全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 5期
2008年 10月
Vol. 20, No. 5
Oct., 2008
原核生物小RNA的研究及其进展
周　泉，许煜泉*
(上海交通大学生命科学技术学院，微生物代谢教育部重点实验室，上海 200240)
摘　要：原核生物中的小RNA(small RNA，sRNA)长度通常在 50－ 250nt之间，一般在细胞内不被翻
译，对基因转录后水平的调控发挥着关键作用。最初在大肠杆菌中发现，通过计算机预测和实验技术
分析，查明的种类现已近 140种，其作用机制包括；与目标mRNA的翻译起始位点或前导链结合分别
抑制或促进翻译；或者模拟其他核酸的二级结构，去除 mR NA 结合蛋白对翻译的阻抑作用，促进翻
译。此外，在转录水平上，s R N A 还能模拟开放的启动子结构与 R N A 聚合酶结合阻止转录。
关键词：s R N A；转录后调控；原核生物
中图分类号：Q522; Q939　　文献标识码：A
The advances of sRNA research in prokaryotes
ZHOU Quan, XU Yu-quan*
(Key Laboratory of Microbial Metabolism of Education Ministry, College of Life Science and Biotechnology, Shanghai
Jiaotong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: It was recently found that small RNAs (sRNAs) in prokaryotes are ranged in size from 50 to 250
nucleotides, are generally untranslated, and play key roles in post-transcriptional regulation. They were first
discovered in Escherichia coli, and almost 140 sRNAs have been revealed by computational prediction and
experimental approaches. It has made clear that the functional mechanism of sRNAs include inhibition or
activation of translation by base pairing with the translation initiation sites or the leader segments on their
target mRNAs. In addition, a few of them could mimic the secondary structures of other nucleic acids to
derepress the translational inhibition by removing mRNA binding protein. Besides, some sRNAs could also
mimic the DNA corresponding to an open promoter to sequester the RNA polymerase from mRNAs to block
transcription.
Key words: sRNAs; post-transcriptional regulation; prokaryote
文章编号 ：1004-0374(2008)05-0779-05
收稿日期：2008-05-07；修回日期：2008-06-02
基金项目：国家“863”项目(2006AA10A209)；上
海市重点学科建设项目(B203)
*通讯作者：E-mail:xuyq@sjtu.edu.cn
转录后水平调控是调节基因表达的重要步骤，
受到人们广泛关注。转录后调控通常包括对mRNA
的成熟、降解、胞浆内定位等翻译起始前的调控。
由于真核生物的转录和翻译分别在核内与胞浆内进
行，具有时空差异，长期以来人们认为转录后水平
的调控主要发生在真核细胞内。
在转录后调控的研究中，一类普遍存在而作为
调节因子的小 RNA分子，自首次报道以来，引起
了人们极大的兴趣。最初在线虫体内发现的长度在
2 2 n t 左右的非编码 R N A [ 1 ]，称之为 m i R N A
(microRNA，即微小 RNA)，现已证明广泛存在于
真核细胞内。miRNA的主要功能是调控转录后的基
因表达。相当部分的miRNA与目标mRNA的 3-UTR
区或邻近编码区末端部分非完全互补结合，阻止
mRNA翻译[2]，但并不影响mRNA的稳定性。此
780 生命科学 第20卷
外，还发现了另一种作用机制，即与翻译区发生完
全互补结合，引起mRNA的切割[3]。
然而，原核生物中的小RNA(small RNA, sRNA)
长期以来被人们忽视，认为以大肠杆菌为代表的原
核生物中，基因表达的调控主要发生在转录水平
上，转录和翻译是偶联的，基因表达在转录水平上
的调节，与转录后的调节相比，更为有效。在过
