全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００６
收稿日期：２０１５－０９－１０
基金项目：国家自然科学基金（２１３０６１１２）； 上海市自然科学基金（１３ＺＲ１４２９１００）；上海高校青年教师培养资助计划（ｓｌｇ１４０３７）；教育部留学回
国人员科研启动基金
作者简介：卢俊文（１９９４—），男，上海人，研究方向：微生物过程工程；张建国（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｇｚｈａｎｇ＠ ｕｓｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
玻璃珠破碎毕赤酵母条件的优化
卢俊文，傅梦月，张建国
（上海理工大学 食品科学与工程研究所，上海 ２０００９３）
摘　 要：以毕赤酵母的醇氧化酶（ＡＯＸ）为指标，以玻璃珠破碎法为对象，建立一种简单易行的毕赤酵母细胞的破碎
工艺。 考察玻璃珠用量、振荡时间、细胞液体积对毕赤酵母释放醇氧化酶的影响，进而利用 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ设计组合
优化这 ３种因素，以响应面模型和一个 ２阶多项式方程拟合了这 ３种影响因素和醇氧化酶比酶活的关系。 结果表
明：玻璃珠破碎毕赤酵母的最佳条件为 ０􀆰 ２３ ｇ玻璃珠、１􀆰 ０４ ｍＬ细胞液、１０３ ｓ振荡时间。 在最佳破碎条件下，醇氧
化酶比酶活为 ８􀆰 ８６ Ｕ ／ ｍｇ。 确定了玻璃珠破碎毕赤酵母细胞的条件，而且操作简便，可以同时处理多个样品，为重
组毕赤酵母的筛选提供了有效方法。
关键词：毕赤酵母；玻璃珠；破碎；醇氧化酶；响应面优化
中图分类号：Ｑ８１９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－００３０－０６
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ｌｙｓｉｓ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ
ＬＵ Ｊｕｎｗｅｎ，ＦＵ Ｍｅｎｇｙｕｅ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎｇｕｏ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｌｙｚｅ ｔｈｅ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ｗｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｅ ｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ
ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｉｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ，ｖｅｒｔｅｘ ｔｉｍｅ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ，ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ
ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ． Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｄｏｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ
ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｗａｓ ａ ｓｅｃｏｎｄ⁃ｏｒｄｅｒ ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ． Ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ
ＡＮＯＶＡ，ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ ｌｙｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｖｏｒｔｅｘ ｔｉｍｅ １０３ ｓ，
ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ ０􀆰 ２３ ｇ，ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ １．０４ ｍＬ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ８．８６ Ｕ ／ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｅａｓｙ ｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ；ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ；ｌｙｓｉｓ；ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
　 　 毕赤酵母已经广泛用于外源蛋白的表达［１］和
代谢物的积累［２－３］。 由于毕赤酵母高密度发酵过程
中有 ３０％细胞是死细胞［４］，所以利用突变的方法得
到环境耐受性好的毕赤酵母细胞是提高外源蛋白
表达产量的一个重要方向。 毕赤酵母也是研究过
氧化物酶体吞噬的模式微生物［５］，所以建立简单易
行的毕赤酵母细胞破碎方法对这些个方面的研究
具有重要意义。
目前，微生物细胞的破碎方法有很多，各自的优
缺点也很明显。 酶解的方法需要温和的温度和高成
本［６］。 高压均质破碎需要的能耗比较高，在压力低于
４００ ＭＰａ时破碎效果很差［７］；超声波破碎机产生的热
量形成高温，会损伤细胞释放出的酶活力，因为在超
声破碎机中采用较小的腔体，以 ２０ ｋＨｚ 频率破碎细
胞也使温度显著升高。 即使在一个微型的超声破碎
机（６３􀆰 ５ ｍｍ × ６􀆰 ５ ｍｍ）中，以 ２６７ ｋＨｚ频率破碎酿酒
酵母的破碎率只比在 ２０ ｋＨｚ 条件下的破碎率高 ２
倍［８］。 Ｇｒｏｂｌｅｒ等［９］设计了一个微型反应器破碎结核
分枝杆菌耗时 ５～１０ ｍｉｎ。 上述借助机械方式破碎细
胞都不能同时破碎多个样品。 化学法可以同时处理
多个样品，但是会对细胞释放的酶活力和环境有潜在
危害［１０］。
玻璃珠破碎微生物细胞是一种常用的破碎细胞
方法，具有操作简单，可以同时处理多个样品，没有对
酶活力和环境的损害等缺点［１１］。 玻璃珠破碎细胞的
方法对细菌细胞非常有效［１２］。 而玻璃珠对于破碎酵
母细胞，真菌孢子，海藻细胞的效果相对差一些。 目
前，通用操作手册要求使用者优化玻璃珠破碎的体积
和时间。 Ｓｉｍｐｓｏｎ［１３］建议等体积的玻璃珠和酵母细
胞在漩涡振荡器上振荡 ３０ ｓ后再用显微镜来检查细
胞的破碎情况。 吴桂英等［１４］的破碎条件是取溶有菌
体的缓冲溶液 ５００ μＬ，加入用酸洗过的玻璃珠至其总
体积为 １􀆰 ２５ ｍＬ，在漩涡混合仪上剧烈振荡悬液，每 １
ｍｉｎ为一个周期，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷
却 １ ｍｉｎ。 易弋等［１５］采用大约 ２００ μＬ 培养基，加入
体积约为 １００ μＬ的玻璃珠，漩涡振荡 １０～２５ ｍｉｎ后，
５ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，得到细胞裂解液。
本研究以利用醇氧化酶比活力为对象来研究
玻璃珠对毕赤酵母细胞的破碎效果（毕赤酵母醇氧
化酶活力代表毕赤酵母醇氧化酶启动子表达外源
蛋白的量），通过优化玻璃珠破碎酵母细胞的 ３ 个
基本因素（玻璃珠用量、振荡时间、细胞液体积），在
此基础上，再利用响应面法优化得到最佳的破碎条
件，以此来建立一个实用的微生物细胞破碎方法，
以期为微生物突变体的筛选提供良好的操作条件。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
毕 赤 酵 母 ＧＳ１１５， 生 命 技 术 公 司 （ Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）。 玻璃珠（直径为 ０􀆰 ５ ｍｍ），生
物分离公司（Ｂｉｏｓｅｐｅｃ Ｉｎｃ，ＵＳＡ）。 漩涡振荡器，海门
市其林贝尔仪器制造有限公司（ＸＷ ８０Ａ），振幅次
数 ２ ８００ ／ ｍｉｎ。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 玻璃珠处理方法
玻璃珠的预处理步骤为浓盐酸中浸泡 １６ ｈ，然
后用去离子水洗涤至中性，最后在 ６０ ℃烘箱中干燥
１６ ｈ后 ４ ℃保存。 使用前放于冰上待用。
１􀆰 ２􀆰 ２　 培养方法
ＹＰＤ培养基（ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 １０，蛋白胨 ２０，葡萄
