全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 18卷 第 1期
2006年 2月
Vol. 18, No. 1
Feb., 2006
蛋白质组学研究中的对角线电泳
陈夫义，彭宣宪*
（厦门大学生命科学学院，厦门 3 6 1 0 0 5）
摘　要：经典的蛋白质组学研究方法包括 IEF/SDS-PAGE双向电泳和质谱技术的联用，但由于 IEF的一
些不足，限制了其应用范围。对角线电泳是蛋白质组学研究中的一项特殊分离技术，由于其原理与 IEF/
SDS-PAGE不同，正逐渐成为蛋白质组学中电泳分离技术的重要补充，特别是在膜蛋白和蛋白质相互关
系的研究中将起到重要作用。本文综述了对角线双向电泳技术的特点、发展和在蛋白质组学研究中的最
新进展，比较了双向电泳和对角线电泳的优缺点，展望了对角线电泳在蛋白质组学研究中的应用前景。
关键词：蛋白质组学；双向电泳；对角线双向电泳
中图分类号：Q 50 3　　文献标识码：A
Diagonal polyarcylamide gel electrophoresis in proteomics research
CHEN Fu-Yi, PENG Xuan-Xian*
(School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China)
Abstract: The classical approach in proteomic analysis couples IEF/SDS-PAGE with mass spectrum. However,
the shortcomings of IEF restrict its widespread applications. Diagonal polyarcylalmide gel electrophoresis, a
special protein separation technique, shows its valuable application in proteomic research, especially in mem-
brane proteins and protein-protein interaction because of its different feature characteristics from IEF/SDS-
PAGE. This paper summarizes the characters, development and the latest applications of diagonal polyarcylamide
gel electrophoresis in proteomics and the comparison between IEF/SDS-PAGE and the diagonal gel
electrophoresis.
Key words: proteomics; 2-DE; two-dimensional diagonal electrophoresis
随着人类基因组计划的完成和对基因组研究的
深入，人们认识到单纯依靠基因组信息并不可能完
全揭示生命的奥秘。这是因为蛋白质才是生物功能
的体现者，所以必需考虑基因编码的蛋白质具有什
么功能。不仅如此，基因在转录和翻译过程中存在
转录和翻译水平的调控, 蛋白质往往还要经过剪接、
修饰、加工之后，最终才能成为有功能的蛋白质；
而且生物体不同组织、不同分化程度和在不同环境
下，所表达的蛋白质是不同的，所以单纯从基因组
文章编号 ：1004-0374(2006)01-0031-04
收稿日期：2005-06-17；修回日期：2005-09-09
基金项目：国家“863”高科技发展计划项目(No. 2004AA626030)
作者简介：陈夫义(1 98 2 —)，男，硕士研究生；彭宣宪(1 95 4 —)，男，博士，教授，博士生导师，* 通讯作者。
水平上并不能完全揭示生命活动的规律[1]。在这种
背景下，蛋白质组学(Proteomics)应运而生。1994
年Wilkins 和Williams提出蛋白质组这一概念后，蛋
白质组在生物学界得到了充分关注，并且肝、脑、
血清、微生物、药物、毒物、农作物等蛋白质组
概念也相继提出。蛋白质组分析的开门技术——双
向电泳(2-DE) 也随之成为生物研究的热点技术之一。
经典的蛋白质组学研究方法是利用 IEF/SDS-
PAGE分离蛋白质，然后采用质谱技术对蛋白质进
3 2 生命科学 第18卷
行鉴定。虽然 IEF/SDS-PAGE具有高分辨率和高通
量的特点，但它固有的缺点极大地限制了其应用。
这些缺点主要有：(1)检测低丰度蛋白的敏感性不
够；(2)一些分子量过大(>200 kDa)、极酸性或极碱
性蛋白在电泳中会丢失；(3)高疏水性蛋白或不溶性
蛋白得不到较好的检测；(4 )重复性问题[2]。
对角线电泳是双向电泳的一种特例。试验将蛋