去半个多世纪中，从模式生物大肠杆菌和枯草杆菌
中获得的大量信息都支持了这一观点；但是，近年
来，陆续报道了原核生物体内存在转录后调控的证
据，这种调控与小 RNA关系密切，特别是在假单
胞菌中，发现转录后的调控具有更为重要的意义。
例如，在荧光假单胞菌 CHA0中，翻译水平的调控
对基因表达的调控效应可达 50%[4]。原核生物中普
遍存在的 sRNA分子，作为重要的调控因子，越来
越受到广泛关注。大量证据显示，sRNA在对原核
生物的生理和毒性功能的调节中起到关键作用，增
加了原核生物为求生存所建立的调节机制的多样
性。它们参与基因的转录和翻译调控，及其 RNA
的稳定、成熟和加工等多个方面的过程。
1　sRNA的发现和命名
1967年，从大肠杆菌中分离出第一个 sRNA—
—6SRNA，经过30多年的研究才搞清了它的作用机制[5]。
在过去 6年里，原核生物中发现了近 140种 sRNA。
其中，约 90种分布在大肠杆菌中，其他分布于枯
草芽胞杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色
葡萄球菌及单核细胞增生杆菌[6]等细菌中。sRNA长
度一般在 50－ 250nt之间，长于真核生物中成熟的
miRNA，它们在细胞中通常不被翻译。迄今为止，
对这些小的调控RNA尚没有统一而满意的命名。曾
在一些文章中采用非编码 RNA (noncoding RNA,
ncRNA)，但实际上某些小 RNA能够编码小蛋白，
因此并非“非编码”，如金黄色葡萄球菌的小
RNA；也曾用调控 RNA(riboregulator或 regulatory
RNA)命名，但因其缩写 rRNA与核糖体RNA相同，
显得并不合适；近来，大多采用 s m a l l R N A
(sRNA)，本文也采用这一命名，但它同样也不确
切，一些 sRNA长达 500nt，并不是很“小”。此
外，sRNA曾经用于描述同样很小的 tRNA[7]。
2　sRNA的识别
大多已知的 sRNA基因序列都具有保守性，位
于开放阅读框架(open reading frames，ORF)之间的
基因间隔区，其表达与生长阶段及生长环境胁迫相
关。大部分的 sRNA经基因组范围内的系统筛选获
得，主要采用的技术有：(1)sRNA的计算机预测；
(2)基因芯片检测；(3)直接分离分析，例如鸟枪法
克隆(RNomics)；(4)蛋白共纯化。还有少数 sRNA
利用了直接标记或功能基因组筛选等方法发现[8-10]。
各种方法都有其优势和局限性。识别 sRNA的方法
最好是将计算机预测与实验技术相结合，识别后需
要对其表达和生物学意义进行独立的实验验证。
2.1　计算机预测　通常采用一定的运算法则，考
虑以下几方面：序列保守性、转录信号、长度限
制(50－ 400nt)、RNA结构原件保守性等。目前在
大肠杆菌中已预测了上百个 sRNA基因，对预测的
结果需要实验检验[11]。
2.2　直接标记和测序　对细胞总RNA提取物进行同
位素标记或化学染色标记，凝胶分离，割胶回收所
需条带，最后利用核酸酶切进行分析。这一方法涉
及到标记、指纹图谱分析和测序，并且要求较大量
的 sRN A，较为麻烦[6]。
2.3　基因芯片检测　基因芯片是在基因组范围实时
监测基因表达的一个有效工具。然而不同于检测自
ORF表达的RNA，用于检测 sRNA基因的基因芯片
需要具备针对基因间隔区的特异性探针。利用总
RNA提取物，或是利用 Hfq (host factor for Qβ
replicase，一种 RNA结合蛋白，Qβ复制酶的宿主
因子)的抗体免疫共沉淀分离得到的 RNA，与基因
芯片杂交后，进行比较基因组分析。难点是 RNA
样品的准备和标记。sRNA长度和结构太小，很难
扩增和标记，小的 sRNA(<50nt)很难检测，特别在
探针的特异性不高的情况下，高度折叠或修饰的短
sRN A 经常被遗漏。目前发展了一种新的应对方
法，利用 RNA-DNA杂交体的特异性抗体可以解决
标记问题，提高灵敏度 [ 12 ]。
2.4 鸟枪法克隆　利用RNA组学的方法识别sRNA，
将总RNA反转录构建 cDNA文库，经多次针对性筛
选，对选中目标进行测序，其缺点是测序量太大，
此外，大的 cDNA文库常常不能反映所有的 sRNA
和每种基因的数量。目前发展的新测序方法：基于
焦磷酸盐的测序技术，减少了细菌克隆的复杂性，
因此可以进行高产率(成千上万个cDNA片段)的平行
测序。RNomics和新的测序法结合能更有效检测大
量 sRNA[13]。
2.5　蛋白共纯化和基因组SELEX　sRNA常常以一
种与 Hfq 结合为复合物的方式存在[14]。可能这些
781第5期 周　泉，等：原核生物小 R N A的研究及其进展
sRNA只有与Hfq结合才具有活性，或是只有结合
在一起才能修饰和调节目标蛋白。因此，可以利用
Hfq的抗体免疫共沉淀 sRNA[14,15]。
Schroeder实验室采用了一种基于 sRNA与Hfq
结合原理的基因组SELEX方法[16]，来寻找大肠杆菌
中新的结合Hfq的 sRNA。首先，构建 E.coli基因
组 50－ 500个碱基的随机序列文库，用T7 RNA聚
合酶体外转录，与蛋白Hfq杂交，筛选与Hfq结合
的片段，反转录成 cDNA，进行新一轮的筛选和扩
增，最后，利用酵母三杂交系统检测体内与Hfq的
特异性相互作用。
