全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ０１３
收稿日期：２０１４－０３－２６
基金项目：浙江省科技厅重大科技攻关项目（２０１０Ｃ１１０４０）；浙江省级公益性技术应用研究计划（ ２０１１Ｃ３３００５）；浙江省教育厅科研项目
（Ｙ２０１２２６０５６）
作者简介：郑　 磊（１９８９—），男，浙江杭州人，硕士研究生，研究方向：生物催化与手性合成；王　 普（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｎｇｐｕ＠ ｚｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
利用产脂肪酶 Ｂ的毕赤酵母工程菌生物拆分制备
西司他丁关键手性中间体的体系优化
郑　 磊１，何军邀１，２，黄　 金１，王　 普１
（１􀆰 浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 ３１００３２； ２􀆰 浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 ３１５１００）
摘　 要：Ｓ （＋） ２，２ 二甲基环丙烷甲酸（Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ）是合成西司他丁的关键手性中间体。 构建的毕赤酵母
工程菌生产的脂肪酶可高选择性催化外消旋 ２，２ 二甲基环丙烷甲酸乙酯（ＤＭＣＰＥ）不对称水解制备 Ｓ （ ＋）
ＤＭＣＰＡ。 对该工程菌产胞外脂肪酶的产酶条件及生物拆分反应条件进行优化，以提高其催化效率。 优化获得重组
毕赤酵母最佳产酶条件：采用 ＢＭＭＹ培养基，培养基初始 ｐＨ ８􀆰 ０，５００ ｍＬ摇瓶装 ５０ ｍＬ培养基，每隔 ４ ｈ向培养基
中补加终体积分数为 １％的甲醇。 培养 １９２ ｈ后，发酵液中脂肪酶比酶活为 ４􀆰 ４１ Ｕ ／ Ｌ，较优化前提高了 ９０􀆰 ９％。 利
用含脂肪酶的发酵上清液进行 ＤＭＣＰＥ 的生物拆分反应，底物浓度为 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，３０ ℃反应 ３６ ｈ，Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ
的产率可达 ４３􀆰 ８％，ｅ􀆰 ｅ．值为 ９９􀆰 ８％。
关键词：西司他丁；毕赤酵母；脂肪酶；Ｓ （＋） ２，２ 二甲基环丙烷甲酸；生物拆分
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００７０－０６
Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｌｉｐａｓｅ Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ
ＺＨＥＮＧ Ｌｅｉ１，ＨＥ Ｊｕｎｙａｏ１，２，ＨＵＡＮＧ Ｊｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｐｕ１
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓ⁃（ ＋ ）⁃２， ２⁃ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ （ Ｓ⁃（ ＋ ）⁃ＤＭＣＰＡ ） ｉｓ ａ ｋｅｙ ｃｈｉｒａｌ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ． Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ ｃａｎ ｃｏｎｖｅｒｔ ｒａｃｅｍｉｃ ｅｔｈｙｌ⁃２，２⁃
ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ （ＤＭＣＰＥ） ｔｏ Ｓ⁃（ ＋）⁃ＤＭＣＰＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ
ｅｎｈａｎｃｅ ｉｔｓ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．
Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｏａｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ５０ ｍＬ ／ ５００
