全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第5期
2010年5月
Vol. 22, No. 5
May, 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)05-0459-07
收稿日期：2009-12-08；修回日期：2010-01-20
基金项目：国家“863”项目(2008AA02Z135); 福建
省发改委项目，2008 年第三批[26]
*通讯作者：E-mail: ruianxu@hqu.edu.cn
重组腺相关病毒载体的整合性研究进展
卢　超，王启钊，许瑞安*
( 华侨大学分子药物学研究所，分子药物教育部工程研究中心， 泉州362021)
摘　要：重组腺相关病毒(rAAV)载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体，在基因治疗中得
到了较为广泛的应用。目前全球范围内已有70 余项以rAAV 为基因药物的临床研究已经完成或正在进行
中。与野生型 AAV(wtAAV)定点整合不同，不表达 Rep 蛋白的 rAAV 载体与宿主染色体发生的是随机
整合，而这给临床应用带来了可能的潜在的安全隐患。该文在综述wtAAV 和 rAAV 整合机理的基础上
对rAAV 的因随机整合而可能导致的致癌性及其他后果进行探讨，并总结了相应应对策略，特别是目前
利用 Re p 蛋白所开展的定点整合研究。
关键词：腺相关病毒；定点整合；随机整合；R e p 蛋白；安全性
中图分类号：R374.18; Q789 文献标识码：A
Research progress on recombinant adeno-
associated virus vector integration
LU Chao, WANG Qi-zhao, XU Rui-an*
( Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education & Institute of Molecular Medicine,
Huaqiao University, Quanzhou 362021, China)
Abstract: Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) have been extensively applied in gene therapy
for its high safety and specific targeting activity. More than 70 clinical trials have demonstrated the efficacy of
rAAV based gene drugs. Unlike wild type AAV (wtAAV), which is able to integrate into a specific locus of human
chromosome 19, rAAV randomly integrates in chromosomes for lack of rep expression. The random integration
of rAAV may induce a potential danger in clinical. This review presents the progress of the mechanisms for
wtAAV and rAAV, and discuss the potential consequences (including carcinogenicity) that caused by the
random integration of rAAV. Moreover, the strategies, especially using Rep protein to improve the site-specific
integration is also reviewed.
Key words: adeno-associated virus; site-specific integration; random integration; Rep protein; safety
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)属于细
小病毒家族中的一种缺损病毒，其复制依赖于辅助
病毒(helper virus)，如腺病毒或疱疹病毒。野生型
