全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 18卷 第 1期
2006年 2月
Vol. 18, No. 1
Feb., 2006
RNA干扰及其抗病毒应用的可行性探讨
沈哲旎， 罗志娟*
（四川大学华西医学中心基础与法医学院，成都 610041）
摘　要： RNA干扰是存在于动植物细胞中的，由双链 RNA介导的，序列特异性的mRNA降解过程。
在哺乳动物细胞里，RNAi可以由 21~25个核苷酸长度的双链小干扰 RNA（siRNA）触发。目前，以
RNAi为策略来抑制病毒复制的方法已获得了巨大成功。但 RNAi具有高度序列特异性，而多种病毒，
如HIV-1、HBV A等却具有迅速变异的倾向。本文就病毒进化出的多种逃避RNA干扰的机制以及如何
降低病毒对 RNAi的耐受力等问题进行了多方面的探讨。
关键词：R N A 干扰；基因沉默；s i R N A；抗病毒
中图分类号：R 3 4　　文献标识码：A
RNA interference and its feasibility in antiviral use
SHEN Zhe-Ni, LUO Zhi-Juan*
(Department of Medical Science, West China Center of Medical Sciences, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstract: RNA interference (RNAi) is the process by which double-stranded RNA(dsRNA) directs sequence-
specific degradation of mRNA in animal and plant cells. In mammalian cells, RNAi can be triggered by 21~25
nucleotide duplexes of small interfering RNA (siRNA). Strategies to inhibit virus multiplication based on the
siRNAs have gained great accomplishment. But the high sequence specificity of RNA interference, combined
with the tendency of the viruses such as HIV-1, HBV A, to rapidly generate sequence variability and their tendency
to change their secondary structure or secrete resistant proteins,indicates that these viruses are easy to evolve
resistance to RNAi.In this article,the author probe into these problems and bring up some resolvents to these
problems.
Key words: RNAi；gene scilencing；siRNA；antivirus
文章编号 ：1004-0374(2006)01-0041-04
收稿日期：2005-07-06；修回日期：2005-09-15
基金项目：“四川大学人才引进基金”资助项目
作者简介：沈哲旎（1 9 8 3 —），女，硕士研究生；罗志娟，女，教授，硕士生导师，* 通讯作者。
1　RNAi的机制
经过科研人员数年的努力，现在 R N A 干扰
(RNA interference, RNAi)的机制已经得到比较清楚
的阐述。
dsRNA介导的同源靶mRNA的RNAi分三步进
行[1~3]: 首先，细胞内 RnaseⅢ样核酸内切酶(Dicer
酶)在ATP供能条件下，将长的双链 RNA(dsRNA)
切割加工成21~25nt的由正义和反义链组成的小片段
双链 RNA——小干扰 RNA(small interferring RNA，
siRNA)。然后，siRNA在ATP参与下被 RNA解旋
酶解旋为两条单链，接着，在其中反义链的指导下
形成由 siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核
酸外切酶等多种成分组成的 RNA诱导沉默复合体
(RNA-induced silencing complex，RISC)，活化后
的RISC在单链siRNA引导下特异性识别并互补结合
同源mRNA序列，进一步将之切割。最后，被切
割成片段的mRNA再被核酸外切酶进一步降解，从
而在翻译水平干扰基因表达(图 1)。
4 2 生命科学 第18卷
除 dsRNA可介导同源靶 RNA的 RNAi外，一
种修饰后的mRNA——内源性小短暂RNA(small tem-
poral RNA，stRNA)也可作为 siRNA发挥基因沉默
作用。这种由 70nt发夹 RNA被 RnaseⅢ样核酸酶
切割加工成的 2 2nt 单链 s tR NA，虽然只是与靶
mRNA进行不完全互补，但足以从翻译水平阻抑基
因的表达[4](图 1)。
此外，基于对秀丽线虫 Caenorhabditis elegans
的研究发现，siRNA还可作为引物在 RNA依赖的
RNA聚合酶(RdRP)作用下，以靶mRNA为模板合
成新的 dsRNA。此长链 dsRNA同样可被RnaseⅢ样
核酸酶切割，降解而生成大量次级 siRNA进入第二
次切割过程，这种合成 - 切割的循环过程放大了