ｍＬ，ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ８􀆰 ０． Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｔｏ ａ ｆｉｎａｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １％ （Ｖ ／ Ｖ） ａｔ ｅｖｅｒｙ ４ ｈ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ ４􀆰 ４１ Ｕ ／ Ｌ ｗｉｔｈｉｎ １９２ ｈ，ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ９０􀆰 ９％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＤＭＣＰＥ ｔｏ Ｓ⁃（＋）⁃ＤＭＣＰＡ ａｔ １５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｔ ３０ ℃ ｆｏｒ ３６ ｈ． Ｕｎｄｅｒ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ４３􀆰 ８％ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ （ｅ􀆰 ｅ．） ｖａｌｕｅ ｏｆ ９９􀆰 ８％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ； Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ； ｌｉｐａｓｅ； Ｓ⁃（ ＋ ）⁃２， ２⁃ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ；
ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
　 　 西司他丁是第一个应用于临床的肾脱氢二肽
酶抑制剂，Ｓ （ ＋） ２，２ 二甲基环丙烷甲酸（ Ｓ
（＋） ＤＭＣＰＡ）是合成西司他丁的关键手性中间
体［１ ２］。 目前，西司他丁手性中间体主要通过化学
法合成，但存在污染大、合成条件苛刻等缺点［３－４］。
由于生物催化法具有反应条件温和、立体选择性高
和环境污染小等优点，将其应用于药物手性中间体
的合成已逐渐成为研究热点［１］。 Ｗａｎｇ 等［５］从土壤
中筛选得到可不对称水解 ２，２ 二甲基环丙烷甲腈
制备 Ｓ （ ＋） ２， ２ 二甲基环丙烷甲酸的菌株
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ􀆰 ＡＪ２７０，产率达 ４４％，ｅ􀆰 ｅ．值为 ８８％。
Ｙｅｏｍ等［６］利用 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ 不对称水解
外消旋 ２， ２ 二甲基环丙烷甲腈合成 Ｓ （ ＋）
ＤＭＣＰＡ，产率为 ４５％，ｅ􀆰 ｅ．值为 ８１􀆰 ８％。
笔者所在实验室成员前期采用脂肪酶 ４３５催化
２，２ 二甲基环丙烷甲酸乙酯（ＤＭＣＰＥ）不对称水解
合成西司他丁关键手性中间体 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ［７］，
当脂肪酶 ４３５ 用量为 １６ ｇ ／ Ｌ、底物 ＤＭＣＰＥ 浓度为
６５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，以 ｐＨ ７􀆰 ２ 的 １ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ３ＰＯ４缓冲液
为反应介质，３０ ℃反应 ６４ ｈ，产物的产率和 ｅ􀆰 ｅ．值
分别为 ４５􀆰 ６％和 ９９􀆰 ２％。 但由于商品脂肪酶价格
较高，成为限制其工业化应用的重要因素之一［８］，
利用微生物产脂肪酶替代商品脂肪酶将成为降低
工业化应用成本的途径之一。
脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中，由于微生
物具有种类多、繁殖快、易发生遗传突变等特点，目前
微生物源脂肪酶已成为研究热点。 酵母菌是国内外
研究最多的微生物之一，且大部分酵母的发酵产物被
认为对人体安全无害，因而酵母菌成为脂肪酶的重要
来源之一，如来源于皱褶假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）
和南极假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）的脂肪酶［９］。
脂肪酶 Ｂ是从南极假丝酵母中分离得到的一种具有
高效专一性的脂肪酶［１０］，目前已被克隆表达于多种
宿 主， 如 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ［１１］、 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［１２］、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［１３］、 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［１４］ 和
