全 文 ：第24卷 第10期
2012年10月
Vol. 24, No. 10
Oct., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)10-1121-06
黄素氧化还原蛋白研究进展
卢明锋1,2，张月杰1*
(1 山东理工大学生命科学学院，淄博 255091；2 山东师范大学生命科学学院，济南 250014 )
摘　要：黄素氧化还原蛋白 (flavodoxin, Fld)是一类通过非共价键与黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide,
FMN)紧密结合的小黄素蛋白，在原核生物及低等真核生物中作为重要的低电势电子传递载体参与了众多
的生化反应。在 Fld的结构和分类、FMN与脱辅基 Fld结合途径以及 Fld结构与功能的关系等方面综述了
近年来的相关研究进展。
关键词：黄素氧化还原蛋白；配体结合；氧化还原电位
中图分类号：Q513；Q6-33 文献标志码：A
Research advances of flavodoxin
LU Ming-Feng1,2, ZHANG Yue-Jie1*
(1 School of Life Sciences, Shandong University of Technology, Zibo 255091, China;
2 School of Life Sciences, Shandong Normal University, Ji’nan 250014, China)
Abstract: Flavodoxins are small flavoproteins which non-covalently bind with a molecular of FMN and participate
in a varity of biochemical reactions acting as low redox potential electron carriers in prokaryotic and low eukaryotic
organism. The structural characteristics of flavodoxin, classification, binding pathway between FMN and
apoflavodoxin and influence factors on redox potentials of flavodoxin were reviewed in this paper.
Key words: flavodoxin; ligand binding; redox potential
收稿日期：2012-04-23； 修回日期：2012-05-24
基金项目：国家自然科学基金项目(30870520)；山东
省高等学校科技计划(J12LE03)
*通信作者：E-mail: zhangyuejie221@yahoo.com.cn；
Tel: 0533-2781763
黄素氧化还原蛋白 (flavodoxin, Fld)是指一类
与黄素单核苷酸 (flavin mononucleotide, FMN)非共
价键结合，具有单一结构域的小黄素蛋白 (flavopro-
tein)。除了真核生物中的绿藻和红藻，Fld 仅存
在于细菌中，并在许多种属，如普通脱硫弧菌
(Desulfovibrio vulgaris)、 埃氏巨型球菌 (Megasphaera
elsdenii)、棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)、 巴氏
梭菌 (Clostridia pasteurianum)、蓝藻鱼腥藻 (Cyano-
bacteria anabaena)中都普遍存在 [1] 。Fld作为电子
传递载体在电子传递系统中具有重要的作用，参与
了大量的生化反应，如 Fld在光生物合成中可以作
为单电子转运中心在光系统 I (photo system I, PS I)
和 NADP+-铁硫蛋白氧化还原酶 (ferredoxin-NADP+
reductase, FNR)间逐个地传递电子 [2]；在幽门螺旋
杆菌 (Helicobacter pylori)乙酰辅酶 A的生物合成中
作为丙酮酸：Fld氧化还原酶的电子受体 [1]；在枯