R N A i 作用，因而被称为随机降解性( r a n d o m
degradative) PCR(图 1)。
2　RNAi抗病毒作用的实验可行性
自从发现机体本身就存在RNAi可对抗侵入性遗
传因子(如病毒、转座子、转基因等)的作用，抑
制其循环复制从而减弱其基因毒性作用后，RNAi
就作为一种新型抗病毒法被寄予厚望；但人体自发
的 RNAi效应较微弱，难以彻底消除病毒。最近科
研人员就将人工RNAi技术用于多种人类病毒性疾病
的治疗研究中，均取得了可喜的实验结果，如特异
性针对人类免疫缺陷病毒(HIV)CD4受体，以及HIV
辅助受体CXCR4和CCR5的 siRNA，进行抗HIV的
RNAi实验研究均有良好效果[5~6]; 特异性针对HBV[7]、
HCV[8] 以及HDV[9] RNA的siRNA对肝炎病毒复制的
抑制作用和抑制肝炎病毒抗原表达的作用也得到了
证实。此外，针对高致死性流感病毒A型基因组中
编码核蛋白和核酸多聚酶的高度保守区域的
siRNA[10]; 针对随机选取的 SARS病毒基因组靶序列
的siRNA[11]; 针对人乳头瘤病毒HPV E6和E7 mRNA
的siRNA[12]; 针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或
编码病毒聚合酶的mRNA的 siRNA；针对疱疹病毒
的ORF45-siRNA和 Rta-siRNA以及针对Rous肉瘤病
毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒等的 siRNA，
都成功地表现出了抗病毒功效。
3　RNAi的抗病毒作用面临的挑战
RNAi在抗病毒研究方面取得的多项成果提示了
该项技术应用于病毒性疾病治疗的突破性的意义，
但 RNAi疗法现在还面临着许多挑战。病毒基因组
除了通过最基础的，也是最早发现的基因组核苷酸
突变的方式来逃避 RNAi干扰外，可能已经进化出
其他的方式，如由病毒产生的蛋白质介导的屏蔽作
用、病毒核衣壳介导的屏蔽作用和局部RNA二级结
构改变介导的屏蔽作用等方式，来逃避 RNAi。
3.1 　病毒基因组核苷酸的各种快速变异　在一些特
异性针对艾滋病毒核苷酸，同时又不影响宿主正常
生理活动的 RNAi的研究中，Jacque等[13]的结果显
示，通过 siRNA降解序列特异性的mRNA，可选
择性地抑制一些在HIV-1复制过程中起关键作用的
病毒蛋白，从而有效地靶向锚定清除进入机体的病
毒 RNA，同时未见有对 RNAi耐受的产生；但文
献14~16却报称在类似的实验中HIV病毒对RNAi产
生了耐受。
Boden等[14]构建了一个能持续稳定表达 ta t -
shRNA(以H1启动子驱动的含HIV-1tat基因特异序列
的短发卡 R NA)的细胞系，以持续稳定靶向锚定
HIV-1病毒基因组中表达重要的 tat蛋白的 tat基因。
以 100 TCID50的HIV-1NL4.3攻击该细胞系，并维持
2个月，每周检测上清液中的 p24抗原含量。与对
照组相比，前 3周 p24抗原量下降了 95％，但从第
25天起，上清液中 p24抗原量又开始上升，提示
细胞系中 tat-shRNA的抗病毒活性可能已丢失。为
证实HIV-1是否的确产生了逃避 RNA干扰的机制，
他们用 PCR扩增了从细胞中提取的 tat-shRNA的靶
点并对其测序。结果发现，在前 3 周，该序列与
tat-shRNA一致，但是从第 25天起，病毒的第 9位
核苷酸发生了突变，使对应的苏氨酸变成了丝氨
酸，从而证实了HIV-1NL4.3确实产生了逃避 RNA干
扰的机制。类似结果也见于Hu等 [15]以及Surabhi等[16]
的报道。
不同实验结果的差异性可能是因为不同实验室
的 siRNAs瞄准的是病毒基因组的不同区域。文献
图1 dsRNA介导的RNAi作用机制示意图
4 3第1期 沈哲旎，等：R NA干扰及其抗病毒应用的可行性探讨
14~16的研究已经显示了HIV-1快速的复制动力学以
及其反转录过程中易发错误的特性，这些多变性会
降低，甚至消除 RNAi的抗病毒作用。
病毒基因组核苷酸突变不仅包括单碱基变异、
多碱基变异，还包括碱基缺失等，这种强变异现象
不仅存在于HIV病毒对 RNAi的反应中，还存在于
多种病毒，如 HBV、HCV等对 RNAi的反应中。
3 . 2　病毒产生蛋白质介导的 R N Ai 屏蔽作用　
Delgadillo等[17]报道：人流感病毒A型能产生一种名
为NS1的蛋白，这种蛋白能以一种类似于烟草花叶
病毒P1/HC-Pro蛋白在植物中抑制RNAi的方式，抑
制实验细胞中的 RNAi效应。Li 等[18]则报道：羊瘙
痒病毒转染果蝇细胞后，可以通过一种其自身编码
的蛋白质B2蛋白的作用来抑制RNAi效应。又因为
B2蛋白在转基因植物中也抑制了 RNAi，所以这种
抗沉默的防御机制似乎还具有遗传保留性。此外，
有证据显示，在果蝇和植物中牛痘病毒以及人类的
流感病毒 B 和 C型也能各自编码抗沉默的蛋白质。
3.3　病毒核衣壳介导的 RNAi屏蔽作用　有报道显
示 Rous肉瘤病毒能够通过其核衣壳的介导来屏蔽
siRNA的识别和攻击，由此，使进入细胞的病毒逃
避 RNAi的降解作用。类似的,艾滋病毒基因组中可
能也存在着这样一些能靠病毒核衣壳特异性屏蔽
RNAi的区域[19]。
3.4　局部RNA空间结构改变介导的RNAi屏蔽作用
　Westerhout等[20]更报道称HIV-1不仅能够通过突
变或删减 siRNA靶序列核苷酸的方式，或通过核衣
壳介导来逃避 RNAi介导的抑制效应，还能改变局
部 RNA的二级结构，通过改变空间结构的方式使
siRNA无法接近结合到靶mRNA上，进而无法启动
降解病毒 RNA的程序，如此将靶序列屏蔽于RNAi
的降解效应之外。