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ［１５］。 Ｌｉｕ 等［１６］ 将 Ｃ􀆰 ａｎｔａｒｃｔｉｃａ
ＺＪＢ０９１９３中的脂肪酶基因在 Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｘ３３ 中成功
表达，并利用该脂肪酶催化合成维生素 Ａ 酯。 利用
基因工程菌表达外源蛋白催化合成药物手性中间
体将成为医药工业的研究新方向。
笔者所在实验室成员以 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ 为宿主菌
株，以 ｐＰＩＣＺａＡ为表达载体，采用 ＰＣＲ装配法，成功克
隆表达了脂肪酶 Ｂ基因，利用该重组菌产生的胞外脂
肪酶可高选择性催化外消旋 ＤＭＣＰＥ不对称水解制备
得到西司他丁关键手性中间体 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ。 本研
究中，笔者通过对该菌株的最佳产酶条件和生物拆分
条件进行优化，以期提高该菌株所产脂肪酶的催化效
率，进而为后续的深入研究提供依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
含脂肪酶 Ｂ基因的毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌
株（表达载体 ｐＰＩＣＺａＡ），由笔者所在实验室成员自
行构建、保藏。
１􀆰 ２　 培养基
１􀆰 ２􀆰 １　 斜面培养基
酵母粉 蛋白胨 葡萄糖（ＹＰＤ）培养基（ｇ ／ Ｌ）：
酵母浸出粉 １０，蛋白胨 ２０，葡萄糖 ２０，琼脂粉 １５。
１􀆰 ２􀆰 ２　 种子培养基
甘油基础缓冲培养基（ＢＭＧＹ）（１ Ｌ）：无氨基酵
母氮源（ＹＮＢ） １３􀆰 ４ ｇ，５００×生物素 ２ ｍＬ，甘油 １０ ｇ，
酵母浸出粉 １０ ｇ，蛋白胨 ２０ ｇ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ６􀆰 ０磷酸
盐缓冲液 １００ ｍＬ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 发酵培养基
甲醇基础缓冲培养基 （ ＢＭＭＹ） （ １ Ｌ）： ＹＮＢ
１３􀆰 ４ ｇ，５００×生物素 ２ ｍＬ，无水甲醇 １０ ｍＬ，酵母浸
出粉 １０ ｇ，蛋白胨 ２０ ｇ，１ ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ６􀆰 ０磷酸盐缓冲
液 １００ ｍＬ。
１􀆰 ３　 培养条件
将保藏菌种划线转接至 ＹＰＤ培养基上活化，３０
℃恒温培养 ４８ ｈ，将单菌落接种至 ５０ ｍＬ ＢＭＧＹ 培
养基，２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃振荡培养至 ６００ ｎｍ的吸光度
值 ＯＤ６００为 ２～６。
以 １０％的接种量将种子液接入装有 ５０ ｍＬ
ＢＭＭＹ培养基的 ５００ ｍＬ三角瓶中，２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃
下，每 ２４ ｈ按培养基体积分数的 １％补加无水甲醇，
培养 ９６ ｈ后检测发酵液中胞外脂肪酶的酶活。
１􀆰 ４　 产酶条件优化
为了考察毕赤酵母工程菌的最佳产酶条件，分
别对装液量、发酵培养基初始 ｐＨ、补加甲醇浓度、甲
１７　 第 ３期 　 　 郑　 磊等：利用产脂肪酶 Ｂ的毕赤酵母工程菌生物拆分制备西司他丁关键手性中间体的体系优化
醇添加时间间隔和产酶发酵时间进行优化，实验重
复 ３次，每项优化结果都用于后续实验。
１􀆰 ５　 生物拆分 ＤＭＣＰＥ 制备 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ 的
反应条件优化
　 　 为了考察重组菌株所产脂肪酶不对称拆分
ＤＭＣＰＥ制备 Ｓ （＋）ＤＭＣＰＡ的最佳反应条件，采用
最佳产酶条件下培养得到的含酶发酵液，分别选取
不同反应温度 （ ２５ ～ ４５ ℃）、底物浓度 （ １０ ～ ３０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）和反应时间进行生物拆分反应，气相色谱
法（ＧＣ）检测得到 Ｓ （ ＋） ＤＭＣＰＡ 产率和 ｅ􀆰 ｅ．值。
实验重复 ３次，每项优化结果都用于以后的实验。
１􀆰 ６　 检测方法与酶活力定义
底物 ＤＭＣＰＥ 和产物 Ｓ （ ＋） ＤＭＣＰＡ 的浓度
和 ｅ􀆰 ｅ．值采用气相色谱法检测，具体测定条件参照
文献［１６］。
酶活力定义：在 ３０ ℃下，１ ｍｉｎ 内不对称水解