白质样品点在凝胶的一个端点，电泳后进行某种特
殊处理，再将凝胶转 90º进行第二次电泳，此双向
电泳即为对角线电泳。如果两次电泳间的特殊处理
对蛋白质无影响，则电泳图谱中的蛋白点都在对角
线上；如果该特殊处理对其有影响，则电泳图谱中
的蛋白点偏离对角线。根据特殊处理的性质，可获
得变化蛋白点的相关重要信息。
1966年，Brown和Hartlay采用对角线电泳进
行含 -S-S-肽的定位，这是对角线电泳的最经典应
用。对角线电泳现广泛应用于核酸研究[3~ 6]，在蛋
白质分析鉴定中的应用也有一些报道。本文就对角
线电泳在蛋白质组学中的应用概述如下。
1　对角线电泳在膜蛋白分离鉴定中的应用
膜蛋白为疏水性蛋白，其中的一些高度疏水蛋
白由于其溶解度的问题在 IEF时得不到很好的聚焦
而不能被较好的分离和鉴定。Rais等[7]利用对角线
电泳技术在线粒体复合物Ⅰ的70多种蛋白质中分离
并鉴定了11种高疏水性蛋白质。他们设计了标准和
反向对角线电泳，利用高疏水性、中度疏水性和水
溶性蛋白在不同浓度凝胶中迁移率不同的原理获得
分离结果。如果第一向胶浓度低，第二向胶浓度
高，则疏水性蛋白全部落在对角线的上面，反之则
落在对角线的下面。利用质谱技术对这些蛋白点进
行鉴定，可以获得较满意的效果。
由奈瑟球菌引起的流行性脑脊髓膜炎和败血病
严重威胁着人类健康。针对它们的疫苗主要是基于
细菌的外膜通道蛋白，其中 PorA和 PorB是主要抗
原[ 8]。一直以来，对奈瑟氏球菌属通道蛋白的组
成、结构和功能的研究往往是通过将重组 PorA和
PorB插入人工合成的细胞膜中来进行，很少有报道
采用天然的通道蛋白。Sánchez等[9]利用非还原 /还
原 SDS-PAGE对角线电泳技术，以天然通道蛋白为
研究对象，发现奈瑟球菌属的通道蛋白是由PorA和
PorB组成的异源三聚体，而不是以往报道的由PorA
和 PorB组成的同源三聚体。
2　对角线电泳在确定二硫键上的应用
对角线电泳最经典的应用是在蛋白质测序过程
中确定二硫键的位置。硫氧还蛋白在光合作用中起
着电子传递的作用。氧化型硫氧还蛋白被NADPH
还原后将目标蛋白的二硫键还原成巯基。如果对硫
氧还蛋白的目标蛋白有详细的认识，就能更好地了
解硫氧还蛋白的功能。Yano等[10]利用非还原 /还原
SDS-PAGE来确定硫氧还蛋白的目标蛋白。样品经
硫氧还蛋白处理后，利用荧光巯基探针标记巯基，
目标蛋白会带上荧光探针。再进行对角线电泳时，
如果发现目标蛋白存在分子内二硫键，则经处理后
所得的点位于对角线的上方；如果目标蛋白存在分
子间二硫键，则经处理后得到的点位于对角线的下
方。对角线电泳不仅可以用来确定硫氧还蛋白目标
蛋白，而且为确定分子间和分子内的二硫键提供了
一种新的方法。
3　对角线电泳在蛋白质复合物研究中的应用
在后基因组时代，蛋白质间的相互关系已经成
为研究热点。现在研究蛋白质相互关系的方法主要
有免疫共沉淀、酵母双杂交和亲和层析等。对角线
双向电泳技术由于其操作的特殊性也已经成为研究
蛋白质相互关系的一种新的技术方法。由于对角线
电泳操作的特殊性，第一向给以非还原条件，使复
合物保持原有的状态，然后第二向给以还原条件，
从而使复合物中各种成分得到分离，所以能就复合
物的组成和各成分的相互关系进行有效的探讨。
一般认为补体系统起源于后口动物，但是 Zhu
等[11]通过实验证明在原肢类动物鲎(Carcinoscorpius
rotundicauda)中已经存在主要的补体成分。他们用
Staphylococcus aureus 等作亲和剂来吸附鲎血清中能
与其结合的蛋白，然后用缓冲液洗去细菌，将得到
的样品经非还原 /还原SDS-PAGE电泳后，发现p75、
p50、 p36、p34蛋白均来自一条分子量为250 kDa的
条带。比较发现，p36与脊椎动物的 C3相似，并
与较低等的后口动物的 C3具有较高的序列同源性，
进而说明补体系统可能起源于原肢类动物。
BN-PAGE(blue native polyarcylamide gel
electrophoresis)是 Schägger和 von Jagow[12]为了研究
膜整合蛋白而设计的一种改进的 PAG E，因采用
Coomassie Blue G250作指示剂而得名。第一向的
BN-PAGE能使分离得到的复合物保持天然状态，随
后的 SDS-PAGE则使复合物的各组分分开，从而使
3 3第1期 陈夫义，等：蛋白质组学研究中的对角线电泳
各组分得到有效的分离。BN-PAGE/SDS-PAGE对
角线电泳在线粒体呼吸链复合物[13]、多蛋白复合物[14]
和蛋白质包涵体[15]的研究中得到广泛应用。
Stegemann等[15]首先将3D BN-PAGE/SDS-PAGE
对角线电泳技术应用于蛋白质包涵体的研究。由于
采用了BN-PAGE，使电泳分离范围从原来小于 100
kDa，到现在大于 1 MDa。实验结果不仅有助于了
解蛋白质包涵体形成的动态过程，而且第一次揭示