3.5　机制不明的 RNAi屏蔽效应　有的非侵害人体
病毒已经产生 RNAi抗性，但机制尚且不明。如芜
菁皱叶病毒(TCV)，学术界原认为其通过自身衣壳
蛋白(CP)，与一种疑为RNAi过程中必需成分的TCV
CP作用蛋白(TIP)进行相互作用，从而抑制RNAi效
应。但最新有报道称，TCV CP单个氨基酸的改变
或缺失根本不能降低其抗 RNAi的能力，甚至针对
其与TIP作用的关键区域的5个氨基酸缺失的突变也
不能解除其对 RNAi的抗性，只有在 TCV CP多个
区域的大片段的氨基酸缺失才能解除其对RNAi的抗
性。由此可见，芜菁皱叶病毒抗 RNAi现象不能以
其衣壳蛋白与 TIP 的作用来解释，也未发现有其
他，如基因序列改变、碱基对突变缺失或mRNA空
间结构改变等机制可解释这种抗性。虽然现在还没
发现感染人类的病毒有此类不明抗 RNAi机理，但
可能性和危险性显然是存在的。
4　针对RNAi抗性的一些解决办法
由于现在各种病毒针对RNAi进化出了耐受性，
要想使RNAi在抗病毒应用方面发挥出我们所期望的
持续效应就只能想更多的办法：设计针对在病毒入
侵机体过程中发挥了重要作用的宿主受体的RNAi；
设计更多的针对病毒基因组中高度保守区域的
siRNA；设计出能针对病毒空间结构的RNAi技术；
或构建能同时表达多个siRNA的RNAi表达系统，以
此来降低产生能逃避shRNA干扰作用的病毒突变体
的可能性。
例如：由于体内 CD4沉默可能限制 CD4阳性
T细胞在机体免疫反应中发挥正常功能。Martinez
等[21]指出：由于HIV辅助受体，如 CXCR4、CCR5
的变异不引起人的免疫功能严重损害，却可有效防
御HIV-1感染，因此，HIV的辅助受体是 RNAi锚
定的最佳目标。根据他们的研究：以 C X C R 4 -
siRNA转染 CXCR4+-U87-CD4+细胞 48h后，细胞
CXCR4表达降低到63％，CCR5-siRNA转染CCR5-
U87-CD4+细胞使CCR5表达降低到48％，进而有效
抑制了HIV感染，同时又不影响 CD4细胞的功能。
而 Jacque等[13]更进一步作了尝试：他们设计了
针对HIV-1基因数个区域的 siRNA，这些区域包括
T7增强子长末端重复序列(LTR)及辅助基因 vif和
nef。siRNA和HIV-1前病毒DNA共转染Magi细胞
24 h后，病毒复制减少 95％以上；当 siRNA转染
至外周淋巴细胞时，siRNA诱导特异序列降解，阻
止病毒中间体形成，抵御HIV感染细胞。此实验持
续长时间未见HIV-1对这种多重 RNAi产生抗性。
Wu等[22]则构建了一个可同时表达两种siRNA的
表达系统，这两种 21bp 的发夹 siRNA分别特异性
瞄准HBV的HBs 和 HBx 基因。将这个表达系统分
别克隆到Bel-7402和HepG2.2.15这两种已被HBV病
毒感染的细胞系中。结果显示：这两种 siRNA共
同作用的效应是使HBs 和HBx 两种基因的表达分别
下降了 83.7%和 87.5%。此外, 这两种 siRNA共同
作用还使HBc相关DNA的数量大幅下降，而这段
DNA一向被认为是HBV病毒胞内复制的主要介导基
因。不只如此，在细胞培养的上清液中的病毒DNA
4 4 生命科学 第18卷
也大幅减少。并且此实验同样也持续长时间未见
HBV对这种双重 RNAi产生抗性。
虽然有这些成功的尝试，但除了病毒本身进化
出耐受性的问题外，RNAi抗病毒治疗的载体安全
性，可能的非特异性干扰素反应等都还是尚待证实
和解决的问题，因此其造福于人类临床治疗的可行
性暂时还不大。
5　结语
RNAi技术的问世是生命科学发展史上的一大丰
碑，若能长期稳定应用于抗病毒治疗，无疑将造福
人类。虽然目前 RNAi技术在抗病毒的实验研究方
面已取得可喜成绩，但由于上述诸多问题的存在，
其应用于临床还有一段艰难漫长的道路。从理论和
技术两个层面来解决RNAi的分子基础及其治疗应用
问题任重而道远。
[参　考　文　献]
[1] Hannon G J. RNA interference. Nature, 2002, 418(6894):
244~251
[2] Matzke M, Matzke A J，Kooter J M. RNA: guiding gene
silencing. Science, 2001, 293(5532): 1080~1083
[3] Cerutti H. RNA interference：traveling in the cell and gain-
ing functions? Trends Genet, 2003, 19(1): 39~46
[4] Agami R. RNAi and related mechanisms and their potential
use for therapy. Curr Opin Chem Biol, 2002, 6(6): 829~834
[5] Novina C D, Murray M F, Dykxhoorn D M, et a1. siRNA
directed inhibition of HIV-1 infection. Nat Med, 2002, 8(7):
681~686
[6] Martinez M A, Clotet B, Este J A. RNA interference of
HIV-1 replication. Trends Immunol, 2002, 23(12): 559~561
[7] Shlomai A, Shaul Y． Inhibition of hepatitis B virus expres-
sion and replication by RNA interference. Hepatology, 2003,
37(4): 764~770