ＤＭＣＰＥ生成 １ μｍｏｌ Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ 所需的酶量，
定义为 １个酶活单位（Ｕ）。
酶活力检测方法：取 １０ ｍＬ发酵上清液于 ５０ ｍＬ
锥形瓶中，加入 ０􀆰 ０２ ｇ底物 ＤＭＣＰＥ，３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
反应 ６ ｈ。 反应结束后，加入 ２倍体积的乙酸乙酯，３０
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ振荡萃取 ４５ ｍｉｎ，静置分层后取乙酸乙
酯相检测产物 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ 的生成量，计算得到
单位体积发酵液的脂肪酶酶活（Ｕ ／ Ｌ）。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 产酶条件优化
２􀆰 １􀆰 １　 装液量对产酶的影响
在发酵产酶时，培养基装液量会影响摇瓶内的
溶氧水平，进而影响菌体生长和目的蛋白的表达。
为了考察装液量对产酶的影响，将种子液接至不同
装液量（２５、５０、７５、１００和 １５０ ｍＬ ＢＭＭＹ培养基）的
５００ ｍＬ 三角瓶中，按发酵培养条件对基因工程菌
Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ进行诱导培养，培养 ９６ ｈ后检测发酵液中
脂肪酶的酶活，结果如图 １所示。
由图 １可知：当装液量为 ５０ ｍＬ时，比酶活达到
最大值（２􀆰 ３１ Ｕ ／ Ｌ），继续增加装液量，酶活逐渐下
降。 原因可能是装液量过少会增加发酵过程中发
酵液的蒸发损失，使有害代谢物浓度上升，从而影
响菌体的生长及脂肪酶的表达。 适量增加装液量
可部分缓解上述问题，但装液量过多会导致培养基
中溶氧水平降低，影响菌体生长和蛋白表达。 因
此，最佳装液量为 ５００ ｍＬ三角瓶中装液 ５０ ｍＬ。
图 １　 装液量对产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏａｄｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
２􀆰 １􀆰 ２　 发酵培养基初始 ｐＨ对产酶的影响
重组毕赤酵母可在 ｐＨ ３􀆰 ０ ～７􀆰 ０ 范围内正常生
长，但外源蛋白表达的适宜 ｐＨ 随着目的蛋白不同
存在很大的差异。 考察发酵培养基初始 ｐＨ 对产酶
的影响，将种子液接入初始 ｐＨ 分别为 ５􀆰 ０、６􀆰 ０、
７􀆰 ０、８􀆰 ０、９􀆰 ０和 １０􀆰 ０的 ＢＭＭＹ培养基中，按发酵液
培养条件对基因工程菌 Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ进行诱导培养，９６
ｈ后检测发酵液中脂肪酶的酶活，结果如图 ２所示。
图 ２　 培养基初始 ｐＨ对产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
由图 ２ 可知：培养基初始 ｐＨ 为 ８􀆰 ０ 时比酶活
最高（３􀆰 ０ Ｕ ／ Ｌ）。 当 ｐＨ低于 ８􀆰 ０时，脂肪酶酶活随
ｐＨ升高明显增加，这可能是由于发酵过程中菌体产
生的酸性代谢产物使发酵液酸性增强，从而影响细
胞代谢和脂肪酶酶活。 当 ｐＨ 高于 ８􀆰 ０ 时，碱性条
件会抑制毕赤酵母的生长，从而抑制脂肪酶的表
达。 故培养基初始 ｐＨ以 ８􀆰 ０为宜。
２􀆰 １􀆰 ３　 甲醇体积分数对产酶的影响
发酵培养阶段，甲醇可作为重组毕赤酵母的 Ｃ
源和产酶诱导剂，诱导醇氧化酶（ＡＯＸ）的合成［１７］，
因此，甲醇体积分数可能会影响胞外蛋白的表达
量。 按发酵液培养条件对基因工程菌 Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ 进
行诱导培养，每隔 ２４ ｈ按培养基体积分数的 ０􀆰 ５％、
０􀆰 ７５％、１􀆰 ０％、１􀆰 ２５％、１􀆰 ５％和 ２􀆰 ０％补加无水甲醇，
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
培养 ９６ ｈ后检测发酵液中脂肪酶的酶活，结果如图
３所示。
图 ３　 甲醇体积分数对产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ
ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
由图 ３可知：当甲醇体积分数为 ０􀆰 ５％时，已有胞
外脂肪酶的表达，但酶活较低，表明 ０􀆰 ５％的甲醇不能
有效维持重组毕赤酵母的菌体生长代谢及胞外蛋白
表达。 随着甲醇体积分数的增加，脂肪酶活力逐渐提
高；当甲醇体积分数为 １􀆰 ０％时，脂肪酶比酶活力最高
（３􀆰 ３２ Ｕ ／ Ｌ）；继续提高甲醇体积分数，脂肪酶比酶活