体内蛋白质包涵体形成模式的复杂性。
近年来，本实验室主要从事细菌外膜蛋白质组
学的研究[16~18]。最近，正在将建立的对角线蛋白质
组学技术方法应用于外膜功能蛋白质组的研究。在
利用非还原/还原SDS-PAGE进行膜蛋白复合物的研
究中，笔者认为两次电泳之间的处理条件非常重
要，还原剂的量和种类、处理的时间等都对试验结
果有很大的影响。同时发现，第一向电泳后的蛋白
条带不需要固定即可以直接进行还原剂处理，从而
节省了时间。
4　IEF/SDS-PAGE与对角线电泳的比较
4.1　样品处理　IEF/SDS-PAGE的灵敏度高，但对
样品处理的要求也高，样品处理的好坏直接影响到
IEF/SDS-PAGE的重复性，进而限制了数据在不同
实验室间的交流和利用。
对角线电泳对样品处理的要求不高，因其第一
向为 PAGE或非还原的 SDS-PAGE，故第一向样品
处理很简单。但两次电泳之间胶条的处理是对角线
电泳操作的特殊性所在，要根据不同的实验要求来
进行。通过不同的处理，可以得到相关蛋白质的不
同信息。
4.2　上样量　一般情况下，IEF/SDS-PAGE和对角
线电泳的上样量分别约为单向电泳上样量的 6~8倍
和 1.5~2倍。在对角线电泳中，有些在第一向时难
以觉察的条带，在第二向时也能成点，这对很珍贵
的样品来说极有好处。
4.3　重复性　与 IEF/SDS-PAGE相比，对角线电泳
具有较好的重复性，但在分辨率和通量上是不能和
IEF/SDS-PAGE相提并论。这因为第一向 PAGE或
非还原的 SDS-PAGE限制了其分辨率和高通量。
4.4　主要应用范围　在膜蛋白质分离中，对角线电
泳具有一定优势。由于膜蛋白质为疏水性蛋白，特
别是一些高疏水性外膜蛋白由于在 IEF时得不到很
好的聚焦而会发生丢失。同样，不溶性蛋白也得不
到很好的检测。但这些蛋白在 PAGE 和 SDS-PAGE
时不会发生丢失，因而对角线电泳在检测高度疏水
性和不溶性蛋白质时有较大的优势。I E F / S D S -
PAGE图谱与对角线电泳图谱具有互补性，因此，
将 IEF/SDS-PAGE和对角线电泳结合起来进行膜蛋
白的研究将会收到更好的效果。
在蛋白质混合物的分离中，IEF/SDS-PAGE具
有无可比拟的优越性，但在蛋白质复合物的分离
中，对角线电泳则可以大显身手。这是因为经 IEF/
SDS-PAGE法分离，组成复合物的各蛋白组分混杂
分散于凝胶中；而采用对角线电泳，一种蛋白质复
合物在第一向 PAGE中应为 1条带，经第二向 SDS/
PAGE后该条带被分离为多个点，再利用质谱鉴定
技术，便可以确定复合物的确切组分。越来越多的
报道指出了在蛋白质复合物鉴定及蛋白质复合物相
互关系的研究中对角线电泳的重要性。
5　结语
2001年，Science杂志已把蛋白质组学列为当
前科学研究的六大热点之一，蛋白质组学研究技术
也成为探讨的重点。经典的蛋白质组学研究方法包
括 IEF/SDS-PAGE和质谱技术的联用，但由于 IEF
的一些局限性，限制了其更广泛的应用。对角线电
泳由于具有不同于 IEF/SDS-PAGE的特点，在蛋白
质组学研究中的应用越来越广泛。从最初的二硫键
定位到疏水性膜整合蛋白的研究，再到蛋白质复合
物的研究，逐渐发展和成熟。鉴于目前蛋白质复合
物的研究越来越受到关注，对角线双向电泳，特别
是非还原/还原SDS-PAGE对角线电泳也逐步成为蛋
白质相互关系研究中的一种新的有效手段。值得指
出的是，IEF/SDS-PAGE与对角线电泳技术各有优
缺点，并相互补充，将两者结合起来用于蛋白质组
学的研究将会收到更好效果，也提示蛋白质组学研
究中多种技术联用的重要性。
[参　考　文　献]
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上海生科院荣膺两项国家科技大奖
2006年 1月９日，全国科学技术大会在北京人民大会堂隆重开幕，这是中共中央、国务院继 1956年
知识分子会议、1978年全国科学大会、1995年全国科技大会之后召开的第四次全国科技大会，也是新世
纪召开的第一次全国科技大会，具有里程碑式的重要历史意义。会议颁发了 2005年度国家最高科学技术
奖、国家自然科学奖、国家技术发明奖、国家科技进步奖和国际科学技术合作奖。中科院上海生科院荣
膺国家自然科学奖、国际科学技术合作奖两项国家大奖:
生物化学与细胞生物学研究所刘望夷研究员主持完成的“核糖体失活蛋白与核糖体RNA结构与功能的
研究”成果荣获国家自然科学奖二等奖；神经科学研究所美籍所长蒲慕明教授荣获中华人民共和国国际科
学技术合作奖。
“十五”期间上海生科院共计获得 9项国家科技奖，其中自然科学奖二等奖 5项，科技进步奖二等
奖 2 项，技术发明奖 1 项，国际科学技术合作奖 1 项。
摘自 http: //www.sibs.ac.cn
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