AAV (wtAAV)基因组为线性单链DNA，大小约4.7
kb。两末端各含一个倒置末端重复序列(inverted ter-
minal repeat，ITR)，中间含有rep和cap基因。目
前已发现12种血清型及120多种突变型。由于rAAV
载体具有高稳定性、高靶向性、低致病性、低免
疫原性，宿主范围广，能感染分裂与非分裂细胞，
可长期表达等优点，使得 rAAV 基因药物研发工作
日益受到业界重视[1]。全球已有71 项以rAAV 作为
载体的临床研究在进行之中(http://www.abedia.com/
wiley/)。虽然wtAAV 在体内与宿主19 号染色体
AAVS 1 区发生的是不影响正常基因表达的定点整
合，但rAAV 却很容易与宿主染色体发生同源性的
460 生命科学 第22卷
随机整合[2]，这与之前长期以来认为的非同源性重
组不同。最近研究发现，rAAV 载体在小鼠体内存
在低水平的致癌性[3]。本文对wtAAV 和 rAAV 的整
合机理分别进行详述和比较，并在此基础上对
rAAV因随机整合而可能导致的潜在致癌性及其他后
果进行探讨，以期采取相应的有效策略来消除
rAAV 基因药物随机整合的负面影响，从而促进其
在临床上得以广泛地应用。
1　wtAAV 的定点整合机理
wtAAV定点整合的概况见图1[4-6]。在辅助病毒
(b)提供wtAAV(a)所必需的复制元件的帮助下，wtAAV
在体内完成复制，形成单链DNA(ssDNA, c)和 Rep
蛋白(d)。ssDNA 在复制的过程中部分会形成双链
DNA(dsDNA, g)，在缺少辅助病毒的情况下，部分
dsDNA在体内以首尾相连(head-to-tail)的形式形成前
病毒(provirus)。在Rep蛋白作用下，人19号染色
体长臂1区3带4亚带2次亚带(19q13.42)的AAVS1
区域(e)产生切口并开始复制(i)。复制到一定阶段时
Rep 蛋白介导前病毒与染色体发生整合，形成稳定
的染色体-AAV(ch19-AAV, i)的整合形式。该位点与
临近的肌球蛋白亚基85(Mbs85)基因高度保守[7]，而
且其定点整合必须依赖于Mbs85基因的部分复制[8]。
研究者在此基础上对先前提出的wtAAV 整合模型进
行了完善，改变了人们长期以来在wtAAV 整合过程
的认识上存在的误区[5,6,8]。现结合各个实验小组的
研究成果我们将wtAAV 整合过程阐述如下(图2)。
a Rep蛋白同时结合在染色体AAVS1和 wtAAV
ITR 上的Rep 蛋白结合位点(RBE)，将AAV 基因组
牵引至染色体AAVS1区域，确保整合位点的精确性[9]。
两 区 域 的 R B E 位 点 均 含 有 ( G A G C ) 3 重复序列，有助
于Rep 蛋白在两区域结合[10]。
b 结合在AAVS1上RBE处的Rep蛋白在末端解
链位点(trs)处的双胸腺嘧啶(TT)间进行切割产生3-
O H，并以此为引物，按不对称复制的机制不断合
成新链，从而使得染色体发生位移[11]。5端与Rep
蛋白形成共价连接复合物，有助于与wtAAV 的 ITR
相关联[12, 13]。与此同时wtAAV上 Rep蛋白的ATP依
赖性解旋酶作用将 ITR 解旋并拉伸形成发卡结构，
在ITR上的trs处的TT间产生切口，形成新的5端
和3端。由CTTTG构成的Rep蛋白结合位点(RBE)，
亦即图中的RBE，是ITR 解旋必需元件[14,15]。
c Rep蛋白结合在染色体上作为复制泡随着双
链的复制不断前移解开双链。合成的新链延伸到完
成Mbs85 基因的复制时，新链以 AAV 的 DNA 为模
板开始新的复制延伸[8,16,17]。
d AAV基因组复制完成后，新合成链以自身为
模板，产生一段短的反向重复序列，称之为未知序
列(unknown sequences, US)[8]。
e 新合成链通过新合成的反向重复序列与置换
链5端在Rep蛋白作用下共价连接，完成Mbs85基
因的重叠[8]。
f 染色体的亲本链产生一个切口，由DNA 修
复机制对不互补的区域进行修复，从而形成稳定的
整合形式[8,18]。
在细胞水平上 wtAAV 的整合效率与感染复数
(MOI)相关。当MOI=10 时，整合率＜5%。当MOI
≥ 100 时，整合率为35%～40%，约为转染效率的
图1　wt AAV与人19号染色体发生整合过程示意图
461第5期 卢　超，等：重组腺相关病毒载体的整合性研究进展
一半[19]。在动物水平的研究发现，wtAAV 整合效
率范围为0.1%～0.5%[5]。
2　rAAV 的随机整合与致癌性
