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Stabilities of saffron pigments produced by in vitro cell culture of Crocus sativus L.

离体培养藏红花细胞合成的藏红花色素稳定性



全 文 :第 13卷第 2期
2015年 3月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 13 No􀆰 2
Mar􀆰 2015
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2015􀆰 02􀆰 008
收稿日期:2014-04-08
作者简介:扶文君(1990—),女,江苏宜兴人,硕士研究生,研究方向:植物细胞工程;袁丽红(联系人),教授,E⁃mail:yuanlihong@ njtech.edu.cn
离体培养藏红花细胞合成的藏红花色素稳定性
扶文君,袁丽红
(南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800)
摘  要:研究 pH、温度、光照、氧化剂、还原剂、食品添加剂和金属离子对离体培养的藏红花细胞合成的藏红花色素
稳定性的影响,并与藏红花柱头色素进行比较。 结果表明:藏红花细胞合成的色素与柱头色素均为水溶性色素,呈
亮黄色,对食品添加剂(食盐、柠檬酸、蔗糖、苯甲酸钠)和 H2O2表现出良好的稳定性。 与柱头色素相比,藏红花细
胞合成的色素对强酸(pH 1)、高温(80、100 ℃)和光照(日光灯光、紫外光)表现出更好的稳定性,对 VC和 Cu2

(0􀆰 001 mol / L)的稳定性略差。 稀碱溶液(0􀆰 47 mol / L Na2CO3、0􀆰 1 mol / L NaOH)、Na2 SO3、Fe2
+(0􀆰 050 mol / L)和
Fe3+能使细胞合成的色素色强增强。
关键词:藏红花;藏红花色素;离体培养;稳定性
中图分类号:Q943􀆰 1        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2015)02-0041-06
Stabilities of saffron pigments produced by in vitro cell culture of Crocus sativus L􀆰
FU Wenjun,YUAN Lihong
(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)
Abstract:The effects of pH,temperature,light,oxidant,reductant,food additives and metal ions on the
stabilities of saffron pigments produced by Crocus sativus cells were investigated,and their stabilities were
also compared with those of pigments from saffron stigma. The results showed that they were all water⁃
solubleand bright yellow. They were stable to food additives and H2 O2 . Compared with saffron stigma
pigments,saffron pigments produced by cell culture were more stable to strong acid ( pH 1), high
temperature(80 ℃,100 ℃) and light( incandescent light,UV),and less stable to VC and Cu2
+(0􀆰 001
mol / L)􀆰 The coloring power of saffron pigments produced by cell culture could be increased by dilute
alkaline solutions(0􀆰 47 mol / L Na2CO3,0􀆰 1 mol / L NaOH),Na2SO3,Fe2
+(0􀆰 050 mol / L) and Fe3+ .
