全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００４
收稿日期：２０１５－０６－０１
作者简介：周生民 （１９８３—），男，山东济南人，工程师，研究方向：微生物酶技术，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｓｈｅｎｇｍｉｎ１２＠ １２６．ｃｏｍ
响应面法优化黑曲霉发酵产葡萄糖酸钙
周生民，冯文红，赵　 伟
（山东福洋生物科技有限公司，山东 德州 ２５３１００）
摘　 要：以车间生产葡萄糖酸钠为对象，优化发酵葡萄糖酸钙工艺，试验中采用三元二次回归正交试验，以葡萄糖
酸钙收率为指标，考察种子培养时间、ｐＨ、Ｃａ（ＯＨ） ２浓度对葡萄糖酸钙收率的影响。 通过 Ｍａｔｌａｂ 的最优化方法求
得最佳组合：种子培养时间 １７ ｈ、ｐＨ ５􀆰 ３、Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数 ２０％，在此条件下，最终优化结果为葡萄糖酸钙收
率 ８７􀆰 ３３％。
关键词：黑曲霉；葡萄糖酸钙；工艺优化
中图分类号：ＴＱ９２０􀆰 ６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－００１７－０５
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｗｉｔｈ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
ＺＨＯＵ Ｓｈｅｎｇｍｉｎ，ＦＥＮＧ Ｗｅｎｈｏｎｇ，ＺＨＡＯ Ｗｅｉ
（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｕｙａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｄｅｚｈｏｕ ２５３１００， Ｃｈｉｎａ ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｗｅ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ， ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ（ＯＨ） ２ ｏｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ ｂｙ ｔｅｍａｒｙ
ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｍａｔｌａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｗｅｒｅ： １７
ｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ， ｐＨ ａｔ ５􀆰 ３， ａｎｄ ２０％ Ｃａ（ＯＨ） ２， ｕｎｄｅｒ ｗｈｉｃｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ８７􀆰 ３３％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ；ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ； ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
　 　 葡萄糖酸钙能促进骨骼和牙齿的发育，维持神
经与肌肉的正常兴奋性，降低毛细血管通透性。 目
前，葡萄糖酸钙应用广泛，在工业化大生产中主要
采用金属催化法和发酵法［１］。 由于金属催化剂具
有一定毒性，其产品不能用作食品生产［２］。 发酵法
是多数厂家采用的方法，但由于受种子、生产条件
等因素影响，产率较低。 一般的优化方法多因实验
次数的局限而使得优化结果具有一定的主观性，且
产率偏低。 本实验中，笔者以车间葡萄糖酸钠发酵
为模型，采用响应面的优化分析软件对影响葡萄糖
酸钙收率的几个因素进行优化，提高葡萄糖酸钙的
产率。
葡萄糖酸盐的发酵法生产主要依据于黑曲霉
发酵产生的葡萄糖氧化酶作用于反应底物产生葡
萄糖酸，使得 ｐＨ 下降；此时添加碱液使发酵液 ｐＨ
维持在黑曲霉的最佳 ｐＨ，解除发酵抑制作用，添加
的碱液与发酵液中的葡萄糖酸生成相应的葡萄糖