草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)脂肪酸去饱和反应中
起到电子供体的作用 [3]；在 A. vinelandii中参与氮
气的固定和还原；在环境条件恶劣时替代铁氧化还
原蛋白 (ferredoxin, Fd)[4]。
1　Fld的结构和分类
按照 SCOP (structural classification of proteins)
分类标准，Fld属于 α/β Class (类 )，Flavodoxin-like
fold (折叠类型 )，Flavoprotein supperfamily (超家
族 )，Flavodoxin-related (bind FMN) family (家族 )，
Flavodoxin domain (结构域 )。目前，所有已知的
生命科学 第24卷1122
Fld都是富含酸性氨基酸的蛋白质，一般含有
140~180个残基，相对分子质量在 14 000~23 000
之间，分子中心 5个平行 β片层 (β片层内的链顺
序是 21345)被外围的 2层 α螺旋包围着组成 αβα
形式的三明治结构 (图 1)[5]。
Fld可分成相对分子质量在 14 000~17 000之间
的短链 Fld (D. vulgaris, C. pasteurianum)和相对分
子质量在 20 000~23 000之间的长链 Fld (Anabaena
PCC7119, A. vinelandii, E. coli, H. pylori)两种类型。
两者共有的功能性 loop分别是 N末端的磷酸结合
loop (P loop)和含有保守芳香族氨基酸残基的异咯
嗪结合 loop (W loop和 Y loop)。两者的唯一区别在
于长链 Fld在 C末端具有一个额外的长约 20个氨
基酸的的 loop 结构。由于去除长链 Fld 这段额
外的 loop后并不影响脱辅酶黄素氧化还原蛋白
(apoflavodoxin, apoFld)的折叠和稳定性，对 FMN
与 apoFld结合的影响也较小，所以，Lopez-Llano
等 [6-7]认为长链 Fld特有的这段 loop可能与其 parter
(伙伴 )间的识别有关，并从结构特征的角度出发
提出短链 Fld起源于长链 Fld的观点。
2　FMN与apoFld的结合途径
Fld的显著特征是可以非常紧密地与 FMN以
非共价键结合 (解离平衡常数 Kd<1 nm)。氧化型
FMN分子由一分子磷酸、一分子核醇基团和一分
子异咯嗪基团组成。由于 Fld分子上不存在结合核
醇基团的保守序列，所以，FMN与 Fld的识别应该
只涉及磷酸基团、异咯嗪基团与 P loop、W loop及
Y loop间的相互作用。
2.1　磷酸基团先结合途径
Curley等 [8]研究M. elsdenii apoFld与辅因子结
合性质时发现，FMN 与 apoFld 的结合非常紧密
(Kd = 0.24 nmol/L)，而与核黄素 (riboflavin)的结合
却非常弱 (Kd = 0.72 μmol/L)。由于核黄素与 FMN
的差别只是在分子结构的核醇基团末端少了一个磷
酸基团，因此，磷酸基团被认为对 FMN与 apoFld
的识别与结合具有重要的作用。Barman等 [9]发现
apoFld与 FMN的结合涉及两次松弛，而与核黄素
的结合只涉及一次松弛，因此，其推断蛋白质内部
构象的改变需要 FMN的磷酸基团的参与，进而提
出磷酸基团首先与 apoFld结合并确保构象改变有利
于异咯嗪环的结合 [1]。Carlson等 [10]研究黄素 (flavin)
与 A. vinelandii apoFld结合热动力学时发现，与黄
素腺嘌呤二核苷酸 (flavin adenine dinucleotide, FAD)
和 8-羧基核黄素 (8-carboxyriboflavin)相比，FMN
与 apoFld的结合焓最低，因而推断 FMN的磷酸基
团使其更易插入 apoFld上已有的 FMN结合口袋。
Genzor等 [11]分析了 Anabaena PCC 7119的 apoFld
X-ray晶体结构 ,发现其整体结构与黄素氧化还原
全酶 (holo-flavodoxin，holoFld)基本相似，但在异
咯嗪结合位点存在明显的残基塌陷，他们将这种现
象描述为酪氨酸 /色氨酸芳香门的关闭 (“closure of