3　sRNA的靶目标识别
研究发现，大多已知功能的 sRNA都能特异性
地与 mR N A 或蛋白结合，调节基因表达。检测
sRNA在调控基因表达中所起到的作用，通常会观
察到多重效应。因此，区分真实目标和下游目标显
得非常重要。真实目标是指，sRNA与其直接作用
进行调控；而下游目标则受真实目标或其他下游目
标的调控。为了弄清 sRNA的调控机制，必须鉴定
出真实目标。识别靶目标的计算机预测以及遗传和
生化实验技术，各自有着其优缺点(表 1)。
4　sRNA的功能与作用机制
4.1　碱基配对方式 质粒中发现的 sRNA，几乎都
是通过碱基配对的方式进行调控。这些 sRNA为顺
式编码，与目标 RNA互补，具有广泛的配对潜能，
大多调控质粒或染色体组编码的毒性蛋白的表达。
质粒编码的 sRNA研究最为深入，碱基配对的步骤
也最为清楚。研究表明，最初 sRNA-目标 RNA的
相互作用表现为个别碱基配对，称为接吻复合
(kissing complex)。这种碱基配对通常涉及U-turn这
一 RNA环状结构[29]。
染色体组中发现的 sRNA则大多为反式编码，
与目标mRNA碱基配对。一般比顺式编码的 sRNA
短，与目标并非完全互补，碱基配对的潜能较小，
通常发生在临近翻译起始区(TIRs)或与之重叠。因
此，推测这种 sRNA与核糖体的竞争能导致翻译抑
制。通常情况下，目标mRNA中的前导序列可能
会隔离核糖体结合位点，在另一机制中，sRNA与
这种前导序列碱基进行配对，能促进翻译[30]。迄今
为止，发现大多 sRNA都需要Hfq。Hfq是一种丰
方 法(靶目标)
遗传学方法(主要为mRNA)
染色体组报告基因融合(主要为mRNA)
基于亲和技术(蛋白和mRNA)
生物信息学(mRNA)
免疫共沉淀(蛋白和mRNA)
基因芯片(mRNA)
蛋白组学(蛋白和mRNA)
质粒翻译融合(mRNA)
优 缺 点
(+)常常在与表型结合的相关生理条件下识
别靶目标；也能反向进行(如：搜寻期望
目标的调节因子)；常能为进一步分析目标
产生读出(如：融合)系统
(-)因调节因子的多重效应而较为复杂
(+)利用插入位点鉴别直接目标
(-)劳动强度大
(+)直接鉴定相互作用；能找到第一目标
(-)亲和力较低或是靶目标量较少时，较难
操作
(+)快速高产；不需要基因表达
(-)依赖合适的训练技术；错误的基因(ORF)
注释会导致错误预测；通常产生大量预测基
因有待检验
(+)直接识别目标
(-)假阳性或量较少时识别会出错
(+)高产；高灵敏度
(-)当mRNA水平受到影响时才有效；假阳性
较多
(+)识别与调控模式无关
(-)识别面较窄，无法识别量少或不可溶性蛋白
(+)可用于靶目标验证；可较大规模地操作
(-)需要对靶基因进行推测
实例
MicF/ompF mRNA[17]
DsrA/hns mRNA[18]
OxyS/fhlA mRNA[19]
CsrB/CsrA protein[20]
RseX/ompA和 ompC mRNA[21]
OxyS/ybaY mRNA[22]
RydC/yejAB mRNA[23]
OmrA,OmrB/一些 mRNAs[24]
RybB/许多 omp mRNAs[25]
MicA/ompA mRNA[26,27]
RNAⅢ /spa mRNA[28]
MicA/ompA mRNA[27]
表1　识别sRNA靶目标的各种技术比较
782 生命科学 第20卷
富的RNA结合蛋白，它与真核生物中形成剪切和降
解mRNA复合物核心的 Sm和 Lsm蛋白同源[31]。
sRNA造成的碱基配对会影响mRNA的稳定性
和翻译。原核生物中 sRNA引起的目标 mRNA降解
机制与真核生物中miRNA和siRNA涉及的基因沉默
机制有许多相似点。如今，已详细阐明了一些大肠
杆菌中反式编码的 sRNA的生理功能。例如，RyhB
与其他 sRNA 在铁离子动态平衡中起到的关键作
用；有些 sRNA，如 SgrS，在糖代谢中发挥功能；
大量 sRNA参与调控细胞外膜蛋白的合成[32-34]。
4.2　模仿其他核酸的结构方式　sRNA调控的分子
机制除了碱基配对以外，还有其他方式：CsrB和
6S家族RNA能模仿其他核酸的二级结构进行调控。
CsrB家族的 sRNA带有多重复序列，与mRNA 5端
前导链上的多重复序列相同，而这段重复序列恰是
CsrA家族 RNA结合蛋白的结合位点[35]。可见，类
似CsrB的一系列sRNA可以通过抑制CsrA类型蛋白
调控不同的全局性调节网络。6S RNA 通过模仿
DNA的开放启动子结构与 RNA聚合酶结合，在转
录水平上调控基因表达[36]。
有趣的是，相比利用碱基配对调节机制的
sRNA，可以在更广范围的细菌中找到 CsrB和 6S
RNA及其同源物。
5　展望
5.1　sRNA的研究动向和有待解决的问题　随着对
sRNA认识的逐渐深入，各种研究所取得的成果将
改写人们对原核生物基因调控的传统认识，从而引
起 sRNA研究的热潮。目前已经发现了许多有趣的
调节因子，然而，还有很多问题有待解决。
随着更多 sRNA的发现，不同微生物编码的大
量 sRNA之间是否会存在巨大差异？是否具有不同
的分工？已经发现，sR NA 在调节铁离子动态平
衡、合成细胞外膜蛋白、糖代谢、菌群感应和稳
定期的存活中发挥关键作用。那么在其他生理条件
下 sRNA是否也发挥功能？是否与每一个胁迫应答
