全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 4期
2007年 8月
Vol. 19, No. 4
Aug., 2007
一种利用植物病毒载体表达外源蛋白的
新平台——Magnifection
杨正安1,3，丁玉梅2，张应华1，刘飞虎3*
（1 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201；2 云南省农业生物技术重点实验室，昆明 650223；
3云南大学生命科学学院，昆明 650091）
摘　要：本文介绍国内外在利用植物病毒表达载体生产药物蛋白的研究现状，并对这一领域取得的最
新突破进行重点阐述，包括Magnifection的原理、技术流程及利用其生产重组药用蛋白的优势、存在
的问题等。最后，结合相关经验介绍利用植物病毒表达载体生产药物蛋白的应用前景及对该技术改进
的建议。
关键词：M a gn i fec t i on；植物；病毒载体；瞬时表达
中图分类号：S432.41　　文献标识码：A
Magnifection: a new platform for expression of foreign protein
using a plant viral–based vector
YANG Zhengan1,3, DING Yumei2, ZHANG Yinghua1, LIU Feihu3*
(1 College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2 Key Lab of
Agricultural Biotechnology of Yunnan, Kunming 650223, China; 3 School of Life Sciences, Yunnan University,
Kunming 650091, China)
Abstract: This article reviews the current research status of expression of recombinant proteins using plant viral-
based vector, and more attentions are focused on the principle and the operation procedure of Magnifection
and its advantages and limitation for the production of recombinant pharmaceutical proteins，lastly, we
introduce its application in diverse aspects of understanding the mechanisms of RNA processing and nuclear
export in plant, gene replacement, gene insertion, epitope presentation, gene complementation and commercial
purpose. Our experiences in modification of the Magnifection technique are also provided.
Key words: Magnifection；plants；viral vector；transient expression
收稿日期：2006-12-23；修回日期：2007-04-02
基金项目：国家自然科学基金(30571275)；云南省自然科学基金(2004C0025Q)
作者简介：杨正安(1974 —)，男，博士研究生；刘飞虎(1958 —)，男，教授，博士生导师，* 通讯作者，E-mail:
plantbreed2004@yahoo.com.cn
文章编号 ：1004-0374(2007)04-0456-05
与采用农杆菌或基因枪法转化的稳定表达系统
相比，植物病毒瞬时表达系统[1-2]具有一定的优势，
该系统的优势主要表现在：第一，从载体构建到植
物表达的快速性；第二，病毒在植物中高水平复制
和系统侵染的能力。植物病毒表达系统的特性使植
物成为快速表达外源蛋白的一个“工厂”，但由于
病毒载体携带大片段基因的能力有限，造成了瞬时
表达系统的低侵染率，其应用受到了限制。最近，
·技术与应用 ·
457第4期 杨正安，等：一种利用植物病毒载体表达外源蛋白的新平台——Magnifection
Marillonnet等[3]对烟草花叶病毒(TMV)表达载体进行
了改进，他们删除了不能被RNA加工机构正确识别
的特征序列，同时在病毒MP(移动蛋白)区段增加部
分内含子，从而使有效侵染成为可能，绿色荧光蛋
白基因(gfp)在豌豆、黄瓜等 7种作物中得到了高效