糖 ２０，琼脂粉 １５（制备平板时添加）。
ＢＭＧＹ培养基：酵母粉 １０ ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 ２０ ｇ ／ Ｌ，
磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ） （ｐＨ ７􀆰 ０） １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，甘油
２０ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２０ ｇ ／ Ｌ，生物素 ４×１０
－４ ｇ ／ Ｌ。
毕赤酵母培养过程：从 ２５０ ｇ ／ Ｌ 甘油保存菌中
转接毕赤酵母到 ＹＰＤ 平板培养基上 ３０ ℃培养 ３ ｄ，
然后再转接到含有 ２５ ｍＬ ＹＰＤ培养基的 ２５０ ｍＬ 三
角瓶中培养（３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ、１８～２０ ｈ）。 以 ４％接
种量（体积分数）转接到含有 ２５ ｍＬ ＢＭＧＹ 培养基
的 ２５０ ｍＬ三角瓶中培养（３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ）培养 ４８
ｈ后，每 ２４ ｈ加入 ０􀆰 ５％甲醇（体积分数）进行诱导 ３
ｄ。 毕赤酵母细胞的吸光度（ＯＤ６００）为 １０􀆰 ５±０􀆰 ５。
１􀆰 ２􀆰 ３　 毕赤酵母细胞破碎方法
以 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、２ ｍｉｎ的条件离心收集毕赤酵母
细胞，再用去离子水洗涤 ２ 次（１０ ｇ ／ Ｌ（以干细胞量
计））。 将毕赤酵母细胞、０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ ７􀆰 ５）和
玻璃珠混合后在漩涡振荡器上振荡一定时间后，以
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、５ ｍｉｎ离心得到破碎细胞的上清液。 收
集上清液，测定蛋白质含量和醇氧化酶活力。 玻璃珠
添加量分别为 ０􀆰 ０５、０􀆰 １、０􀆰 ２、０􀆰 ３、０􀆰 ５、１􀆰 ０ ｇ，细胞液
体积分别为 ０􀆰 ２、０􀆰 ５、１􀆰 ０、１􀆰 ５、２􀆰 ０ ｍＬ，振荡时间分别
为 ３０、６０、９０、１８０、３００ ｓ。 玻璃珠量、细胞液体积、振荡
时间的默认值分别为 ０􀆰 ２ ｇ、０􀆰 ５ ｍＬ、９０ ｓ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 毕赤酵母细胞破碎的响应面优化
利用软件Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８􀆰 ０􀆰 ５（Ｓｔａｔｅ Ｅａｓｅ Ｉｎｃ，
ＵＳＡ）的 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ 方法，以玻璃珠量（Ｘ１）、细胞
液体积（Ｘ２）、振荡时间（Ｘ３） 设计一个 ３个因素 ３水
平实验。 按照此设计进行了 １７个实验组。 ３个因素
与醇氧化酶比活力的多项式方程以式（１）表示。
Ｙ＝ ｂ０ ＋ ｂ１ Ｘ１ ＋ ｂ２ Ｘ２ ＋ ｂ３ Ｘ３ ＋ ｂ１２ Ｘ１ Ｘ２ ＋ ｂ１３ Ｘ１ Ｘ３ ＋
ｂ２３Ｘ２Ｘ３＋ｂ１１Ｘ２１＋ｂ２２Ｘ２２＋ｂ３３Ｘ２３ （１）
式中：Ｙ表示醇氧化酶比活力，ｂ０表示截距，ｂｎ表示
回归系数， Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３分别表示玻璃珠量、细胞液体
积、振荡时间的值。
１３　 第 １期 卢俊文等：玻璃珠破碎毕赤酵母条件的优化
１􀆰 ２􀆰 ５　 分析方法
毕赤酵母 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、３ ｍｉｎ 离心，然后以去
离子水洗涤 ２次，在 ８０ ℃烘箱中干燥至恒质量，得
到细胞干质量。
牛血清白蛋白为标准品，利用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法测定
蛋白质含量［１６］。 采用 １００ μＬ 上清液与 １􀆰 ０ ｍＬ
Ｂｒａｄｆｏｒｄ 工作液（３０ ｍＬ ／ Ｌ 甲醇，４８ ｍＬ ／ Ｌ Ｈ３ＰＯ４，６０
ｍＬ ／ Ｌ 储存液）混合后摇匀，静置 ２ ｍｉｎ 后测定