Keywords:Crocus sativus L.; saffron pigments; in vitro culture; stabilities
    藏红花(Crocus sativus L􀆰 )又名番红花、西红花,
为鸢尾科植物,由于藏红花柱头中主要成分藏红花
苷(crocin)具有较好的水溶性和极强的着色力,藏
红花醛(safranal)具有独特的香味,因此,藏红花可
作为珍贵的调味剂、香料和染料[1-2]。 近年来,研究
人员通过医药学研究发现藏红花在抗肿瘤[3]、免疫
调节[4]、治疗心脑血管系统疾病[5]和抗抑郁[6]等方
面亦具有良好功效。
植物细胞培养技术的建立和发展为解决藏红花资
源短缺提供了一条有效途径。 国内外已开展藏红花细
胞培养生产藏红花色素的研究,并取得了一定进展。
陈书安、Dufreshe等[7]和孟风来等[6-8]对藏红花细胞的
悬浮培养进行了研究,发现培养20 d后细胞生物量为
12􀆰 3 g / L(以细胞干质量计),28 d 藏红花素含量和产
量分别为 95􀆰 8 mg / g 和 0􀆰 92 g / L。 Dufresne 等[7]利用
藏红花细胞葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase)进行
藏红花酸(crocetin)糖基化,在培养 12 d 的 100 mL细
胞培养物中加入 30 mg藏红花酸,发现培养 4 d可转化
形成 9 mg / g藏红花酸糖酯。
藏红花色素在贮存中受到环境中温度、pH和光
照等因素的干扰,直接影响色素的药用价值。 而藏
红花色素的主要成分为藏红花苷、藏红花苦素、藏
红花醛和一些类胡萝卜素类物质。 其中,类胡萝卜
素因具有不稳定性,而能发生直接化学氧化降解、
光氧化降解和热氧化降解[9]。 在自然界中植物代
谢产物糖基化现象普遍存在,通过糖基化化合物由
非结合态转化为结合态,可使稳定性增强[10]。
以藏红花球茎和幼芽为外植体诱导获得了性
状优良的细胞系[11],在此基础上对细胞性状进行调
控并建立了藏红花细胞悬浮培养体系,通过培养条
件优化和添加诱导子[12]等措施,发现藏红花细胞表
现出稳定的色素合成能力。 为评价离体培养藏红
花细胞合成的色素的应用潜力,本实验系统研究
pH、温度、光照、氧化剂、还原剂、食品添加剂以及金
属离子对其稳定性的影响,并与柱头色素进行比
较,以期为该色素资源的开发利用提供依据。
1  材料与方法
1􀆰 1  材料
藏红花球茎愈伤组织(橙黄色,质地疏松、不透
明),由笔者所在实验室诱导和筛选。 藏红花干柱
头,购于上海崇明岛。
1􀆰 2  试剂
NaOH、Na2CO3、H2O2、Na2SO3、VC、CuCl2、FeCl3、
FeSO4、Na2HPO4、甲醇、乙醇、乙醚、三氯甲烷、环己
烷、浓盐酸、食盐、柠檬酸、蔗糖和苯甲酸钠等,均为市
售分析纯。
1􀆰 3  仪器设备
BS 224S型电子天平,德国赛多利斯科学仪器
有限公司; FreeZone 2􀆰 5 型冻干机,美国 Labconco
公司;UV 2800 型紫外可见分光光度计,尤尼科
(上海)仪器有限公司;PHS 3C型 pH计,上海精科
仪器有限公司;电热恒温水浴锅和光照培养箱,上
海博迅有限公司仪器设备厂。
1􀆰 4  方法
1􀆰 4􀆰 1  藏红花细胞培养合成藏红花色素
将 MS培养基上(附加 2 mg / L 萘乙酸(NAA)、
0􀆰 5 mg / L 6 苄基嘌呤(6 BA)、30 g / L 蔗糖、6􀆰 5
g / L琼脂,灭菌前调 pH 6􀆰 0~ 6􀆰 1)培养 30 d 的藏红
花细胞接种于 1 / 2 B5 培养基(大量元素减半,附加
2 mg / L 吲哚乙酸( IAA)、0􀆰 5 mg / L 6 BA、20 g / L
