养瓶中并加人等量的上述完全培养基 ,继续培养 24
h
。
1
.
4 给药与培养
收集上述 B MD C 细胞 ,用 P BS 洗涤后加人上述
完全培养基 ,调整细胞浓度为 1 x l护个 / mL 进行分
组实验 。 根据加人的药物浓度不同共分四组 ,分别
为空白对照组和青藤碱 1 拜盯L 、 10 尸酬 L 、 20 拌群 L 浓
度组 , 铺于 24 孔培养板上 , 1 11 11 / 孑L, 于 37 ℃ , 5%
c仇 培养箱中培养 12 h 。
1
.
5 DC表面 H LA 一 DR 表达水平的检测
调整 BM DC 浓度为 1 x l护个 / mL , 每个小离心
管中加 50 “ L 细胞悬液 , 按间接免疫荧光法 ,加人 1
拼L F ITC标记的抗 HLA 一 DR ,置 4℃ 45 而 n 。 用 PBS
洗涤 2 次 ,通过 FCM 检测 DC 表面 H LA 一 DR 表达水
平 ,表达为荧光值 ( VO )F 。
1
.
6 DC 产生细胞因子的检测
收集培养至 s d 的各组 BMD C ,按 2 x l护个 /孔
加到% 孔板中 , 按各组原条件加人青藤碱 , 然后加
完全培养基至总体积 20 拜口孔 , 37 ℃ , 5% C仇 ,继
续培养 48 h 。 收集上清 , 用 EIJ S A 试剂盒检测细胞
因子 T N F 一 a 和 IL 一 12 含量 。
1
.
7 混合淋巴细胞反应 ( M比 )试验
取 B ABL / C 小鼠脾脏细胞作为反应细胞 , irT 。 -
N场 lC 破除红细胞后 ,用含 or % FCS 的 RP MI 164 0
培养基悬浮细胞至 2 x l护个 / mL , 置 37 ℃ , 5% C仇
孵箱中 4 h 。 以 10 “口孔加人 % 孔板 。 收集各组
加药后培养 12 h 的 B M D C , 以 30 仰 下射线灭活后分
别加入各孔中 , 总体积 20 拼L ,每组设 3个复孔 。 继
续培养 4 8 h , 于最后 1 s h 加人 3H 一 侧R , 3 7 kB q
( 1“ iC ) /孔 。 收集细胞 ,液闪计数仪检测 cP m 值 , 结
果以 3孔平均值表示 。
2 实验结果
2
.
1 对 DC 表面 H LA 一 DR 表达水平的影响
经青藤碱刺激后 DC 表面 HLA 一 DR 表达水平
明显下降 。 见表 1
表 1 小鼠骨髓树突状细胞 H LA 一 D R 表达水平 与青藤
碱浓度的关系 ( n 二 10)
青藤碱浓度 (解 )L H l人 一 D份vo F
0 15
.
4 土 1 . 2
1 12
.
9 土 1 . 3
10 10
.
9 士 1 . 0 .
20 8
.
8 士 0 . 5 趁 .
与时照组比较 , , 尸 < 0 . 05 , * * 尸 < 0 . 01
2
.
2 对 D C 产生细胞 因子的影响
经青藤碱刺激后 D C 分泌 NT F 一 a 和 IL 一 12 均
有不同程度的下降 。 见表 2
表 2 不同浓度青藤碱对小鼠骨妞树突状细胞 因子产生 的影 响
《n 二 一0 )
青藤碱浓度(拌岁L ) ,州F 一 。 (可网止 ) IL 一 12 ( p岁阴1 11 )
0 335
.
37 士 19 .卯 4 34 . 3 9 士 16 . 8 9
1 28 3
.
45 土 2()
.
34 3 8 l
.
3 5 土 2 1 . 4 9
10 189 52 士 17 . 63 书 298
.
72
士 2()
.
7
怪
20 1 19
.
25 土 14
.
39
’ .
2 19
.
63 土 16
.的 .
与对照组比较 , ` p < 0 . 05 , “ p < 0 . 0 1
2
.
3 对 DC 杭原提呈功能的影响
经青藤碱刺激后 DC 对同种混合淋巴细胞的增
殖作用下降 ,反映其抗原提呈功能降低 。 见表 3
表 3 不同浓度青藤碱对小鼠骨髓树突状细胞提呈抗
原能力的影响 ( n 二 10 )
青藤碱浓度。娜 )L 细胞抗原提呈能力 (。 pm )
0 14 558 士 9
116 16 土 126
10 946 8 士 14 2
诀
20 6 7 1士 9 8 价 .