力下降迅速，原因可能是甲醇积累抑制了细胞生
长［１８］。 因此选择甲醇的最佳诱导体积分数为 １􀆰 ０％。
２􀆰 １􀆰 ４　 甲醇添加时间间隔对产酶的影响
毕赤酵母含有 ２ 个 ＡＯＸ 基因，分别为 ＡＯＸ１ 和
ＡＯＸ２，其中 ＡＯＸ１ 为强启动子，细胞中绝大多数醇
氧化酶活力由 ＡＯＸ１ 提供［１９］。 将种子液接入
ＢＭＭＹ培养基中，按发酵液培养条件对基因工程菌
Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ进行诱导培养，每隔 ４、８、１２ 和 ２４ ｈ 补加
甲醇 １次，培养 ９６ ｈ 后检测发酵液中脂肪酶的酶
活，结果如图 ４所示。
图 ４　 甲醇添加时间间隔对产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
由图 ４可知：在 ２４ ｈ 内甲醇添加总量不变的情
况下，甲醇添加时间间隔为 ４ ｈ时比酶活最高（４􀆰 ０６
Ｕ ／ Ｌ），随着添加时间间隔的变大，酶活逐渐下降。
这主要是由于重组毕赤酵母对甲醇浓度的瞬间变
化较敏感，甲醇浓度频繁波动会导致 ＡＯＸ１ 活力降
低，并可能导致细胞死亡，因此维持发酵液中甲醇
浓度相对稳定对提高重组蛋白的诱导表达有重要
意义［２０－２１］。
２􀆰 １􀆰 ５　 培养时间对酶活的影响
按发酵液培养条件对基因工程菌 Ｐ􀆰 ｐａｓｔｏｒｉｓ 进
行诱导培养，每隔 ２４ ｈ取样检测发酵液中脂肪酶的
酶活，分别培养 ２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２ 和
２１６ ｈ，考察培养时间对产酶的影响，结果如图 ５
所示。
图 ５　 发酵时间对产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
由图 ５ 可知：随着发酵时间的延长，脂肪酶活
力逐渐提高，在 １９２ ｈ 时比酶活最高（４􀆰 ４１ Ｕ ／ Ｌ），
比优化前（２􀆰 ３１ Ｕ ／ Ｌ）提高 ９０􀆰 ９％。 １９２ ｈ 后有所
下降，推测为菌体密度大、营养缺乏、酵母细胞衰
老、表达外源蛋白能力减弱，酵母细胞分泌的蛋白
酶积累，降解外源蛋白，从而导致酶活下降［２２］ 。 因
此，确定最佳发酵时间为 １９２ ｈ。 据文献［２］报道，
脂肪酶 ４３５ 比酶活为 ０􀆰 ９２ Ｕ ／ ｇ，因此，每升该发酵
液酶活力相当于 ４􀆰 ７９ ｇ脂肪酶 ４３５ 酶活力。
２􀆰 ２　 生物拆分制备 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ的条件优化
２􀆰 ２􀆰 １　 反应温度对拆分产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
反应温度在手性拆分过程中对酶活力以及对
映体选择性具有关键作用。 考察不同温度 （２５、３０、
３５、４０和 ４５ ℃）对产物 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ产率和 ｅ􀆰 ｅ．
值的影响，结果如图 ６所示。
由图 ６ 可知：当温度为 ３０ ℃ 时， Ｓ （ ＋）
ＤＭＣＰＡ产率最高。 随着温度升高，产率逐渐下降，
这可能是由于高温导致脂肪酶失活。 而 ｅ􀆰 ｅ．值随温
度变化不大，均在 ９９％以上。 因此最佳反应温度为
３０ ℃。
３７　 第 ３期 　 　 郑　 磊等：利用产脂肪酶 Ｂ的毕赤酵母工程菌生物拆分制备西司他丁关键手性中间体的体系优化
图 ６　 温度对拆分产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ
ｅ􀆰 ｅ． ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓ⁃（＋） ⁃ＤＭＣＰＡ
２􀆰 ２􀆰 ２　 底物浓度对产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
底物浓度越高，酶与底物接触的几率就越高，
反应也越充分；当底物浓度较低时，酶催化反应速
度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增
加而加快。 当底物浓度超过一定值后，反应速度的
上升与底物浓度不再成正比，而是逐渐趋向平衡，
此时继续增大底物浓度已无意义。 为此，考察不同
底物浓度 （１０、１５、２０、２５ 和 ３０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）对产物 Ｓ
（＋） ＤＭＣＰＡ 产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响，结果如图 ７
所示。