在小鼠体内注射 rAA V 2 表达的人凝血因子 9
(hF.IX)12个月后进行部分肝切除实验，在肝切除实
验6周后发现小鼠体内hF.IX表达水平下降了84%，
图2　wtAAV与 19 号染色体AAVS1区域发生定点整合的详细过程
平均每细胞含有的载体基因组数量下降92%[20]。类
似的数据在其他的肝切除实验中也均有体现[21,22]。
考虑到整合的rAAV载体会随着肝细胞的分裂而在新
生的肝细胞中持续表达目的基因，因此这些实验证
明了在肝脏中注射的rAAV载体主要是以附加体的形
式而非染色体整合形式存在。rAAV 的整合效率因
载体血清型、宿主种群与组织细胞甚至实验方法的
462 生命科学 第22卷
区别而有所差异。在Hela 细胞中，rAAV 整合率可
达到0.1%~1% [23]。rAAV2 在小鼠肝细胞中的转导
率达到 10% [2 0]，而在小鼠肌肉组织中整合率低于
0.5% [24]。
与 wtAAV 的定点整合不同，缺少 Rep 蛋白定
点整合辅助作用的rAAV载体与宿主染色体的整合是
一种随机整合。虽然人们对wtAAV 的定点整合机制
已经有一定的了解，但对 rAAV 的随机整合机制还
不够清楚。最新的研究表明，rAAV 整合机制是一
种依赖于RAD51/RAD56 途径的同源重组[2, 25]。S期
的细胞因其DNA 修复机制活性更高而使得rAAV 整
合效率与停滞期细胞相比提高200倍[26]，通过酶切
或放射等DNA 损伤因素刺激也能使rAAV 整合效率
明显提高[27]。这些都说明rAAV 的整合机制与DNA
修复机制密切相关。研究还发现，rAAV 与宿主染
色体整合的发生至少需要以下两方面因素来共同完
成：一方面rAAV的全基因组必须发生部分降解[23];
另一方面宿主染色体在整合前必须存在缺口[27]。
对 rAAV 的随机整合位点进行深入大规模研究
发现，rAAV 与宿主染色体的随机整合具有一定规
律，主要体现在以下四个方面[28]: (1) 高达70%的
整合会发生小于1 kb的宿主染色体的丢失，约35%
的整合会发生小于100 bp的染色体插入或二倍体的
产生，1 % ～2 % 的整合会发生染色体重组；( 2 )
rAAV 上的整合多发生在ITR 上整合易发位点(见
wtAAV 的 hot-spots); (3) 与其他血清型相比较，
rAAV2更易于整合在活性基因处；(4) 染色体上的整
合中约 27% 发生在转录起始位点± 1 kb 区域内，
37% 发生在 CpG 岛，30% 发生在包括肝脏、肌肉、
心脏组织在内的大于40 bp 的回文区域。
不过，与wtAAV 在 19 号染色体上定点整合不
同的是，rAAV可以整合到人类 23 条染色体中的任
何一条。其中与7号染色体和19号染色体整合几率
较大，而与5号染色体发生整合的几率最小。整合
特别容易发生在7 号染色体上的两个整合易发位点
和19 号染色体上的三个整合易发位点[29]。
wtAAV的定点整合发生在19号染色体的AAVS1
区，该区DNA 不仅与临近的Mbs85 基因高度保守，
还与人骨骼肌肌原蛋白TNNT1 基因紧密连接。已有
实验证明wtAAV 的定点整合依赖于Mbs85 基因的部
分复制，但不影响 Mb s8 5 基因的表达[8]。另外，
wtAAV 还会与TNNT1基因发生整合[30]。虽然到目前
为止尚未发现任何致病性的存在，但这种两个等位
基因全部因整合而导致其原功能性破环的潜在威胁
却也不得不引起我们在进一步研究中的关注。因为
缺乏Rep蛋白介导的定点整合能力，这一可能性在
rAAV 的随机整合中体现得更为明显。
rAAV 的随机整合会引起宿主染色体的缺失、
插入等一系列核酸水平的改变。实验中也发现
rAAV在非人灵长类动物细胞和小鼠肝脏中的整合分
别有53%和 38%发生在活性基因上[29,31]。另一个实
验通过rAAV对小鼠肝细胞的整合研究更是发现了高
达72%的整合发生在活性基因上[32]。发生在基因编
码区的整合会产生癌基因激活或者抑癌基因失活的
潜在威胁，增加了癌症发生的可能性。Nakai 等[31]
的实验发现，rAAV的整合中有部分会发生在9个癌
相关基因上或其临近区域。这一系列的研究以及逆
转录病毒因为其整合性在临床上已经引起致癌性的
事实加深了人们对rAAV载体临床应用上安全性的担
忧[33]。
虽然在临床上尚未发现任何因rAAV 基因药物
的随机整合而引起基因失活或者癌症发生，但有研
究报道rAAV基因药物在动物水平上会引起致癌性，
其致癌机理也得以初步探讨[3]。该实验通过静脉注
射rAAV基因药物后，小鼠的肝癌发生率高达33%～
56%，这相当于正常小鼠肝癌发生率的4～7 倍[3]。