与对照组比较 , 釜 p < 0 . 05 , 芳 苦 p < 0 . 0 1
3 讨论
本实验结果显示 , 青藤碱能抑制 D C 表面 H LA
一 DR 的表达 ,并且抑制 DC 的免疫功能 。
D C因其独特的抗原提呈及免疫调节功能在维
持机体正常免疫功能中起关键作用 。 DC 免疫调节
作用主要表现在下列两方面 : 通过与 T 和 B 淋 巴细
胞间的直接接触及其分泌的多种细胞因子传递免疫
信息 , 摄活 T 和 B 淋巴细胞 , 从而启动高效而特异
(下 转第 23 页 )
第 3 期 刘晓燕等 保肝宁对实验性肝纤维化大鼠肝内核转录因子 沼表达的影响
的抑制作用正是保肝宁驱邪外达的表现 。 综合以上
结果我们可以得出以下结论 :与秋水仙碱相 比 , 中药
复方保肝宁具有更好的抑制 NF 一 沼 的表达 ,而通
过抑制肝脏细胞内 NF 一 沼 的表达 , 进而减少炎症
的发生是其抗纤维化的重要机理之一 。
参与肝纤维化的转录因子及其在肝纤维化过程
中的作用是复杂的 ,并且各种转录因子间之间还存
在交互作用 ,形成复杂的信号网络系统 ,参与了肝纤
维化过程中各种相关基因的表达 。 核转录因子活性
的变化除了决定于 自身组成的变化外 , 主要还受到
细胞对各种刺激的反应的调节 , 通过对细胞内异常
核转录因子水平和活性进行人为干预 , 将有可能为
抗肝纤维化的治疗提供一条有益的思路 。 深人研究
中药复方保肝宁对各转录因子的作用 , 在更深层次
上研究其抗纤维化的分子机制 ,必将推动中医药抗
纤维化的研究进程 。
参考文献
1 赵进军 , 吕志平 ,刘永刚 ,等 .保肝宁对过氧化氢损伤大鼠
肝细胞的保护作用【J] . 广州中医药大学学报 , 2以卫 , 19
( 3 )
:
2 11
一
2 13
2 张绪富 , 吕志平 ,周迎春 ,等 .保肝宁对 HCS 一 T 一 6 细胞增
殖及 工型胶原表达的【J] . 中医药学刊 , 2X(] 3 , 21 (2) : 2a7 -
2 08
3 柴三葆 ,彭 , 旭 ,许 松 ,等 . 高血压大鼠心脏和血管丝裂素
活化蛋白激酶与其磷酸酶【J ] . 高血压杂志 , 2X( X〕, 8 ( 4 ) :
34 3
一又 5
4 M ac Ph e sor
n
AM
,
A祀ha r D F , 玫 s il e s , 以 以 . 叨 l e e任兜 t of
et 0 I I嗯 e s目 on V EGF , 暇肋 g e n an (】 p or ges t e~ cer e tP or
~
u n 。氏场记 d vi yt an d e n d o ht e il al e e l n uz 记比 r in h
~e n ( Io n记 t ir um [ J ] . Hum 珑p耐 , l% , , 1 4 ( 12 ) : 308 0 一 308 7
s ve 毗 t d e n 一 U ll da , eD 一 Wd d e 一 C七rt , N o t e ha e rt 一 阮石e , et
以 . R e翻 a it on of hte tr a l贬犯 ir itP o 几以 a c t lvi ty of hte cnu laer acf ot r
一
akn
p a B两 s ub t而 t〔J] . iB oc l记m 一 Pl助an e o , 2仪刀 , 麟 ( 5
一 6 )
:
963 一 97 0
6 cS l
l w司祀 RF , 阮坛l al 〕I B , Kw oe n OY , 以 以
.
C I洲旧 ac ivt at es 召F
一
ka p aP B az 妇 c 一 jun N 一 et mr i l过 ik ~ 助d
e司翻 e es
e h emo 拓ne sec o d o n 。 n a e t iv a t司 hunar
阮叫 i。 st e l a t e Ce lS 〔J ]
.