蔗糖,灭菌前调 pH 6􀆰 0~ 6􀆰 1),接种量为 100 mL 培
养基接种 15 g细胞,(21 ± 0􀆰 5) ℃振荡培养 28~30
d后收获,转速为 150 r / min。 收获的细胞培养物于
4 ℃、8 000 r / min 离心 15 min,用去离子水洗涤 2
次,收获细胞并冻干。
1􀆰 4􀆰 2  色素溶解性的测定
分别称取等量冻干细胞和柱头于 5 mL 容量瓶
中,加入蒸馏水、无水甲醇、体积分数 50%甲醇、无
水乙醇、体积分数 50%乙醇、乙醚、三氯甲烷、环己
烷、0􀆰 1 mol / L NaOH、 0􀆰 47 mol / L Na2 CO3 和 0􀆰 1
mol / L HCl 等溶剂,观察色素在不同溶剂中的溶解
性及溶液颜色。
1􀆰 4􀆰 3  色素母液配制
分别称取一定量冻干细胞和干柱头于容量瓶
中,加蒸馏水浸提 48 h后过滤并定容至 1 L,即得色
素母液。
1􀆰 4􀆰 4  色素光谱特性的测定
测定色素母液在 200 ~ 600 nm 的紫外 可见吸
收光谱。
1􀆰 4􀆰 5  pH对色素稳定性的影响
取 5 mL细胞合成的色素母液和柱头色素母液,
分别加入 5 mL pH 3、5 和 7 的 0􀆰 1 mol / L 柠檬酸-
0􀆰 2 mol / L Na2HPO4 缓冲液,pH为 9 的 0􀆰 05 mol / L
硼砂 0􀆰 2 mol / L 硼酸缓冲液, pH 为 11 的 0􀆰 1
mol / L NaOH -0􀆰 05 mol / L Na2HPO4 缓冲液及 0􀆰 1
mol / L HCl,混匀,静置 2 h 后观察颜色并在 440 nm
处测吸光值;以加入 5 mL蒸馏水作对照。
1􀆰 4􀆰 6  温度对色素稳定性的影响
取等体积的细胞合成的色素母液和柱头色素
母液,分别置于 20、40、60、80 和 100 ℃的恒温水浴
锅中加热 1 h,在 440 nm处测吸光值。
1􀆰 4􀆰 7  光照对色素稳定性的影响
取等体积的细胞合成的色素母液和柱头色素
母液,分别放置于光照培养箱 (光照强度 15 000
lx)、避光和紫外灯(15 W)一定时间,在 440 nm 处
测吸光值。
1􀆰 4􀆰 8  氧化剂对色素稳定性的影响
取 5 mL细胞合成的色素母液和柱头色素母液,
分别加入 5 mL 0􀆰 33、0􀆰 66、0􀆰 99 mol / L H2O2溶液,
24 生  物  加  工  过  程    第 13卷 
室温下放置 2 h 后在 440 nm 处测吸光值;以加入 5
mL蒸馏水作对照。
1􀆰 4􀆰 9  还原剂对色素稳定性的影响
取 5 mL细胞合成的色素母液和柱头色素母液,
分别加入 5 mL 0􀆰 2、0􀆰 4、0􀆰 6 和 0􀆰 8 g / L Na2 SO3溶
液,1、2和 3 g / L VC溶液,室温下放置 2 h,在 440 nm
处测吸光值;以加入 5 mL蒸馏水作对照。
1􀆰 4􀆰 10  食品添加剂对色素稳定性的影响
取 5 mL细胞合成的色素母液和柱头色素母液,
分别加入 5 mL 10、20、30和 40 g / L食盐溶液,5、10、
15和 20 g / L柠檬酸溶液,20、40、60 和 80 g / L 蔗糖
溶液,0􀆰 5、1􀆰 0、1􀆰 5 和 2􀆰 0 g / L 苯甲酸钠溶液,室温
下放置 2 h,在 440 nm处测吸光值;以加入 5 mL 蒸
馏水作对照。
1􀆰 4􀆰 11  金属离子对色素稳定性的影响
取 5 mL细胞合成的色素母液和柱头色素母液,
分别加入 5 mL 0􀆰 001、0􀆰 005、0􀆰 01、0􀆰 05 mol / L CuCl2、
FeCl3和 FeSO4溶液,室温下放置 2 h,在 440 nm 处测