ＯＤ５９５。 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 储存液含有 ３３０ ｍＬ ／ Ｌ 甲醇、 ６７０
ｍＬ ／ Ｌ 磷酸、１􀆰 １６６ ７ ｇ 考马斯亮蓝 Ｇ２５０。
醇氧化酶活力测定方法参照文献［１７］。 取 １００
μＬ无细胞酶液和测定液混合后，反应体系中含有 １０
Ｕ ／ ｍＬ辣根过氧化酶、１００ μｍｏｌ ／ ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ ７􀆰 ５），１
μｍｏｌ ／ ｍＬ ４ 氨基安替比林、４􀆰 ３ μｍｏｌ ／ ｍＬ 苯酚、２００
μｍｏｌ ／ ｍＬ甲醇。 １个醇氧化酶活力单位定义：３７ ℃、
ｐＨ ７􀆰 ５条件下，１ ｍｉｎ内产生 １ μｍｏｌ 过氧化氢的酶活
力。 醇氧化酶比酶活为单位蛋白质释放量的醇氧化
酶活力。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 玻璃珠量对破碎毕赤酵母的影响
图 １ 是玻璃珠量对毕赤酵母破碎的影响结果。
由图 １可知：随着玻璃珠量由 ０􀆰 ０５ ｇ 增加到 １􀆰 ０ ｇ，
蛋白质的释放量和总醇氧化酶活力逐步增加。 蛋
白质释放量由 ０􀆰 １５ ｍｇ ／ ｍＬ增至 １􀆰 ８４ ｍｇ ／ ｍＬ。 醇氧
化酶活力由 ０􀆰 ９１ 增至 ６􀆰 ３１ Ｕ ／ ｍＬ。 醇氧化酶比酶
活首先随着玻璃珠量的增加逐步增加，在玻璃珠量
为 ０􀆰 ２ ｇ时达到最高值（６􀆰 ４４ Ｕ ／ ｍｇ），随后在 １􀆰 ０ ｇ
玻璃珠时降低为 ３􀆰 ４４ Ｕ ／ ｍｇ。
２􀆰 ２　 细胞液体积对破碎毕赤酵母的影响
考察细胞液体积对破碎毕赤酵母的影响，结
果见图 ２。 由图 ２ 可知：蛋白质释放量和醇氧化酶
活力随着细胞液体积由 ０􀆰 ２５ ｍＬ 增至 ２􀆰 ０ ｍＬ 过
程中呈现逐步升高，再保持平稳的趋势。 醇氧化
酶比活力在细胞液体积由 ０􀆰 ２５ ｍＬ 增至 ２􀆰 ０ ｍＬ
过程中呈现钟形曲线。 蛋白质释放量在 １􀆰 ５ ｍＬ
时达到最大值 １􀆰 ９５ ｍｇ ／ ｍＬ。 醇氧化酶活力在 １􀆰 ５
ｍＬ细胞液时达到 ８􀆰 ８２ Ｕ ／ ｍＬ，然后保持稳定。 醇
氧化酶比酶活在细胞液体积为 １􀆰 ０ ｍＬ 时达到最
高值 ８􀆰 ６１ Ｕ ／ ｍｇ。
２􀆰 ３　 振荡时间对破碎毕赤酵母的影响
图 ３ 是振荡时间对破碎毕赤酵母的影响结果。
由图 ３可知：蛋白质释放量和醇氧化酶活力随着振
图 １　 玻璃珠量对破碎毕赤酵母的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ ａｄｄｅｄ ｏｎ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ ｌｙｓｉｓ
图 ２　 细胞液体积对破碎毕赤酵母的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ ｌｙｓｉｓ
荡时间的增长而逐渐升高。 蛋白质的质量浓度由
０􀆰 ２１ ｍｇ ／ ｍＬ升高到 ０􀆰 ８６ ｍｇ ／ ｍＬ。 醇氧化酶活力由
１􀆰 ２４ Ｕ ／ ｍＬ升高到 ４􀆰 ６５ Ｕ ／ ｍＬ。 醇氧化酶的比酶活
呈现为钟形曲线。 醇氧化酶的最高比活力在振荡
时间为 ９０ ｓ时达到 ６􀆰 ６６ Ｕ ／ ｍｇ。
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ３　 振荡时间对破碎毕赤酵母的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｒｔｅｘ ｔｉｍｅ ｏｎ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ ｌｙｓｉｓ
２􀆰 ４　 毕赤酵母细胞破碎的响应面优化
利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８􀆰 ０􀆰 ５ 设计 ３ 因素 ３ 水平
的试验及结果见表 １。 由表 １ 可知，醇氧化酶比酶
活在 ６􀆰 ４３～８􀆰 ８５ Ｕ ／ ｍｇ之间。
表 １　 基于 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ设计的试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ
Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ
试验号
Ｘ１
ｍ（玻璃
珠） ／ ｇ
Ｘ２
Ｖ（细胞
液） ／ ｍＬ
Ｘ３
振荡
时间 ／ ｓ
醇氧化酶