表达，gfp基因在植物细胞个体中的表达百分率从
1.6%提高到了 53%，同时在拟南芥、油菜等 6个
物种也实现了 gfp基因的表达，该系统大幅度提高
了重组蛋白的表达效率，已经成为利用植株生产重
组蛋白的一个有潜力的新平台，他们将该技术体系
定义为“Magnifection”，本文主要介绍这一植物
病毒表达外源蛋白研究领域的最新进展。
1　利用植物病毒载体表达外源蛋白的研究现状
在世界范围内，利用植物生产药用蛋白或疫苗
的研究因其广阔的商业前景受到广泛的重视。转基
因植物药物的开发研究始于 20世纪 90年代初，据
不完全统计，国内外正在开发的医药活性多肽和疫
苗约在 150 种以上，其中有一部分药用蛋白是利用
植物基因工程手段生产的， 如一些具有药用价值的
蛋白或多肽, 包括白细胞介素、人的细胞因子、人
表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、人生
长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白
等。一些研究机构或公司已开始从这些药物蛋白的
生产中获得巨大的经济效益[4]。
植物外源基因的遗传转化与表达可以通过两种
方式：其一是稳定重组(农杆菌和基因枪介导)，外
源基因转入植物核基因组或质体基因组后稳定表
达；其二是转基因瞬时表达体系，相对于稳定重
组，病毒载体表达外源蛋白具有简单、快速、低
成本、易于操作和表达量大的特点。利用植物病毒
表达载体在寄主植物中表达外源蛋白，尤其是生产
医用蛋白和疫苗具有重大的商业价值。最初成功的
例子是用 CaMV通过基因取代来表达人 α-D-干扰
素[6]，用 TMV通过基因插入表达 α-天花粉蛋白[7]。
采用抗原呈现策略：用 TMV表达了流感病毒血凝
素抗原疫苗、人免疫缺损病毒(HIV-1)膜蛋白抗原疫
苗、疟疾抗原疫苗等；用 TBSV表达了人免疫缺陷
病毒(HIV-1)V3环疫苗；用 CPMV表达了口蹄疫病
毒(FMDV) VP1疫苗和人鼻病-14(HRV-14)抗原疫苗
等。由于植物病毒对人不产生侵染，利用植物病毒
表达的疫苗可能可以通过口服来接种。
目前，利用植物病毒载体表达外源蛋白主要有
两种策略：一种是将病毒基因组 cDNA通过基因取
代、基因插入、融合抗原或基因互补等手段[7]，加
入外源基因后，置于 T7、λP m、S P 6、T3 等原
核启动子下游，通过体外转录得到 RNA，由 RNA
侵染植物体或直接用基因枪将病毒载体转入植物产
生侵染，该法的缺点是较为昂贵和繁琐。目前，已
利用烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯 X病毒(PVX)、
豇豆花叶病毒(CPMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、李
痘病毒(PPV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、小麦黄花叶
病毒(WYMV)等构建了表达载体，并进行了体外转
录侵染的实验。另一种策略则将病毒基因组 cDNA
置于Act2、CaMV35S等真核启动子下游，采用农
杆菌接种法侵染寄主植物，该法较为简便。Turpen
等[8]于 1993年将农杆菌接种法引入植物病毒表达载
体对植物进行侵染，他们在 TMV的 cDNA 5端加
上 CAMV35S启动子，3端加上人工合成的核酶序
列，将野生型与改进后的病毒载体导入农杆菌，对
烟草进行侵染，结果改进后的病毒载体对植物体的
侵染效率提高了两倍，初步证明病毒载体采用
“农杆菌接种法”可对植物体产生侵染。Jia等[9]将
TMV的 cDNA置于 CaMV 35S启动子和终止子之
间，再将整个表达框架插入到农杆菌T-DNA的左边
界和右边界之内，构建质粒 p35S-30B:GFP，采用
农杆菌接种法侵染本生烟(Nicotiana benthamiana)，
在所转化的烟草中，GFP蛋白量占细胞总可溶性蛋
白的 5.2%，产生了较好的表达水平。总之，农杆
菌侵染法的外源基因表达水平较低，仅有少量的植
物细胞被侵染且只有少量的蛋白产生。最近，
Marillonnet等[3]对传统的TMV 病毒表达载体进行改
进，结合农杆菌接种法，外源蛋白的表达达到了令
人满意的水平，有望用于工业化生产外源蛋白，使
Magnifection成为外源蛋白表达的一个新平台。
2　植物病毒载体表达外源蛋白新突破
2.1　Magnifection的载体策略及技术改进　野生型植
物病毒具有初始的寄主感染，核酸复制、蛋白翻
译、病毒粒子装配、胞间扩散、长距离传播、基
因沉默抑制等功能，但在表达载体中，这些功能并
不是必不可少的，相反，需要增加一些新的功能，
如同源基因的高水平表达。目前，在发展理想的病
毒载体方面，有两种载体构建策略：第一种体系是