吸光值;以加入 5 mL 蒸馏水作对照。 为消除 Fe3+颜
色的影响,以相应浓度的 FeCl3溶液做参比。
1􀆰 4􀆰 12  数据分析
1􀆰 4􀆰 5~1􀆰 4􀆰 11试验色素稳定性以色素残存率
表示;上述所有试验结果均为 3 次重复实验所得的
平均值。
2  结果与讨论
2􀆰 1  色素的溶解性
表 1为藏红花色素溶解性实验结果。 由表 1 可
知:藏红花细胞合成的色素与柱头色素均溶于水和
含水溶剂中,并且在水中的溶解性极佳。 在稀碱溶
液中细胞合成的色素的色强增强,溶液呈橙红色。
在无水甲醇和无水乙醇中细胞合成的色素也表现
出一定的溶解性,而天然藏红花色素仅在无水甲醇
中表现出一定溶解性。 2种色素均不溶于非极性溶
剂或溶解性极差。 可见藏红花细胞合成的色素与
柱头色素均主要为水溶性色素。
2􀆰 2  色素的光谱特性
藏红花细胞合成的色素和柱头色素在紫外区
和可见光区均有吸收,但二者吸收特征具有一定差
异(图 1)。 由图 1 可知:细胞合成的色素在紫外区
吸收很强,并且明显强于可见光区的吸收,在 280 和
330 nm有 2 个显著的吸收特征峰,在 400 ~ 500 nm
可见光区也有吸收,但由于多个吸收峰的重叠未表
现出显著的吸收特征峰,且呈现出宽的吸收特征,
吸收则随波长的减少吸收增强。 柱头色素有 3个吸
收特征峰,分别为 254、330 和 440 nm。 此外,二者
都有末端吸收。
表 1  藏红花色素的溶解性
Table 1  The solubilities of pigments in different solvents
溶剂
柱头色素 细胞合成的色素
溶解性 溶液颜色 溶解性溶液颜色
蒸馏水 易溶 亮黄 易溶 亮黄
0􀆰 5%甲醇 溶解 亮黄 溶解 亮黄
0􀆰 5%乙醇 溶解 亮黄 溶解 亮黄
0􀆰 47 mol / L Na2CO3 溶解 亮黄 溶解 橙红
0􀆰 1 mol / L NaOH 溶解 亮黄 溶解 橙红
0􀆰 1 mol / L HCl 溶解 亮黄 溶解 亮黄
无水甲醇 溶解 淡黄 溶解 淡黄
无水乙醇 不溶 无色 溶解 淡黄
三氯甲烷 溶解 无色 微溶 略黄
乙醚 溶解 无色 不溶 无色
环己烷 微溶 略黄 不溶 无色
图 1  藏红花色素的紫外 可见吸收光谱
Fig􀆰 1  UV⁃Vis absorption spectra of pigments
藏红花苷在可见光区和紫外区均有吸收特征
峰。 糖酯键使藏红花苷在 260 nm 处具有第一个
吸收带;全反式类胡萝卜素类化合物使其在 400 ~
470 nm 处具有第二个吸收带,最大吸收波长为
440 nm;全顺式结构使其在 328 nm 处具有第三个
吸收带[13] 。 本实验中藏红花细胞合成的色素与柱
头色素在上述 3 个波长段均有吸收,含有主要物
质藏红花苷,但细胞合成的色素的紫外吸收很强。
可见,藏红花细胞合成的色素可能较天然色素成
分更复杂,色素中除了含有主要物质藏红花苷外,
34  第 2期 扶文君等:离体培养藏红花细胞合成的藏红花色素稳定性
还含有其他紫外吸收物质,与天然藏红花色素成
分存在差异。
2􀆰 3  pH对色素稳定性的影响分析
图 2为 pH对 2种色素稳定性影响的结果。 从
图 2可以看出,在不同 pH 溶液中 2 种色素稳定性
具有一定差异。 在 pH为 1 时细胞合成的色素的色
素残存率为 90􀆰 0%,柱头色素残存率只有 45􀆰 2%,
说明细胞合成的色素在 pH 为 1 时的稳定性优于柱
头色素。 在 pH 3~11范围内柱头色素比较稳定,色
调均为亮黄色。 柯贵珍[13]报道了在 pH为 11、12溶
液中天然藏红花色素溶液吸光度明显增加的现象,
而本研究中柱头色素在碱性条件下比较稳定,但未
表现出增色现象,这可能与藏红花柱头的来源(产