酸盐 （如葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸锌
等） ［３ ４］。 因此，本实验以种龄、ｐＨ、Ｃａ（ＯＨ） ２浓度作
为优化指标进行优化。 从化学反应方程式（１）来
看，在合成途径中生成 １ 分子的 ＦＡＤＨ２，ＦＡＤＨ２在
呼吸链中以氧为受体被氧化。 在葡萄糖酸快速合
成的过程中，需要 Ｏ２ 的供给［５］。
Ｇｌｕｃｏｓｅ＋ＦＡＤ＋１ ／ ２Ｏ２ →Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ＋ＦＡＤＨ２ （１）
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与设备
菌种：黑曲霉，山东福洋生物科技有限公司
提供。
培养基：Ｃ６Ｈ１２Ｏ６ ２６ ｋｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５６ ｇ，ＣＯ（ＮＨ２）２
２􀆰 ８ ｇ，ＭｇＳＯ４ ５􀆰 ６ ｇ，消泡剂 ２ ｍＬ，ｐＨ ７􀆰 ６～７􀆰 ８，定量至
２６ ｋｇ。
设备：５０ Ｌ 发酵罐和过程参数检测与控制系
统，国家生化工程技术研究中心（上海）；尾气过程
质谱仪，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ｐＨ 和
溶氧电极，Ｍｅｔｔｌｉｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ 公司；ＨＰＬＣ，日本岛津
公司。
１􀆰 ２　 ５０ Ｌ发酵罐工艺流程
车间葡萄糖酸钠发酵缩小至 ５０ Ｌ发酵罐，工艺
如下：将保存在实验室的菌种斜面倒入无菌水重
悬，取 １ ｍＬ菌悬液接种于事先灭菌的三角瓶（含 ＬＢ
液体培养基），将接种后的三角瓶移入摇床，３７ ℃、
２２０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 １６ ｈ 左右。 将种子瓶接种 １０％左右
黑曲霉种子液至事先灭菌的 ５０ Ｌ 发酵罐中，３７ ℃、
ｐＨ ５􀆰 ５条件下进行发酵。 随着发酵的进行，产生的
葡萄糖酸使得 ｐＨ 下降。 设定发酵罐 ｐＨ 自控为
５􀆰 ５（即在 ｐＨ 小于 ５􀆰 ５ 时，蠕动泵会自动启动流加
碱泵回调 ｐＨ）。 因此在发酵过程中采用 ＮａＯＨ维持
黑曲霉正常产酸，同时与葡萄糖酸反应生成葡萄糖
酸钠。
１􀆰 ３　 发酵过程参数优化试验
以车间黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的工艺为
依据，利用黑曲霉发酵后期碱中和的方法 （用
Ｃａ（ＯＨ） ２代替 ＮａＯＨ）生产葡萄糖酸钙。 葡萄糖酸
钙的收率受多方面的影响，现就发酵过程中影响黑
曲霉发酵过程的几个参数进行优化控制。
种龄试验：种龄（种子培养时间）是决定黑曲霉
进入发酵罐适应期长短的决定性因素。 种龄短则
延滞期长，不利于缩短周期；种龄过长，超过黑曲霉
的生长期，则进入发酵罐后停止生长。 菌量偏低不
利于发酵，根据生产经验选择 １４􀆰 ５～１９􀆰 ５ ｈ。
ｐＨ试验： ｐＨ的合理设置直接影响到葡萄糖酸
钙的产量，ｐＨ过高会影响黑曲霉的发酵，降低酶活
性；ｐＨ过低则会有大部分产物以葡萄糖酸形式存
在，降低产率。 因此 ｐＨ 的设定需要考虑黑曲霉的
生长活性，本实验中的 ｐＨ 采用自动控制，选择范围
在 ５􀆰 ０～５􀆰 ６。
Ｃａ（ＯＨ） ２浓度试验：黑曲霉发酵产生葡萄糖
酸，ｐＨ会不断下降，选用 Ｃａ（ＯＨ） ２中和生产过程
中不断产生的葡萄糖酸，从而维持恒定的 ｐＨ。
Ｃａ（ＯＨ） ２浓度过高不能完全溶解，浓度过低则添
加量大，降低底物浓度，不利于发酵及后期浓缩提
取，因此选用质量分数在 １５％ ～ ２０％来调节 ｐＨ。
正常情况下，ｐＨ 会随着黑曲霉发酵而不断降低，
采用 ｐＨ自控后，自控系统与碱流加泵相连，即 ｐＨ
低于设定值时，泵会启动流加 Ｃａ（ＯＨ） ２使得 ｐＨ保
持在设定值。 但 Ｃａ（ＯＨ） ２浓度与 ｐＨ无直接关系，
只是与流加时流量相关，浓度稀则流加量大，反之
则小。
１􀆰 ４　 检测方法
采用 ＨＰＬＣ检测发酵液中葡萄糖酸钙含量 ρ，
葡萄糖酸钙收率计算见式（１）。
ｗ ＝ ρＶ ／ ｍ × １００％ （１）
式中：ｗ—葡萄糖酸钙收率（ｇ ／ ｇ），ρ—液相检测葡萄
糖酸钙的质量浓度 （ ｇ ／ ｍＬ），Ｖ—发酵液的总体积
（Ｌ），ｍ—投料葡萄糖质量（ｋｇ）。
１􀆰 ５　 优化方法
由于 ３ 个影响因素的变化具有连续性，采用一