tyr/trp aromatic gate”)。由于磷酸基团结合位点可以
被溶液中二价磷酸或硫酸阴离子占据，且其结构和
指向都与 holoFld的结构相似，所以，他们推断初
始的配体识别发生在磷酸结合位点，其引起的构象
改变有利于异咯嗪的结合。
2.2　异咯嗪基团先结合途径
Steensma等 [12]认为仅依据上述结果不能断定
是磷酸基团先引发了 FMN与 apoFld的结合，因为
X-ray晶体结构只是偶然冻结了一个 flavin结合位
点的构象。NMR测定结果也证明，A. vinelandii 来
源的 apoFld的结构与 holoFld基本一致，但 apoFld
并没有现成的磷酸结合位点，且在整个 Flavin结合
区都具有非常大的灵活性 [13]。Lostao等 [14]采用定
点突变技术研究了 Anabaena PCC 7119的 Fld的W
loop、Y loop和 P loop氨基酸组成对 FMN与 apoFld
结合的影响， W loop 和 Y loop的芳香族氨基酸被替
换后显著降低了 holoFld的形成率，而 P loop的氨
基酸组成不影响结合速率常数，因此他们认为是异
图1 D. vulgaris黄素氧化还原蛋白(pdb:1J8Q)的三维
结构[5]
卢明锋，等：黄素氧化还原蛋白研究进展第10期 1123
咯嗪结合位点发生的疏水 /芳香相互作用推动了
FMN与 apoFld的结合，即异咯嗪环先结合。
2.3　合作结合途径
采用停留荧光分光光度技术研究 D. vulgaris来
源的 apoFld与 Flavin结合动力学性质时，Murray
和 Swenson等 [15]发现 FMN与 apoFld在磷酸盐缓
冲液中的结合会导致两个不同速率的荧光淬灭过
程，而在无磷酸盐缓冲液时则只有一个荧光淬灭过
程；核黄素与 apoFld在磷酸盐缓冲液中的结合也只
有一个荧光淬灭过程，而无磷酸盐缓冲液时核黄素
不能与 apoFld结合。他们认为造成这种差异的原因
是由于 FMN是以两种不同的途径与 apoFld结合，
并提出了一个基于磷酸结合位点与异咯嗪结合位点
间具有合作性关系的新模型；还认为异咯嗪基团的
结合依赖于磷酸结合位点上磷酸基团的存在，当缓
冲液中存在磷酸阴离子时 FMN可以通过两种途径
与 apoFld结合：(1)首先是磷酸基团的插入，然后
是异咯嗪环的结合即磷酸优先 (phosphate-first)，由
于核黄素缺乏磷酸基团，所以不能与 apoFld结合；
(2)当缓冲液中的无机磷酸基团占据磷酸结合位点
后，能够提高 FMN异咯嗪环的结合速率即异咯嗪
环优先 (ring-first)。事实上，Fld的 flavin结合位点
具有很大的灵活性，Fld酰胺骨架上的化学位移证
实了磷酸基团与 P loop的结合，NMR和近紫外圆
二色性光谱 (near-UV circular dichroism, near-UV CD)
数据表明，这种结合虽然对 Y loop没有影响，但却
有利于 W loop 芳香族氨基酸侧链的移动和构象
改变 [16]，证明合作结合途径的合理性。
2.4　构象不均一结合途径
Murray等 [16]的合作模型无法解释缓冲液中
是否有磷酸分子时，FMN与 H. pylori的 apoFld的
结合都是两个不同速率的荧光淬灭过程。在 D.
vulgaris来源 Fld的W60A突变体中也发现了类似
的现象 [17-18]。一系列针对 H. pylori来源 Fld的异咯
嗪和磷酸结合位点的突变实验表明，磷酸结合位点
的突变对 FMN的结合速率常数几乎没有影响，所
以，FMN与 Fld的结合应该是受到 FMN与异咯嗪
结合位点间的相互作用控制。Ayuso-Tejedor等 [17]
认为 H. pylori的 apoFld具有一些固有的不均一构
象，两相淬灭过程就是这些不均一构象与 FMN结
合的结果。其中包括：(1)顺序结合机制，先结合
异咯嗪位点，然后再与磷酸位点结合；(2)任意选
择结合异咯嗪或磷酸位点，然后快速重组；(3)任
意选择结合天然态或部分去折叠态 apoFld，迅速形
成平衡态中间体；(4)任意选择已结合有磷酸阴离
子的 apoFld或完全自由的 apoFld，迅速完成阴离子
加载途径。
3　配体结合对Fld折叠过程的影响
很多蛋白都需要配体的非共价结合才具有生物
学功能，但配体结合在蛋白质折叠过程中的作用却
缺乏详尽的研究。Bollen等 [19]研究了 FMN对 Fld (A.