地、质量)有关。 细胞合成的色素在 pH为 1~5范围
内比较稳定,色调为亮黄色,但在中性到碱性条件
下具有显著的增色效应,并且增色效应随碱性的增
强而增强,在 pH= 7的缓冲液中呈橙黄色,在 pH 为
9或 11缓冲液中呈橙红色。
图 2  pH对色素稳定性的影响
Fig􀆰 2  Effects of pH on stabilities of pigments
图 4  光照对色素稳定性的影响
Fig􀆰 4  Effects of light on stabilities of pigments
2􀆰 4  温度对色素稳定性的影响分析
温度对 2 种色素稳定性的影响,结果见图 3。
从图 3可以看出:温度对 2 种色素的稳定性影响不
同。 20~60 ℃柱头色素残存率变化不大,具有一定
的热稳定性,但随温度的升高,80 和 100 ℃色素残
存率明显下降。 高丽等[14]也报道了栀子黄色素(主
要成分为藏红花苷)具有一定耐热性。 细胞合成的
色素随温度的升高色强增强,100 ℃色素残存率为
115􀆰 9%。 说明高温对藏红花细胞合成的色素具有
明显的增色作用。
图 3  温度对色素稳定性的影响
Fig􀆰 3  Effects of temperature on stabilities of pigments
2􀆰 5  光照对色素稳定性的影响分析
光照对色素稳定性的影响,结果见图 4。 从图 4
(a)可以看出:在日光灯光照下,柱头色素对光极不
稳定,褪色严重,放置 3 d 后色素残存率只有
12􀆰 8%;细胞合成的色素在放置 11 d 过程中色素残
存率呈逐渐下降趋势,但变化幅度不大,未见明显
褪色现象,11 d 后色素残存率仍达 78􀆰 6%。 说明细
胞合成的色素对光的稳定性明显优于柱头色素。
从图 4(b)可以看出:在避光条件下,柱头色素
残存率逐渐下降,但较日光灯光照下稳定,11 d 色
素残存率仍有 61􀆰 6%。 细胞合成的色素变化不大,
且色强略有增强,11 d 后色素残存率为 104􀆰 5%,说
明在避光条件下细胞合成的色素稳定性优于柱头
44 生  物  加  工  过  程    第 13卷 
色素。
从图 4(c)可以看出:在紫外光照射下,柱头色
素残存率呈逐渐下降趋势,变化没有日光灯光照下
明显,但比避光条件下变化幅度大,6 d 后色素残留
率为 62􀆰 1%;而细胞合成的色素放置 3 d 后色强明
显增强,色素残存率为 125􀆰 5%,之后变化幅度不
大,6 d后色素残留率为 124􀆰 9%。 可见,细胞合成的
色素对紫外光亦表现出良好的稳定性。
2􀆰 6  氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响分析
图 5为氧化剂和还原剂对 2种色素稳定性的影
响结果。 从图 5(a)可以看出:加入 H2O2后,2 种色
素残存率略有下降,但加大浓度后 2 种色素均表现
出良好的稳定性,加入 0􀆰 99 mol / L H2O2后细胞合成
的色素与柱头色素的色素残存率仍达 90􀆰 9%和
91􀆰 4%。 从图 5(b)、5(c)可以看出:还原剂 Na2SO3
和 VC对 2种色素的稳定性影响不同。 Na2SO3和 VC
对柱头色素稳定性没有明显影响,但 Na2SO3对藏红
花细胞合成的色素具有显著的增色作用,并且增色
效应随Na2SO3浓度提高而增强;VC使细胞合成的色
素的色素残存率有一定降低,并且在 1 ~ 3 g / L 实验
浓度范围内色素残存率基本一致,说明还原剂对细
胞合成的色素稳定性影响与还原剂种类有一定
关系。
2􀆰 7  食品添加剂对色素稳定性的影响分析
图 6为食品添加剂对 2种色素稳定性的影响结
果。 由图 6 可知:食盐、柠檬酸、蔗糖和苯甲酸钠对