有关，还是只有在某一生长条件或胁迫下才显示更
大的作用？
sRNA还有什么新的功能？有哪些能发挥多种功
能？虽然已知sRNA通过碱基配对或模拟二级结构调
节mRNA的稳定性或翻译，但许多细节仍然未知。
例如，是什么因素导致了有效的碱基配对，而配对
又是如何影响调控结果？ sRNA和RNA结合蛋白竞
争的机制又是怎样的？
5.2　sRNA的应用潜力　对于某些细菌，基因敲除
是一种耗时的过程，利用 sRNA与 TIRs结合抑制
mRNA翻译的原理，将使基因沉默技术成为有效的
工具。可以想象，基于 sRNA所合成的寡核苷酸链
也许可以作为一种抗生素发挥作用。真核生物较原
核生物复杂，对于原核生物 sRNA的研究也许将会
为进一步查明真核生物小RNA的作用机理和功能提
供重要的手段和信息。
本课题组长期以来研究的假单胞菌株 M 1 8
(Pseudomonas sp.M18)是一种促进植物生长的根际细
菌，能够同时分泌吩嗪 -1-羧酸(phenazine-1-car-
boxylic acid，PCA)和藤黄绿菌素(pyoluteorin，Plt)
两种抗真菌物质，从而抑制植物病原真菌[37,38]。近
年来，本课题组对这两种抗生素的合成机制研究取
得了很大进展，发现了与 sRNA调控相关的 Gac/
Rsm和QS信号传递系统，但是各种调节因子，特
别是 sRNA调控PCA合成的确切机制还有待进一步
弄清。深入研究 sRNA在Gac/Rsm和QS信号传递
系统中对调节 PCA和 Plt合成所起的关键作用，将
对进一步阐明原核生物，特别是假单胞菌中 sRNA
在转录后水平上调节基因表达的机制具有重要的理
论意义，将为构建高产基因工程菌株提供理论基
础。同时，利用假单胞菌株中的转录后调控机制，
还能构建可控制的高效翻译表达体系，防止目标产
物的过早合成对宿主的不良效应，无论对具有重要
生物学功能的低丰度蛋白，如膜蛋白的结构和功能
的研究，还是重组药物蛋白(酶)制品的生产，都具
有十分重要的意义。
[参　考　文　献]
[1] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C.elegans
heterochronic gene lin-4 encoded small RNAs with antisense
complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75(5): 843-54
[2] Kawasaki H, Taira K. Hes1 is a target of microRNA-23
during retinoic-acid-induced neuronal differentiation of NT2
cells. Nature, 2003, 423(6942): 838-42
[3] Llave C, Xie ZX, Kasschau KD, et al. Cleavage of Scarecrwo-
like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA.
Science, 2002, 297(5589): 2053-3
[4] Lapouge K, Schubert M, Allain FH, et al. Gac/Rsm signal
transduction pathway of γ-proteobacteria: from RNA recog-
nition to regulation of social behaviour. Mol Microbiol, 2008,
67(2): 241-53
[5] Charpentier E, Schroeder R. RNA techniques for bacteria.
Curr Opin Microbiol, 2007, 10(3): 254-6
[6] Altuvia S. Identification of bacterial small non-coding RNAs:
experimental approaches. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(3):
783第5期 周　泉，等：原核生物小 R N A的研究及其进展
257-61
[7] Storz G, Haas D. A guide to small RNAs in microorganisms.
Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2): 93-5
[8] Hüttenhofer A, Vogel J. Experimental approaches to identify
non-coding RNAs. Nucleic Acids Res, 2006, 34(2): 635-46
[9] Livny J, Waldor MK. Identification of small RNAs in di-
verse bacterial species. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2):
96-101
[10] Vogel J, Sharma CM. How to find small non-coding RNAs