[8] Randall G, Grakoui A, Rice C M. C1earance of replicating
hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small
interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(1):
235~240
[9] Wong S K, Lazinski D W．Replicating hepatitis δ virus
RNA is edited in the nucleus by the small form of ADAR1.
Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(23): 15118~15123
[10] Tompkins S M, Lo C Y, Tumpey T M, et a1. Protection
against lethal influenza virus challenge by RNA interference
in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(23): 8682~8686
[11] 李 阳, 倪 兵, 石辛甫, 等. RNA干扰能有效抑制 SARS相
关冠状病毒复制. 第三军医大学报, 2004, 26(2): 封二
[12] Jiang M, Milner J. Selective silencing of viral gene expres-
sion in HPV-positive human cervical carcinoma cells treated
with siRNA, a primer of RNA interference. Oncogene, 2002,
21(39): 6041~6048
[13] Jacque J M, Triques K，Stevenson M. Modulation of
HIV-1 replication by RNA interference. Nature, 2002, 418
(6896): 435~438
[14] Boden D, Pusch O, Lee F, et a1. Human immunodeficiency
virus type 1 escape from RNA interference. J Virol, 2003, 77
(21): 11531~11535
[15] Hu W Y, Myers C P, Kilzer J M, et a1. Inhibition of retroviral
pathogenesis by RNA interference. Curr Biol, 2002, 12(15):
1301~1311
[16] Surabhi R M, Gaynor R B. RNA interference directed against
viral and cellular targets inhibits human immunodeficiency
virus type 1 replication. J Virol, 2002, 76(24): 12963~12973
[17] Delgadillo M, Sá enz P, Salvador B, et a1. Human influenza
virus NS1 protein enhances viral pathogenicity and acts as
an RNA silencing suppressor in plants. J Gen Virol, 2004,
85: 993~999
[18] Li H W, Li W X, Ding S W. Induction and suppression of
RNA silencing by an animal virus. Science, 2002, 296( 5571):
1319~1321
[19] Bitko V, Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes
using sequence-specific double-stranded short interfering
RNA and its application in the reverse genetics of wild type
negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol, 2001, 1: 34
[20] Westerhout E M, Ooms M, Vink M, et a1. HIV-1 can escape
from RNA interference by evolving an alternative structure
in its RNA genome. Nucleic Acids Res, 2005, 33(2): 796~804
[21] Martinez M A, Clotet B, Este J A. RNA interference of HIV
replication. Trends Immunol, 2002, 23(12): 559~561
[22] Wu K L, Zhang X, Zhang J L, et a1. Inhibition of Hepatitis
B virus gene expression by single and dual small interfering
RNA treatment. Virus Res, 2005, 112(1-2): 100~107