采用携带和表达目的基因的野生型植物病毒——
“全病毒”载体策略，该策略的研究重点是保持病
毒载体的敏感性，尽管病毒携带和表达外源基因，
但病毒仍能保持较强的敏感性、稳定性和对其寄主
458 生命科学 第19卷
植物的毒性；第二种体系是“解构病毒”载体策
略，该策略去除了病毒的限制因子(如寄主特异或
限制因子)和不需要的基因功能(如制造感染病毒粒子
的功能)，将TMV cDNA插入农杆菌T-DNA区段中
间，同时加上植物强启动子和终止子，病毒载体既
整合了植物病毒在植物细胞内扩增和胞内运动的机
制，又能利用农杆菌对植物体进行系统侵染，通过
病毒载体在植物体内的复制和扩增，从而增加了外
源基因的数量，达到外源基因高效表达的目的，
Magnifection就属于该载体策略[2]。
Gleba等[2,11]和Marillonnet等[3,10]认为以往的农杆
菌接种法侵染和外源蛋白表达效率低的原因可能是
农杆菌将野生型的 TMV cDNA带到植物细胞核后，
在转录过程中，隐藏的或经拼接的病毒mRNA序列
不能被植物细胞内的RNA加工机构所识别和正确加
工，限制了病毒载体在植物体内的复制和传播。此
外，大片段的病毒载体(未经改造的带 gfp基因的病
毒载体可达 7.6 kb)和没有内含子的基因很难被植物
细胞的RNA加工和运输机构识别，限制了病毒的复
制和扩增。为了提高农杆菌接种法的侵染和表达效
率，他们对 TMV载体进行了两种改进(图 1) ：(1)
删除不能被植物细胞 RNA加工机构识别的特征序
列，他们搜索病毒RNA潜在的隐藏拼接位点和富集
胸腺嘧啶的类内含子序列(图 1 a 中的细线部分及
oligo dT)，删除这些序列后，植物细胞被病毒侵染
的百分率从 1.6%增加到了 13%，在所侵染的植物
细胞中，有 53%的植物细胞表达了GFP蛋白，GFP
蛋白的表达量从3.3个荧光单位增加到了53.3个荧光
单位；(2)在 RdRp和MP区段中增加部分内含子(图
1b中的粗黑线部分)，内含子的增加，进一步增加
了病毒复制和感染的效率，在烟草细胞中，感染区
内的 90%以上的植物原生质体表达了GFP蛋白。同
图2　Magnifection技术流程
图1　TMV农杆菌侵染载体改进示意图
注：a: 未改进的载体侵染植物叶片产生少量 GFP蛋白荧光；b: 改进的载体侵染植物叶片产生大量 GFP蛋白荧光；RB: T-
DNA右侧序列；Act2: 拟南芥Act2启动子；RdRp: 复制酶基因区段；MP: TMV移动蛋白；GFP: 绿色荧光蛋白；N: TMV
3’端UTR；T: Nos终上子；LB: FDNA左侧序列(黑色: 绿色荧光；白色: 植物叶片颜色)
459第4期 杨正安，等：一种利用植物病毒载体表达外源蛋白的新平台——Magnifection
时，病毒载体的寄主范围得到了扩大，在所实验的
5 0 个双子叶植物中，豌豆、黄瓜、向日葵、红
甜菜、菠菜、头状藜、番杏 7 个种类具有良好的
表达效果，在拟南芥、油菜和独行菜等 6个种中检
测到了 GFP表达。
2.2　Magnifection的技术流程　Magnifection结合了
当前三种生物技术的优势：农杆菌对植物高效和系
统的转化能力；病毒载体快速和高量表达外源蛋白
的能力；以植物为寄主生产蛋白的高容量和低成本
特性。技术流程主要包括载体的改造构建、农杆菌
的培养及稀释、真空渗透 3个主要步骤(图 2)。首先
构建携带有T-DNA编码的病毒表达载体，然后将该
载体转化农杆菌，农杆菌培养和稀释后侵染成熟植
物体。其中，农杆菌担任初始的侵染功能，而病
毒载体承担胞内扩散、扩增和高水平表达的功能。
2 .3　Magnifect ion表达外源蛋白的优势　利用
Magnifection技术生产药用蛋白有以下优势：(1)快
速的研发和生产过程。利用Magnifection生产重组
蛋白，只受到载体构建和病毒扩增时间的限制，可
在 3－ 4周内获得mg级或 g 级的蛋白产量。按照
比例，生产 100 kg重组蛋白则只需约 1年时间，这
是传统转基因植物生物技术不可能达到的。(2)外源
蛋白的高量表达。采用Magnifection技术，每千克
新鲜叶片可产生高达 5 g的外源蛋白。在植物体
内，目的蛋白占多数，给重组蛋白的分离和提纯带
来了极大的便利。(3)成本低廉。由于所需要的植物
原料和细菌量少，加上Magnifection技术体系的高
量表达使得重组蛋白的纯化成本降低，且植物能被
成批地种植和侵染，整个生产过程能以流水线的方
式在一个温室中完成，一个占地 1 hm2的温室每年
能生产 500 kg的重组蛋白，与转基因植物或第一代
病毒载体侵染烟草相比，后者需要 1 000倍以上的
空间。(4)通用性。迄今为止，已采用Magnifection
系统对10余个蛋白进行了试验，其中包括生理中性
蛋白、高毒力的蛋白和酶、单链抗体、抗原、细
胞因子，激素等(表 1)。在这些试验中，都是以烟