in bacteria. Biol Chem, 2005, 368(12): 1219-38
[11] Washietl S, Hofacker IL, Stadler PF. Fast and reliable pre-
diction of noncoding RNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,
102(7): 2454-9
[12] Hu ZL, Zhang AX, Storz G, et al. An antibody-based
microarray assay for small RNA detection. Nucleic Acids
Res, 2006, 34(7): e52
[13] Meyers BC, Souret FF, Lu C, et al. Sweating the small stuff:
micro RNA discovery in plants. Curr Opin Biotechnol, 2006,
17(2): 139-46
[14] Wassarman KM, Repoila F, Rosenow C, et al. Identification
of novel small RNAs using comparative genomics and
microarrays. Genes Dev, 2001, 15(13): 1637-51
[15] Zhang AX, Wassarman KM, Rosenow C, et al. Global analy-
sis of small RNA and mRNA targets of Hfq. Mol Microbiol,
2003, 50(4): 1111-24
[16] Lorenz C, Von Pelchrzim F, Schroeder R. Genomic system-
atic evolution of ligands by exponential enrichment (Genomic
SELEX) for the identification of protein-binding RNAs in-
dependent of their expression. Nature Protocols, 2006, 1
(5): 2204-12
[17] Delihas N, Forst S. MicF: an antisense RNA gene involved
in response of Escherichia coli to global stress factors. J Mol
Biol, 2001, 313(1): 1-12
[18] Sledjeski D, Gottesman S. A small RNA acts as an antisilencer
of the H-NS-silenced rcsA gene of Escherichia coli. Proc
Natl Acad Sci USA, 1995, 92(6): 2003-7
[19] Altuvia S, Weinstein-Fischer D, Zhang A, et al. A small,
stable RNA induced by oxidative stress: role as a pleiotropic
regulator and antimutator. Cell, 1997, 90(1): 43-53
[20] Liu MY, Gui G, Wei B, et al. The RNA molecule CsrB binds
to the global regulatory protein CsrA and antagonizes its
activity in Escherichia coli. J Biol Chem, 1997, 272(28):
17502-10
[21] Douchin V, Bohn C, Bouloc P. Down-regulation of porins
by a small RNA bypasses the essentiality of the regulated
intramembrane proteolysis protease RseP in Escherichia
coli. J Biol Chem, 2006, 281(18): 12253-9
[22] Tjaden B, Goodwin SS, Opdyke JA, et al. Target prediction
for small, noncoding RNAs in bacteria. Nucleic Acids Res,
2006, 34(9): 2791-802
[23] Antal M, Bordeau V, Douchin V, et al. A small bacterial
RNA regulates a putative ABC transporter. J Biol Chem,
2005, 280(9): 7901-8
[24] Guillier M, Gottesman S. Remodelling of the Escherichia
coli outer membrane by two small regulatory RNAs. Mol