vinelandii)折叠的影响，提出了 Fld折叠的“后进
先出”机制，其主要内容为：holoFld折叠过程中
天然态的 apoFld自发形成是非常必要的；过量的
FMN不能加速 holoFld的折叠，FMN也不能作为
折叠的成核位点；FMN在折叠的最后一步与天然
态的 apoFld结合形成 holoFld；即使是在强变性剂
下，holoFld也必须先解离下 FMN才能发生去折叠。
与 Bollen的“后进先出”机制所认为的 apoFld折
叠先于 FMN的结合相反，Muralidahara等 [5]却认
为 FMN 可以通过一种被称为辅因子飞雕 (fly
casting)模型的方式加速 Fld (D. vulgaris)的折叠过
程。根据Muralidahara等 [5]的实验结果可知，FMN
可以在毫秒内完成与去折叠多肽的结合，并指导其
迅速折叠成天然态 holoFld, W loop和 Y loop上的保
守芳香氨基酸替换对折叠过程无影响。Muralidahara
等 [5]认为由于来源于 D. vulgaris和 A. vinelandii的
Fld与FMN的亲和力相差近100倍，所以长链Fld (例
如 A. vinelandii)和短链 Fld (D. vulgaris)各自有其偏
好的折叠 /结合途径。
4　Fld结构与功能的关系
Fld通过非共价结合 FMN而使蛋白质具有了
氧化还原性质，在铁离子缺乏时甚至能够代替铁
硫蛋白。Fld上的氧化型 (fully oxidized, ox )FMN 在
异咯嗪环上接受一个电子和质子后被还原为中性的
半醌型 (semiquinone, one-electron reduced form, sq )，
继续接受一个电子后可以被彻底地还原为氢醌
型 (hydroquinone, two-electron reduced form, hq )。
4.1　芳香门保守性氨基酸对氧化还原电位的影响
绝大多数 Fld中，FMN的异咯嗪环是被堆叠
在两个芳香氨基酸之间 ( 图 1)。在异咯嗪环的
si-face通常是 Y loop上非常保守的酪氨酸残基 Y，
在 re-face则是W loop上保守性相对较小的色氨酸
残基W。Y或W分别被其他两种芳香族氨基酸替换，
使 E1略趋向于负值而 E2变得更趋向正值。Y替换
引起的 E2变化幅度小于W替换，而 E1变化幅度大
生命科学 第24卷1124
于W替换。非芳香氨基酸替换均较芳香替换使 E2
和 E1均大幅度趋向于正值。所有突变型的 Fldox的
Kd均增大 (较野生型高 15~5000 000倍 )，但非芳
香替换增大幅度远高于芳香替换 [20]。上述结果表明，
芳香氨基酸残基能够紧固 apoFld与 FMN间的结合；
Y残基对 E1影响较大主要是因为其较W残基更有
利于提高 Fldhq的相对不稳定性；而W残基显著影
响 E2则主要是因为其更有利于提高 Fldsq的相对稳
定性；其他氨基酸在上述两个位点的替换将导致
Fldhq的相对不稳定性和 Fldsq的相对稳定性的降低，
从而使 E1和 E2均更倾向于正值。
4.2　影响Fldhq相对不稳定的原因
野生型 Fld中非常稳定的 Fldsq、稳定的 Fldox
和相对不稳定的 Fldhq是由多种因素共同作用的结
果。由于 Y残基的苯酚侧链与 FMN异咯嗪环的
outface近乎共平面，而W残基与异咯嗪环间也只
有小于 40º的夹角，两者均可与 FMN之间通过广
泛的范德华力形成芳香堆积相互作用 [21](图 2)。从
辅因子结合导致的自由能变化角度看，野生型 Y
loop上的 Y和W loop上的W能够分别通过与 FMN
形成更为有利的相互作用，使 apoFld与三种氧化还
原状态的 FMN结合能处于最低状态，在整个催化
循环中保证了非共价结合的辅因子与 apoFld始终紧
密结合在一起 [20]。Fldhq的相对不稳定性一方面可
能是由于 FMNhq在极性溶液中的稳定构象是非平面
的 butterfly bend，但在 Fld的芳香门非极性环境中
却被迫采用不稳定的平面构象。由于 Fldox、Fldsq的
稳定构象本身就是平面的，所以，Fldox、Fldsq相对
于 Fldhq更稳定。另一方面，Fldhq的相对不稳定与
FMNhq的阴离子特性具有更直接的关系。由于 Fld
是一种富含酸性氨基酸的酸性蛋白质，在 FMN结
合位点附近有大量的负电荷，静电排斥作用会导致
Fldhq的不稳定，这种不利的静电环境将使 FMNsq
的还原变得更为困难。Zhou和 Swenson等 [22]对 D.