图 ７　 底物浓度对拆分产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｅ􀆰 ｅ． ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓ⁃（＋） ⁃ＤＭＣＰＡ
由图 ７ 可知：当底物浓度低于 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，
Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ 产率均保持在 ４０％以上，ｅ􀆰 ｅ．值为
９９％以上。 继续增加底物浓度，产率降低，综合考虑
产率和 ｅ􀆰 ｅ．值，选择最适底物浓度为 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 底
物浓度高于 Ｗａｎｇ 等［５］ 报道的利用 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ􀆰 ＡＪ２７０不对称水解 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ２，２ 二甲基环丙
烷甲腈制备 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ，产物 ｅ􀆰 ｅ．值也优于其
报道的 ８８％。
２􀆰 ２􀆰 ３　 反应时间对产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
为考察反应时间对产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响，反应 ８
ｈ后每隔 ４ ｈ取样检测，考察产物产率和 ｅ􀆰 ｅ．值随时
间的变化规律，结果如图 ８所示。
图 ８　 反应时间对产率和 ｅ􀆰 ｅ．值的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ
ａｎｄ ｅ􀆰 ｅ． ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｓ⁃（＋） ⁃ＤＭＣＰＥ
由图 ８可知：Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ产率随着时间的
延长而增高，ｅ􀆰 ｅ．值均在 ９９％以上，３６ ｈ 时产率最
大，为 ４３􀆰 ８％，产物浓度达 ６􀆰 ６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 继续延长
反应时间未能提高产率，综合考虑产率和 ｅ􀆰 ｅ．值，选
择反应时间为 ３６ ｈ。
３　 结论
利用工程菌产生的胞外脂肪酶催化外消旋 ２，２
二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解合成西司他丁关
键手性中间体 Ｓ （＋） ２，２ 二甲基环丙烷甲酸。 当
５００ ｍＬ三角瓶装液量为 ５０ ｍＬ，发酵培养基初始 ｐＨ
为 ８􀆰 ０，产酶培养过程中每隔 ４ ｈ 向培养基中补加终
体积分数为 １􀆰 ０％的甲醇，２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃下诱导发
酵 １９２ ｈ，酶活可达到 ４􀆰 ４１ Ｕ ／ Ｌ，较优化前 （２􀆰 ３１
Ｕ ／ Ｌ）提高 ９０􀆰 ９％。 优化获得最佳转化条件：２００
ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃、底物浓度 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、反应 ３６ ｈ，产物Ｓ
（＋） ＤＭＣＰＡ产率为 ４３􀆰 ８％，ｅ􀆰 ｅ．值为 ９９􀆰 ８％。
采用重组脂肪酶催化 ＤＭＣＰＥ 不对称水解合成
西司他丁关键手性中间体 Ｓ （＋） ＤＭＣＰＡ，与采用
产胞内脂肪酶的全细胞催化相比，以含胞外脂肪酶
的发酵上清液直接催化具有预处理简单、反应过程
中传质阻力小等优点；与脂肪酶 ４３５的催化相比，具
有成本低廉的优点。 但目前工艺仍然存在菌体产
酶周期较长、催化水解的底物浓度较低等缺点，如
何缩短菌体培养时间、提高底物浓度及脂肪酶重复
利用将会成为后续的研究方向。
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ｐａｓｔｏｒｉｓ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ＯＵＲ ／ ＤＯ ｌｅｖｅｌｓ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，
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（责任编辑　 管　 珺）
５７　 第 ３期 　 　 郑　 磊等：利用产脂肪酶 Ｂ的毕赤酵母工程菌生物拆分制备西司他丁关键手性中间体的体系优化