Microbiol, 2006, 59(1): 231-47
[25] Papenfort K, Pfeiffer V, Mika F, et al. SigmaE-dependent
small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by
accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol, 2006,
62(6):1674-88
[26] Rasmussen AA, Eriksen M, Gilany K, et al. Regulation of
ompA mRNA stability: the role of a small regulatory RNA in
growth phase-dependent control. Mol Microbiol, 2005, 58
(5):1421-9
[27] Udekwu KI, Darfeuille F, Vogel J, et al. Hfq-dependent regu-
lation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.
Gene Dev, 2005, 19(19): 2355-66
[28] Huntzinger E, Bioisset S, Saveanu C, et al. Staphylococcus
aureus RNAⅢ and the endoribonuclease Ⅲ coordinately
regulate spa gene expression. EMBO J, 2005, 24(4): 824-35
[29] Brantl S. Regulatory mechanisms employed by cis-encoded
antisense RNAs. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2): 102-9
[30] Majdalani N, Vanderpool CK, Gottesman S. Bacterial small
RNA regulators. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2005, 40(2):
93-113
[31] Valentin-Hansen P, Eriksen M, Udesen C. The bacterial Sm-
like protein Hfq: a key player in RNA transactions. Mol
Microbiol, 2004, 51(6): 1525-33
[32] Massé E, Salvail H, Desnoyers G, et al. Small RNAs control-
ling iron metabolism. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2):
140-5
[33] Vanderpool CK. Physiological consequences of small RNA-
mediated regulation of glucose-phosphate stress. Curr Opin
Microbiol, 2007, 10(2): 146-51
[34] Valentin-Hansen P, Johansen J, Rasmussen AA. Small RNAs
controlling outer membrane porins. Curr Opin Microbiol,
2007, 10(2): 152-5
[35] Babitzke P Romeo T. CsrB sRNA family: sequestration of
RNA-binding regulatory proteins. Curr Opin Microbiol,
2007, 10(2): 156-63
[36] Wassarman KM. 6S RNA: a small RNA regulator of
transcription. Curr Opin Microbiol, 2007, 10(2): 164-8
[37] Ge YH, Huang XQ, Xu YQ, et al. Phenazine-l-carboxylic
acid is negatively regulated and pyoluteorin positively regu-
lated by gacA in Pseudomonas sp. M18. FEMS Microbiol
Lett, 2004, 237(1): 41-7
[38] Zhang XH, Wang SL, Xu YQ, et al. Differential regulation of
rsmA gene on biosynthesis of pyoluteorin and phenazine-1-
carboxylic acid in Pseudomonas sp. M18. World J Microbiol
Biotechnol , 2005, 21(6-7): 883-9