细胞合成的色素和柱头色素稳定性影响不大,2 种
色素对 4种食品添加剂均表现出良好的稳定性。
图 5  氧化剂和还原剂对色素稳定性的影响
Fig􀆰 5  Effects of oxidant and reductant on stabilities of pigments
图 6  食品添加剂对色素稳定性的影响
Fig􀆰 6  Effects of food additives on stabilities of pigments
54  第 2期 扶文君等:离体培养藏红花细胞合成的藏红花色素稳定性
2􀆰 8  金属离子对色素稳定性的影响
图 7 为金属离子对 2 种色素稳定性的影响结
果。 由图 7 可知:Cu2+、Fe2+、Fe3+对 2 种色素稳定
性影响具有一定差异。 Cu2+对柱头色素的影响不
大,残存率基本不变,在 98􀆰 0% ~102􀆰 0%范围。 细
胞合成的色素在低浓度的 Cu2+(0􀆰 001 mol / L)溶
液中色强下降,色素残留率为 86􀆰 0%,但在 0􀆰 005、
0􀆰 010 和 0􀆰 050 mol / L Cu2+溶液中表现出良好稳定
性,色素残存率为 94􀆰 2% ~ 99􀆰 2%。 在 0􀆰 001、
0􀆰 005 和 0􀆰 010 mol / L Fe2+溶液中,2 种色素表现
出良好的稳定性;但在高浓度 Fe2+(0􀆰 050 mol / L)
溶液中,2 种色素色强都明显增强,细胞合成的色
素与柱头色素的色素残存率分别为 159􀆰 8%和
138􀆰 6%。 柱头色素对 Fe3+极不稳定,色素色强明
显下降,色素残存率为 18􀆰 9% ~35􀆰 2%。 但细胞合
成的色素对 Fe3+表现很好的稳定性,且具有极强
的增色效应,增色效应随 Fe3+浓度提高而增强,色
素残存率为 152􀆰 5% ~175􀆰 2%。
高丽等[14]、郝金声等[15]分别研究了 Cu2+对栀
子黄色素和密蒙花黄色素稳定性的影响,发现色素
的吸光值随 Cu2+浓度增加而增加,并未表现出本实
验中低浓度 Cu2+对色素影响的效应。 因此关于低
浓度 Cu2+对细胞合成的藏红花色素稳定性影响的
原因有待进一步探讨。
图 7  金属离子对色素稳定性的影响
Fig􀆰 7  Effects of metal ions on stabilities of pigments
3  结论
藏红花柱头色素对 pH 3 ~ 11 碱性溶液、H2O2、
Na2CO3、VC、食盐、柠檬酸、蔗糖、苯甲酸钠、Cu2
+和
Fe2+(0􀆰 001、0􀆰 005、0􀆰 010 mol / L)稳定性较好,但对
pH 1、高温(80、100 ℃)、光照(日光灯光、紫外灯
光)和 Fe3+稳定性差。
与藏红花柱头色素相比,离体培养藏红花细胞
合成的色素在 pH 1、高温(80、100 ℃)、光照(日光
灯光、紫外灯光)条件下的稳定性更佳。 细胞合成
的色素在稀碱 ( 0􀆰 47 mol / L Na2 CO3、 0􀆰 1 mol / L
NaOH)、Na2SO3、Fe2
+(0􀆰 05 mol / L)和 Fe3+溶液中色
强增强,对 VC和 Cu2
+(0􀆰 001 mol / L)的稳定性略差。
说明离体培养细胞合成的藏红花色素表现出更加
优良的稳定性,尤其对强酸、高温和光照的表现更
佳,可为该色素的应用提供一定的依据和帮助。
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(责任编辑  荀志金)
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(责任编辑  周晓薇)
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