般的三因素三水平正交试验分析点较少，最优组合
具有一定的主观性，因此采用三因素五水平进行正
交分析，同时采用曲面图展示产率曲线，可以将五
水平之外的可能值在曲线上呈现出来，经软件分析
计算得到曲线的最高点，使结果更加直观、准确。
本实验预在传统酸钠发酵条件的基础上选取
种龄［６］、ｐＨ［７－８］、Ｃａ（ＯＨ） ２浓度作为试验因素，种龄
ｘ１（ ｚ１）范围：１３􀆰 ５ ～ １９􀆰 ５ ｈ；ｐＨ ｘ２（ ｚ２）：５􀆰 ０ ～ ５􀆰 ８；
Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数 ｘ３（ ｚ３）：１５％～２０％。
２　 结果与讨论
以酸钙收率作为试验指标。 选用三元二次正
交设计试验方案，对三因素五水平设计无量纲线性
编码代换。
对表 ２ 中数据进行处理，求解回归方程各因子
系数，对因子系数和回归方程的显著性检验建立二
次回归模型，见式（３）。
Ｙ ＝ ａ ＋ ｂｘ１ ＋ ｂ２ｘ２ ＋ ｂ３ｘ３ ＋ ｂ１２ｘ１ｘ２ ＋ ｂ１３ｘ１ｘ３ ＋
ｂ２３ｘ２ｘ３ ＋ ｂ１１ｘ２１ ＋ ｂ２２ｘ２２ ＋ ｂ３３ｘ２３ ＝
－ ３􀆰 ９２ ＋ ０􀆰 ９２４ｘ１ ＋ １７０􀆰 ０９ｘ２ ＋ １􀆰 ２２６ｘ３ －
０􀆰 ３６８ｘ１ｘ２ ＋ ０􀆰 ００１ｘ１ｘ３ － １􀆰 ２１ｘ２ｘ３ －
０􀆰 ００９ｘ１ ２ － ２４８􀆰 ２３ｘ２ ２ － ０􀆰 ０１ｘ３ ２ （３）
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
　 　 对方程进行 Ｆ 检验和失拟检验，计算回归方程
平方和和自由度。 经过统计检验结果表明，方程的
显著性水平为 ０􀆰 ０１，且拟合得很好，故可作为最优
方程，并用来描述各因素对酸钙产率的影响规律。
为更直观地分析各因素对酸钙产率的影响，采
用降维分析法，即固定水平－１、０、１，求三因素中两
两组合与酸钙收率的关系，用 Ｍａｔｌａｂ 软件绘制曲面
图，如图 １～３所示。
表 １　 自然因素水平表及其编码表
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｃｏｄｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ
水平 种龄 ／ ｈ ｐＨ ｗ（ＣａＯＨ） ／ ％
ｒ（ ｚ２ｊ） １９􀆰 ５０ ５􀆰 ６００ ２０􀆰 ０００
１（ ｚｏｊ＋Δｊ） １８􀆰 ７５ ５􀆰 ５２５ １９􀆰 ３７５
０（ ｚｏｊ） １６􀆰 ５０ ５􀆰 ３００ １７􀆰 ５００
－１（ ｚｏｊ－Δｊ） １４􀆰 ２５ ５􀆰 ０７５ １５􀆰 ６２５
－ｒ（ ｚ１ｊ） １３􀆰 ５０ ５􀆰 ０００ １５􀆰 ０００
Δｊ ＝（ ｚ２ｊ－ｚ１ｊ） ／ ２ｒ ２􀆰 ２５ ０􀆰 ２２５ １􀆰 ８７５
ｘｊ ＝（ ｚｊ－ｚ０ｊ） ／ Δｊ ｘ１ ＝ ０􀆰 ４４４（ ｚ１－１６􀆰 ５） ｘ２ ＝ ４􀆰 ４４（ ｚ２－５􀆰 ３） ｘ３ ＝ ０􀆰 ５３３（ ｚ３－１７􀆰 ５）
表 ２　 试验方案及结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号 ｘ０ ｘ１ ｘ２ ｘ３ ｘ１ｘ２ ｘ１ｘ３ ｘ２ｘ３ ｘ２１ ｘ２２ ｘ２３ 实验值
１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ８３􀆰 １０
２ １ １ １ －１ １ －１ －１ １ １ １ ８４􀆰 １０
３ １ １ －１ １ －１ １ －１ １ １ １ ８５􀆰 ９４
４ １ １ －１ －１ －１ －１ １ １ １ １ ８３􀆰 １４
５ １ －１ １ １ －１ －１ １ １ １ １ ８４􀆰 ０５
６ １ －１ １ －１ －１ １ －１ １ １ １ ８４􀆰 ７６
７ １ －１ －１ １ １ －１ －１ １ １ １ ８５􀆰 ６９
８ １ －１ －１ －１ １ １ １ １ １ １ ８３􀆰 ７０
９ １ ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ０ ０ ８６􀆰 ００
１０ １ －ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ０ ０ ８６􀆰 ０７
１１ １ ０ ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ０ ８３􀆰 ０１
１２ １ ０ －ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ０ ８５􀆰 ２９