J I n u n 山10 12X() l , 16 : 68 12 一 68 19
7 王文花 ,戴恩来 ,崔笑梅 ,等 .黄蔑注射液对肾炎大鼠肾皮
质细胞 NF 一 沼 表达影响的实验研究【J〕. 中国中西医结
合肾病杂志 , 20 1 , 2( 8) 二4 50 一 45 2
8 肖准 ,彭文珍 , 王正荣 . 丹参抑制牵张诱导的心肌细胞 NF
一 沼 激活的观察【J] . 华西药学杂 , 2X( 刀 , 15( 4) : 25 7 一 26 1
9 姜会庆 ,哈团柱 ,韦多 , 等 .丹参素对成纤维细胞生物学作
用机制的研究〔J] . 中华烧伤杂志 , 2X() 1 , 17( l ) : 36 一 38
(收稿 日期 : 2X() 5拱 一 19)
(上接第 13 页 )
的免疫反应 ;抑制 T 和 B 免疫细胞对自身抗原的识
别能力 ,从而避免机体产生自身免疫反应而导致自
我攻击 。 若 DC 免疫功能紊乱 ,则不能抑制 T 和 B
免疫细胞对自身抗原的识别能力 ,在机体某些隐蔽
抗原显露 ,或免疫细胞误认自身抗原为异体抗原时 ,
则 DC 可能启动强烈的抗 自身免疫反应 , 从而导致
自身免疫性疾病的发生 。 而 D C 具有的独特免疫学
功能取决于 DC 免疫状态 . 尤其是 DC 表面 HL A 等
免疫分子表达水平 。 DC 表面 HLA 分子表达低下或
缺失将导致 H LA 免疫功能低下 , 因此 H LA 表面 H l八
分子的正常表达对于维持 DC 正常的免疫功能至关
重要 。
最近的研究发现 ,青藤碱对于小鼠和类风湿关
节炎大鼠脾淋巴细胞的免疫功能有抑制作用 。 并且
青藤碱可抑制 IL 一 2 膜受体表达 , 增加 IL 一 6 的产
生 ,调节淋巴细胞产生细胞因子 。 细胞因子基因调
控研究发现青藤碱能通过下调人外周血单个核细胞
IL 一 1月、 IL 一 Sl l lRN A 表达 ,发挥对类风湿性关节炎的
治疗作用 。 但未见有关青藤碱与 D C免疫活性的相
关报道 。 本文结果显示青藤碱能抑制 DC 免疫功
能 ,提示青藤碱可能是通过抑制 DC 免疫活性而调
节机体免疫状态 ,从而产生治疗 自身免疫性疾病的
作用 。
参考文献
1 涂胜豪 ,胡永红 ,陆付耳 . 青藤碱对人淋巴细胞产生 IL -
2
,几 一 Z R 和 IL 一 6 的影响〔lJ . 中国实验临床免疫学杂
志 , 19 8 , 10 ( 5 ) : 268 一 27 0
2 刘 良 ,李晓娟 , 王培训 ,等 . 青藤碱对人外周血单个核细
胞 IL 一 l p和 IL 一 8 两细胞因子基因表达的影响〔J〕. 中国
免疫学杂志 , 2印2 , 18 ( 4 ) : 24 1 一 24
3 l r切山a K , 11司习 M , R o n 】alu N , et 以 . eC ne o it o of 」a z’g e n `价止吧巧
of de
n (州 it c c el s 加m 比ne
~
e d tr 刀℃ s uP nle me nt 记 iw ht
g 旧 n ul oc yt 了mac or ph卿 e o lon y 一 s t i m山 t i n g fac tor [ J〕
.
J xE p
M ed
,
19 2
,
17 6
:
169 3
一 1702
4 B an
c
he
r e a u J
,
tS ie
l l n l a 卫I
RM
,
De
n而 itc e e l s 出 ld th e co nt rol of
~ 画叭jJ
.
Nat 二 , 19 8 , 392 : 245 一 25 2
5 为 an y a KP , 陇邵l e 1 R , Os k ar CF , 以 己 . 公 tar c eU己ar is洲 -
er gul
a ted port ien ik ~
is多l a ling p a ht w a y neg iat
v街 er 邵 l la tes
het hne
n吹即 ic an d 丘m c iot nal 11扭n u习 。 on of 二 n oc yt e 一 de ivr 司
h
uman
ds
n面 it C 0 15 〔J ] . BI 仪目」, 2印 1 , 98 (7 ) : 2 1 75 一 2 182
(收稿 日期 : 2印 5一3一 14 )