比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
１ ０􀆰 ２０（０） １􀆰 ００（０） ９０（０） ８􀆰 ８５
２ ０􀆰 ２０ １􀆰 ００ ９０ ８􀆰 ３１
３ ０􀆰 ２０ １􀆰 ２５（１） １２０（１） ７􀆰 ６２
４ ０􀆰 １５（－１） １􀆰 ２５ ９０ ８􀆰 １０
５ ０􀆰 ２５（１） １􀆰 ００ １２０ ８􀆰 ６８
６ ０􀆰 １５ ０􀆰 ７５（－１） ９０ ７􀆰 ２３
７ ０􀆰 ２５ １􀆰 ２５ ９０ ８􀆰 ５５
８ ０􀆰 ２０ １􀆰 ００ ９０ ８􀆰 ８２
９ ０􀆰 ２５ ０􀆰 ７５ ９０ ７􀆰 ８８
１０ ０􀆰 ２０ ０􀆰 ７５ ６０（－１） ７􀆰 ０４
１１ ０􀆰 ２０ ０􀆰 ７５ １２０ ７􀆰 ６２
１２ ０􀆰 ２０ １􀆰 ００ ９０ ８􀆰 ８３
１３ ０􀆰 ２０ １􀆰 ２５ ６０ ６􀆰 ６０
１４ ０􀆰 １５ １􀆰 ００ １２０ ７􀆰 ５８
１５ ０􀆰 ２０ １􀆰 ００ ９０ ８􀆰 ４３
１６ ０􀆰 １５ １􀆰 ００ ６０ ６􀆰 ８０
１７ ０􀆰 ２５ １􀆰 ００ ６０ ６􀆰 ４３
　 　 通过 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ 对表 １ 结果进行拟合得到
的 ２阶多项式模型见式（２）。
Ｙ＝－９􀆰 ８０＋３０􀆰 ６７Ｘ１＋１３􀆰 ８６Ｘ２ ＋０􀆰 １５Ｘ３ －２􀆰 ０７Ｘ１Ｘ２ ＋
０􀆰 ２４Ｘ１Ｘ３＋０􀆰 ０１４Ｘ２Ｘ３－１１６􀆰 ０４ Ｘ２１－７􀆰 ０７Ｘ２２－７􀆰 ０７Ｘ２３ （２）
表 ２是利用 ＡＮＯＶＡ分析式（２）的模型参数。 Ｐ
值表示每个项式的显著性参数。 Ｘ３和 Ｘ２３是显著的。
３个因素的显著性排序（从大到小）为振荡时间，玻璃
珠量，细胞液体积。 式（２）的 Ｆ 值为 ６􀆰 ８９，Ｐ 值为
０􀆰 ００９ ３（Ｐ＜０􀆰 ０５），这说明该模型与实验相符合。 模
型的决定系数为 ０􀆰 ８９８ ６，这说明有 ８９􀆰 ８６％的数据适
合该方程。
表 ２　 ＡＮＯＶＡ统计分析结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＮＯＶＡ
项式 平方和 ｄｆ 平均方差 Ｆ值 Ｐ值（Ｐｒ＞Ｆ）
模型 ９􀆰 ５３ ９ １􀆰 ０６ ６􀆰 ８９ ０􀆰 ００９ ３
Ｘ１ ０􀆰 ３８ １ ０􀆰 ３８ ２􀆰 ４５ ０􀆰 １６１ ８
Ｘ２ ０􀆰 １９ １ ０􀆰 １９ １􀆰 ２３ ０􀆰 ３０４ ７
Ｘ３ ２􀆰 ６８ １ ２􀆰 ６８ １７􀆰 ４７ ０􀆰 ００４ １
Ｘ１Ｘ２ ０􀆰 ００３ １ ０􀆰 ００３ ０􀆰 ０１８ ０􀆰 ８９８ ５
Ｘ１Ｘ３ ０􀆰 ５５ １ ０􀆰 ５５ ３􀆰 ５５ ０􀆰 １０１ ５
Ｘ２Ｘ３ ０􀆰 ０４９ １ ０􀆰 ０４９ ０􀆰 ３２ ０􀆰 ５９１ ５
Ｘ１ ２ ０􀆰 ３５ １ ０􀆰 ３５ ２􀆰 ３１ ０􀆰 １７２ ７
Ｘ２ ２ ０􀆰 ８２ １ ０􀆰 ８２ ５􀆰 ３６ ０􀆰 ０５３ ８
Ｘ３ ２ ４􀆰 ０８ １ ４􀆰 ０８ ２６􀆰 ５３ ０􀆰 ００１ ３
重复误差 １􀆰 ０８ ７ ０􀆰 １５
失拟检验 ０􀆰 ８０ ３ ０􀆰 ２７ ３􀆰 ８９ ０􀆰 １１１ ３
纯误差 ０􀆰 ２７ ４ ０􀆰 ０６９
总偏差 １０􀆰 ６１ １６
Ｒ２ ＝ ０􀆰 ８９８ ６
　 　 图 ４ ～ ６ 是响应面优化结果 ３Ｄ 图。 由图 ４ 可
知：玻璃珠质量由 ０􀆰 １５ ｇ增加到 ０􀆰 ２ ｇ时，醇氧化酶
比活力逐步升高；玻璃珠量继续升高到 ０􀆰 ２５ ｇ 时，
醇氧化酶比活力降低。 醇氧化酶比活力随着细胞
液体积增加而升高。 细胞液体积增高到 １􀆰 ０ ｍＬ时，
醇氧化酶比活力开始下降。 由图 ５ 可知：醇氧化酶
比活力随着玻璃珠量由 ０􀆰 １５ ｇ增加到 ０􀆰 ２ ｇ时逐渐
升高，然后保持稳定。 醇氧化酶比活力也随着振荡
时间的延长而升高。 当振荡时间长于 １１５ ｓ 后，醇
氧化酶比活力缓慢降低。 由图 ６ 可知：醇氧化酶比
活力随着细胞液体积、振荡时间分别由 ０􀆰 ７５ ｍＬ、
６０ ｓ升高到 ０􀆰 ９５ ｍＬ、９０ ｓ 而升高，然后随着细胞液
体积和振荡时间继续升高而下降。
３３　 第 １期 卢俊文等：玻璃珠破碎毕赤酵母条件的优化
图 ４　 玻璃珠和细胞液体积对醇氧化酶比活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ
ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ５　 玻璃珠和振荡时间对醇氧化酶比活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ ａｎｄ ｖｏｒｔｅｘ ｔｉｍｅ
ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ
图 ６　 细胞液体积和振荡时间对醇氧化酶比活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｖｏｒｔｅｘ ｔｉｍｅ
ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｙ
采用玻璃珠振荡的方法破碎微生物细胞的优
点在于操作简单易行，不需要专门的仪器。 而且玻
璃珠振荡的方法可以同时操作多个样品。 这些优
点非常有助于本方法应用于微生物突变体的筛选。
根据式（２）得到的理论最佳破碎条件为振荡时间
１０２􀆰 ７２ ｓ、玻璃珠量 ０􀆰 ２３ ｇ、细胞液体积 １􀆰 ０４ ｍＬ。
本研究的振荡时间比采用层状氨基丙基镁硅酸盐
破碎细胞的时间（４ ｍｉｎ）短［１１］。
２􀆰 ５　 模型的验证
利用软件 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８􀆰 ０􀆰 ５预测的玻璃珠破
碎细胞的最佳条件为振荡时间 １０２􀆰 ７２ ｓ、玻璃珠量
０􀆰 ２３ ｇ、细胞液体积 １􀆰 ０４ ｍＬ，预测的醇氧化酶比酶活
为 ８􀆰 ８５ Ｕ ／ ｍｇ。 验证实验采用的破碎条件为振荡时
间 １０３ ｓ、玻璃珠量 ０􀆰 ２３ ｇ、细胞液体积 １􀆰 ０４ ｍＬ，得到
的醇氧化酶比活力为（８􀆰 ８６ ± ０􀆰 ００５ １） Ｕ ／ ｍｇ。 验证
实验的结果表明方程 ２的模型能准确地预测玻璃珠
破碎毕赤酵母细胞的条件。 本研究也得到玻璃珠破
碎毕赤酵母的最佳条件。
３　 结论
为了获得简单易行、方法可靠的毕赤酵母破碎
方法，采用响应面方法优化了玻璃珠破碎毕赤酵母
的 ３个影响因素。 本研究得到的预测模型能准确反
映实验结果。 最佳的毕赤酵母破碎条件为振荡时
间 １０３ ｓ、玻璃珠量 ０􀆰 ２３ ｇ、细胞液体积 １􀆰 ０４ ｍＬ。
本研究也为破碎毕赤酵母的操作条件奠定了基础。
参考文献：
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４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
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（责任编辑　 荀志金）
􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌
（上接第 １８页）
３　 结论
本文构建的包含大片段的同源重组质粒 ｐＵＫ
ｄＩＭＰ 通过 ２次同源重组将目的基因肌酐酸脱氢酶
（ＩＭＰＤＨ）成功敲除，由于是无痕敲除技术，所以最
后菌株不含有任何抗性，开辟了一种针对节杆菌而
言新型的基因改造方法。 通过几批发酵实验，其中
ＩＭＰＤＨ基因缺失的菌株积累目标产物 ｃＡＭＰ 的能
力比对照菌株高 ４９􀆰 ７％，达到了（９􀆰 ０１±０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ，
为国内 ｃＡＭＰ 的工业化生产奠定了基础。
参考文献：
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ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ａｎｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ
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ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ａ３０２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｔｉｏｎａｌ
ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１０１：
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ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ［ Ｊ ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０００， ２８
（２２）：ｅ９７．
（责任编辑　 周晓薇）
５３　 第 １期 卢俊文等：玻璃珠破碎毕赤酵母条件的优化