１３ １ ０ ０ ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ８４􀆰 ６４
１４ １ ０ ０ －ｒ ０ ０ ０ ０ ０ ｒ２ ８５􀆰 ５３
１５ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ８６􀆰 ５３
１６ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ８６􀆰 ７８
１７ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ８７􀆰 ３３
９１　 第 ２期 周生民等：响应面法优化黑曲霉发酵产葡萄糖酸钙
图 １　 ｐＨ、Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数二因素与酸钙收率的关系
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ，
ｐＨ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ（ＯＨ） ２
　 　 由图 １ 可以看出，在试验参数范围内，随着 ｐＨ
的变化，酸钙收率有一最佳值。 ｐＨ 较低时，酸钙
收率随 ｐＨ增加而增加，但当酸钙收率达到最大值
后反而随着 ｐＨ的增加而减少。 随着种龄的升高，
酸钙收率总的变化趋势为先增大后减小；而在不
同的 Ｃａ（ＯＨ） ２浓度下，酸钙收率的变化趋势没有
明显变化，说明 Ｃａ（ ＯＨ） ２浓度对酸钙收率并不
显著［９］ 。
图 ２ 显示了在设计的试验参数范围内种龄对
酸钙收率的影响情况。 从图 ２ 可以看出，酸钙收率
随着种龄的加长而增加，但在一定时间达到最大值
图 ２　 Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数、种龄二因素与酸钙收率的关系
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ
ｙｉｅｌｄ，ａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃａ（ＯＨ） ２
　 　 　 　 　
后，酸钙收率反而会降低。 Ｃａ（ＯＨ） ２浓度的影响对
酸钙收率不太明显。
从图 ３ 可以看出，在试验设计的参数范围内，
ｐＨ和种龄对酸钙收率的影响比较显著，同时也存在
一个最佳值，超过后产率降低。
从表 ２ 和图 １～３ 可以得出各参数对酸钙收率
的影响强度次序：Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数、ｐＨ、种龄。 通
过 Ｍａｔｌａｂ软件的最优化方法寻求三者的最佳组合：
Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数 ２０％，ｐＨ ５􀆰 ３，种龄 １７ ｈ。 酸钙
收率是 ８７􀆰 ２１％。 用模型对不同的工艺参数预测值
（表 ２），除 １３、１４ 号以外其他的实验组相对误差都
小于 １％。
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ３　 种龄、ｐＨ二因素与酸钙收率的关系
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ，
ａｎｄ ａｇｅ， ｐＨ
３　 结论
本实验在酸钠发酵基础上用黑曲霉发酵生产
葡萄糖酸钙并优化工艺，通过三元二次回归正交试
　 　 　 　 　
验建立了酸钙收率与 Ｃａ（ＯＨ） ２浓度、种龄、ｐＨ 之间
的模型。 采用 Ｍａｔｌａｂ 软件的最优化方法求得最佳
组合为 Ｃａ（ＯＨ） ２质量分数 ２０％、ｐＨ ５􀆰 ３、种龄 １７ ｈ、
酸钙收率是 ８７􀆰 ２１％，与实际试验中得率为 ８７􀆰 ３３％
比较符合。 从结果上看，最优组合不在因素表中所
列五水平中，而是通过曲面软件计算，取得最高值，
避免了由试验次数局限带来结果的不准确性，使实
验结果更客观。 经过工艺参数优化，葡萄糖酸钙产
率达到 ８７􀆰 ３３％，提高了产率，缩短生产周期，节约
成本，具有重要的参考价值。
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（责任编辑　 管　 珺）
１２　 第 ２期 周生民等：响应面法优化黑曲霉发酵产葡萄糖酸钙