考虑到目前大多数实验证明rAAV基因药物在鼠类、
大型动物以及灵长类动物体内都能得以长期表达且
无致癌性，因此我们可认为物种、品系或实验条件
的差异可能会在一定程度上造成该实验中小鼠的高
肝癌发生率[34]。
尽管rAAV 载体的随机整合所带来的活性基因
的失活还没有在动物水平实验中表现出来，而且在
动物水平的致癌性文献报道也有限[3,35,36]，但我们应
该对这种可能性予以足够的重视。利用高通量分析
及改良方法来获得随机整合的位点和几率等相关的
信息给我们对随机整合的研究提供了新的思路[29,31,37]。
相信随着对wtAAV 以及rAAV 载体整合机理研究的
深入，生物信息学的发展以及对人和动物基因组
学、蛋白质组学的进一步研究，人们必将从 rAAV
载体的这种看似随机的整合现象中发现突破性的规
律，发现安全整合位点并提高在这些位点整合的几
率，避免与染色体的不利整合，从而有助于 rAAV
载体在临床前和临床研究中得以更广泛的应用。另
外，利用Rep 蛋白介导rAAV 载体在AAVS1 区域定
点整合是解决因随机整合导致潜在威胁的另一个有
463第5期 卢　超，等：重组腺相关病毒载体的整合性研究进展
效途径。
3　AAV 定点整合能力的应用
wtAAV 定点整合能力是rAAV 载体得以深入研
究和广泛发展的主要动力[6]。为了避免Rep 蛋白的
杀细胞毒性以及对细胞生长的抑制[38,39]，人们在构
建rAAV载体时一般都采取除去rep基因的方法，这
也导致了 rAAV 载体在整合上的随机性。
随着对 wtAAV 整合机制研究的深入，很多研
究者有针对性地利用Rep 蛋白以及ITR介导的定点
整合能力来构建不同的病毒载体或非病毒载体，均
能达到有效定点整合目的，从而避免了因随机整合
而存在的安全隐患。Balague等[40]构建的含有两个不
同的质粒来分别表达ITR 与 Rep 蛋白的系统表现出
高达23%的 AAVS1 位点整合率。Palombo 等[41]证明
杆状病毒 - 腺相关病毒的杂交系统也能有效地在
AAVS1处发生定点整合。Recchia等[42]构建的腺病毒-
腺相关病毒杂交系统也得到了类似良好的整合结果。
考虑到rep基因长期表达的Rep蛋白的负面作用
会影响染色体和转录基因的稳定性，近年来有较多
的研究从不同角度来提出各种不同的改进方法，这
些方法主要包括：( 1 ) 直接瞬时加入 R e p 蛋白。
Lamartina等[43]向由含有AAV ITR的腺病毒转染的细
胞中通过脂质体转染的方法分别加入Rep78和Rep68
蛋白，实验结果表明，单独加入Rep68 蛋白便可在
AAVS1 发生定点整合；(2)通过外界条件调节rep基
因实现Rep蛋白的可调控性表达。Satoh等[44]通过构
建一个Cre-loxP的重组酶系统使构建的AAV质粒中
rep78 基因的表达条件性失活，这种暂时性表达的
Rep78蛋白能有效地达到明显的整合效果。Rinaudo
等[45]借鉴经典的米非司酮(RU486)诱导系统，并在
此基础上构建了高度依赖于RU486 的诱导系统，从
而条件性激活rep 基因的表达；(3)利用mRNA 半衰
期短的特点瞬时表达Rep 蛋白。Howden 等[46]在体
外构建成熟的含rep78/rep68基因的mRNA，并通过
电转的方式导入K562细胞，在电转24 h后发现大
于 8 5 % 的细胞成功地转染了 mR N A，实验表明在
AAVS1 处的定点整合效率高达 17%。
4　rAAV 载体的前瞻
rAAV基因药物的免疫性以及其理论上存在的因
随机整合而带来基因失活或者致癌性的潜在威胁给
人们在rAAV载体的广泛应用过程中带来一些顾虑。
2007 年，美国一位关节炎患者在接受rAAV 载体的
二次给药后出现了严重不良反应，4 d 后该名患者
死亡[47]。这一起医疗事故让人们对理论上最安全的
病毒载体——rAAV 载体也开始产生怀疑，一度使
基因治疗蒙上绝境的阴影。事后的调查结果否定该
基因治疗事故是因为rAAV 载体的使用，打消了人
们对其安全性的顾虑[48]。最近一年来的在临床试验
上rAAV基因药物使用的良好治疗效果及其安全性再
次使人们对rAAV 基因药物的研究和开发充满了信
心[48-50]。以后的rAAV载体研发工作将重点集中在降
低rAAV 基因药物的免疫性，提高靶向性和定点整
合能力这三方面，相信随着这三方面的突破，
rAAV 载体将会在基因治疗中得到更广泛的应用。
[参　考　文　献]
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