草作为寄主，其中，生长激素产量为 1.2 g/kg、α-干
扰素为 5.1 g/kg、细菌抗原为 5.4 g/kg、单链抗体
为 0.4－ 1.5 g/kg。同时，Magnifection技术也能用
于其他作物种类。( 5 )生物安全性高。首先，由于
Magnifection外源蛋白表达量高，能在一定的封闭
的设备或设施中生产大量的药用蛋白，具有较高的
生物安全性；其次，载体采用“解构病毒”策略
构建，很难再生野生型的重组病毒；第三，烟草
不作为饲料和食物，进一步增加了生物安全性。(6)
低商业化风险。虽然Magnifection的应用仅有少数
实例(表 1)，但大量的植物表达体系已证明植物表
达抗体和疫苗是成功的[16-17]，且在成功的例子中，
大多数是采用植物病毒载体进行。此外，采用
Magnifection进行的实验与采用“全病毒”策略的
表达结果在表达数量、重组蛋白质量和其他的植物
细胞代谢是一致的，这些都说明Magnifection具有
极低的商业化风险。
3　存在的问题
3.1　糖基化问题　绝大多数药用蛋白在天然状态下
为糖蛋白，蛋白糖基化作为真核生物细胞中常见和
复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意
义。同其他的植物表达系统一样，Magnifection系
统也存在转录后糖基化修饰的问题，虽然在植物细
胞内重组外源蛋白也能够完成糖基化修饰过程，但
转基因植物所生产的药用糖蛋白糖链与天然糖蛋白
糖链在蛋白活性上存在着很大差异，由此在临床应
用中产生非预期的免疫应答反应。目前，Magnifec-
tion平台在这方面的研究较少，解决的办法是对侵
染后产生的重组蛋白进行评价。
3.2　部分外源基因的低水平表达　与其他的表达系
统一样，Magnifection也出现了部分外源基因不能
高表达的现象。利用Magnifection在植物中表达 B
型肝炎表面抗原(HBsAg)时，表达产物对寄主细胞
产生了较强的毒性，从而限制了基因的高量表达。
同微生物寄主的发展过程一样，通过对基因、载体
和生产寄主的改变，基因表达或许能发生改善。
表1　Magnifection系统基因表达的测试
分类 商业应用
激素类 干扰素、生长激素、集落刺激因子[ 1 2 ]　
抗体类 单克隆抗体、单链抗体、抗原融合物[ 1 3 ]
抗原类 细菌抗原、病毒抗原、抗原突变及融合物、佐剂、epitope carriers[ 14 ]
酶制剂 动物、植物、微生物和病毒的酶及酶抑制剂[ 1 2 ]
其他类 超过 5 0 种人类、动物、植物、细菌、病毒的蛋白
460 生命科学 第19卷
3.3　生产寡聚复合蛋白(Oligomultimeric protein)问题
　利用病毒载体来表达两个或更多的多聚肽，是
Magnifection是最具有挑战性的工作，如在生产寡
聚复合蛋白——IgG抗体，表达水平很低。Marillonnet
等[3]已发展了几个有效的策略(例如在基因内部加上
内含子等)来改进该寡聚复合蛋白的表达水平，但
表达水平仍不能令人满意。
4　展望
Magnifection作为植物病毒载体表达外源蛋白的
一个新平台，可应用于基础研究领域，如 RNA加
工机制和核内运输的基础研究[18]、病毒病理学研
究、基因表型研究、基因沉默研究等。而最有价
值的用途是用于商业化生产一些蛋白质或多肽，尤
其是在抗体的研究和生产领域具有较大应用前景，
其快速的研发和生产过程[14,19]决定了其能用于具有时
效限定的特异抗体类型，如生产流感抗体等。同
时，由于其极低的生产成本，Magnifection平台也
有望成为发展中国家可接受疫苗的源头。此外，在
生产特种药品(如非何杰金淋巴瘤抗独特型单链抗体
scFv)方面，Magnifection平台也具有较大优势，它
的意义在于缩短了从DNA到患者的时间。
当然，该技术仍需进一步完善，我们认为应
从几个方面进行考虑：第一，采用增加内含子，
碱基替换、DNA Shuffling[20]及基因突变等多种策略
对病毒MP(移动蛋白)基因区段进行改进，进一步扩
大农杆菌接种和病毒寄主范围，为口服疫苗的开发
打下基础；第二，寻找新的更便于操作的病毒载
体，使之分子量更小，侵染效率更高，更易于进
行基因操作；第三，对重组蛋白的糖基化修饰进行
研究，提升药用蛋白的功能药效；最重要一点，
我们认为应对外源蛋白的纯化进行研究，如在载体
构建时加入His或GST等标签，再利用相应的分离
介质进行纯化，进一步降低从植物中提取药用蛋白
的生产成本。总之，要使Magnifection技术应用于
生产，需要植物病毒学、基因工程学、生物物理
学、免疫学等多学科的合作，随着研究的不断深
入，相信Magnifection技术一定会在基础研究和应
用研究中发挥愈来愈重要的作用。
[参　考　文　献]
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