vulgaris来源的 Fld的 FMN结合位点内距离 FMN
的 N(1)原子在 13Å以内的六个酸性氨基酸与氧还
还原电位的关系研究结果表明，E2与静电环境无明
显相关性，但 E1与酸性氨基酸的替换有很强的相
关性，平均每个酸性残基的替换使 E1的负值减少
15 mV。进一步的研究结果表明，负静电环境和 Y
残基与异咯嗪环间的芳香堆积导致 FMNhq不稳定表
现出的 E1的负值减少具有线性累加性
[22]。由于
FMN上还有一个负电基团磷酸，所以，他们随后
分别研究了中性 P loop的碱性氨基酸替换、核黄素
结合对 Fld氧化还原电位的影响。Zhou和 Swenson
等 [23]发现 P loop上的氨基酸仅具有普通的静电效
应，而磷酸基团的存在与否对 E2几乎没有影响，
但却使 E1趋向正值 180 mV，这种现象很可能是由
于缺少磷酸基团导致 apoFld︰核黄素半醌极端不稳
定引起的，而不会是因静电作用产生的。
4.3　氢键对Fldsq稳定性的影响
Fldsq较高的相对稳定性与还原态 Fld中异常复
杂的氢键网络密切相关。由于磷酸基团的氧原子与
P loop位点的氨基酸残基间有非常保守的氢键连接，
所以，这种氢键相互作用与 Fldsq的稳定性具有直
接的关系 [24]。除了磷酸基团的氧原子外，FMNox还
可以通过核醇链上的羟基、异咯嗪环上的两个 (O2)、
(O4)羰基氧原子及 (N1)、(N3)H与其邻近的氨基酸
形成非常复杂的氢键网络 [25]。Ludwig等 [26]还发现
FMNox在被还原为 FMNsq时还能够诱导 FMN结合
位点附近的氨基酸发生构象转变及结构重排，并建
立起新的氢键网络使 Fldsq更稳定。另外，还原态
的 FMN在质子化的 (N5)H上也可以与邻近的氨基
酸建立起一些新的氢键连接稳定 Fldsq，且野生型的
Fldsq形成的氢键强度最大
[27-29]。
由于这三种氧化还原状态 FMN的稳定性具
有显著的差异，所以，分别形成了 Fldox/sq的氧化还
原电势 E2和 Fldsq/hq的氧化还原电势 E1。自由的
FMNsq相对于 FMNox和 FMNhq是不稳定的，所以
其 E2=-238 mV低于 E1=-172 mV。虽然不同来源图2 Fld中FMN结合位点的芳香族氨基酸指向[21]
卢明锋，等：黄素氧化还原蛋白研究进展第10期 1125
Fld的氧化还原电位各不相同，但其共同特征是具
有稳定的 Fldsq和相对不稳定的 Fldox、Fldhq态，因此，
具有非常低的 E1 (-172~<-400 mv)和相对较高的 E2
(-50~-260 mv)，在生物体内能够以 sq/hq 作为单电
子转运中心逐个地传递电子。
5　展望
由于 Fld相对分子质量较小，所以，非常适合
采用定点突变结合核磁共振技术 (nuclear magnetic
resonance, NMR)或 X-ray技术研究蛋白质结构和功
能的关系。作为一个模型蛋白，对 Fld的研究也有
助于理解蛋白质稳定性、蛋白质折叠和蛋白质 -配
体识别途径、蛋白质结构与功能的关系等生物物理
学热点问题。由于 Fld 是 H. pylori的一种组成型蛋
白，所以，有望成为一种治疗 H. pylori感染的药物
靶点 [30]；在类囊体中过表达 Fld能够诱导抗氧化
代谢发生改变，延缓紫花苜蓿根瘤衰老，提高淀
粉的积累 [31]；在叶绿体中共表达 Fld和 FNR能够
增加植物对活性氧的耐受性，提高植物对逆境的
抗性 [32-34]。综上所述，Fld不但具有重要的理论研
究价值，而且具有极其重要的应用价值，值得进一
步深入研究。
[参　考　文　献]
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