全 文 ：酶催化技术开发及应用的研究进展
刘成柏!，程瑛琨!，于大海"，王 智"!
（!# 吉林大学 生命科学学院，长春 !$%%"$；
"# 吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室，长春 !$%%"$）
摘 要：在有机合成中，酶作为一种有效的生物催化剂被广泛应用，但因为种种困难的存在，致使其在工业生产中应用还
不十分广泛。目前为了解决酶应用技术中所存在的问题，各相关方面的研究十分活跃。本文简单地介绍和分析了有关研
究的最新进展。
关键词：酶；应用技术；办法研究
中图分类号：&’’ 文献标识码：( 文章编号：!)*" + $)*,（"%%-）%! + %%%* + %-
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酶作为生物催化剂，具备以下优点：反应条件温
和，可节省能源，减少设备费用；可以利用酶通过有限
的步骤实现许多化学方法难以完成的反应；酶催化效
率高，专一性强，可减少或避免副反应；酶来自生物体，
是生物可降解的无环境毒害性物质，符合将废弃物控
制在最小限度，实现原子经济的绿色化学要求［!］。
尽管酶催化反应具有如此多的优点，目前酶作
为生物催化剂在工业生产中的应用并不十分普遍，
主要存在以下几方面原因：
!）酶本身是生物大分子，许多酶是胞内酶，细
胞内部环境通常比较稳定，但是催化反应环境中存
在的热、酸、碱、氧化剂、重金属离子等因素都可能导
致酶分子失活，破坏了酶的稳定性。
"）一些酶对辅酶具有强烈依赖性，而辅酶的价
格通常较昂贵，因此需要解决辅酶的来源或探索辅
酶替代物的生化代谢途径。
$）在化学反应体系中应用酶作催化剂，酶的催
化活性和选择性往往并不十分理想，还有待进一步
提高。
-）酶的来源及成本问题。许多工业用酶成本较
高，而且种类有限，目前已鉴定的酶有 $ %%%多种，工
业上生产的酶有 )%多种，真正达到工业规模的只有
"%多种。找到成本合适的酶源和发现具有应用潜力
的新型酶源是实现酶工业化应用的重要前提。
现代生物技术和分子生物学的发展，为解决上
述问题提供了可能性。主要的有如下几方面：
! 收稿日期："%%$.!!."!
作者简介：刘成柏（!Z**.），男，研究生，从事生物化学与分子生物学。
联系人：王 智（!Z*$.），男，讲师，从事非水酶学研究以及手性化合物的拆分。;O89E：B856P39[ \E@# 4Q@# H5
第 "卷第 !期
"%%-年 "月
生 物 加 工 过 程
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· * ·
万方数据
! 酶的化学修饰［" # $］
自上个世纪 !"年代末以来，有关酶分子化学修
饰的报道越来越多。主要研究内容包括：!提高生
物活性（包括某些在修饰后对效应物的反应性能改
变）；"增强在不良环境中的稳定性；#产生新的催
化能力（图 #）。
图 # 化学修饰的应用
$%&’# ()* +,,-%.+/%01 02 .)*3%.+- 304%2%.+/%01
合适的化学修饰能够提高酶对热、酸、碱和有机
溶剂的稳定性；改变酶的底物专一性和最适 ,5等
酶学性质，化学修饰酶还可以创造新的催化性能。
如辣根过氧化物酶用 6789共价修饰后，在极端 ,5
条件下抗变性能力提高，耐热性也有所增加。用右
旋糖苷修饰胰蛋白酶，不仅增加了热稳定性，而且也
使其自动水解降低。过氧化氢酶用右旋糖酐修饰后
能保持 #"":的酶活力，并表现出较高的热稳定性，
其失活温度比天然酶高得多；在有机溶剂中的溶解
性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天
然酶的 ;""倍，在水溶液中酶活是天然酶的 #< = ;"
倍。脂肪酶和蛋白酶被 6789修饰后，可溶于有机
溶剂，并具有催化酯合成，酯交换和肽合成的能力。
$>胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的—
?5@5;@AA5后，该酶抗不可逆热失活的稳定性在
B" C可提高 # """倍。在更高温度下稳定化效应更
强，这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。
D*E%等［<，B］通过对脂肪酶 @FG进行了非特异性的化
学修饰，大幅度提高了该酶的立体选择性。
" 酶的固定化［"，$］
酶的固定化在节能、降低成本、保护环境、生产
自动化、连续化等许多方面都有十分重要的意义，它
为酶的应用开拓了广阔的前景。经过多年的研究和
发展，固定化技术已经取得了长足的进步。它不仅
在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，
在实际应用上也显示出强大威力。用这种技术不仅
能够增强酶的稳定性，改变酶的专一性、提高酶的催
化活性，改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，
而且还能创造适应特殊要求的新酶。精巧设计的固
定化酶反应器可实现生产工艺的自动化操作，从而
大大降低成本。在化学分析方面，使用固定化酶进
行酶法分析，提高了酶的稳定性，可以反复使用，并
且易于自动化。用固定化酶制成探头，连接到适当
的换能系统就成了酶传感器。除了以上所介绍的之
外，固定化酶领域还包括固定化辅酶及辅酶再生、固
定化多酶反应器、固定化微生物多酶反应系统及固
· H · 生物加工过程 第 ;卷第 #期
万方数据
定化酶!微生物复合物系统等，各有其优点及用途。
固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都
有成功的应用实例。但真正投入工业化应用的固定
化酶却不多。原因是固定化所使用的试剂和载体成
本高、固定化效率低、稳定性差、连续操作使用的设
备比较复杂。进一步开发更简便、更适用的固定化
方法以及性能更加优异的载体材料，使更多的固定
化酶和细胞取得工业规模应用，仍然是这个领域的
目标。
! 交联酶技术［"，#］
交联酶技术实质也是一种固定化技术。该技术
涉及到用双功能试剂对酶的微晶进行交联，戊二醛
常被用作有效的交联剂。与常规固定化技术相比，
其不同之处在于酶蛋白既是催化剂又是支持物。该
技术在没有稀释酶活性的前提下实现了酶的固定化
（如图 "所示）。目前已有少数水解酶用此种技术实
现了商品化。
交联酶技术可以阻止蛋白质去折叠，使其对化
学和机械的稳定性增加。如枯草杆菌蛋白酶交联酶
晶体在有机溶剂及水中均具有极高的稳定性，并且
与非交联酶一样可以在乙腈中有效地催化肽合成反
应。交联酶技术还可以用来构建人工多酶复合体，
来催化一些复杂反应；另外一些需要辅酶的氧化还
原酶，可以利用交联酶技术将还原酶和脱氢酶交联
起来，使辅酶循环再生，通过耦联反应解决酶的辅酶
依赖性；而且交联酶还可以作为新型微孔物质使用。
图 " 交联酶技术的工作原理
#$%&" ’() *)+(,-$.* /0 +1/..!2$-3$-% )-45*)
$ 生物印迹
利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构
象，制备具有结合该配体及其类似物能力的“新酶”，
这是修饰、改造酶的另外一种方法。6$.(1, 等［7］根
据酶在有机溶剂中具有“刚性”结构的特点，巧妙地
发展了这种修饰酶的技术，并且把利用这种方法制
备的酶称为“印迹酶”。他们认为，酶在含有其配体
的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使
酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机
溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该
配体。这种方法叫生物印迹（8$/!$*91$-:$-%）。
6,1$,--)等［;<］用该方法制备了一系列 =型和 >型的
?!乙酰氨基酸印迹的!!胰凝乳蛋白酶，在环己烷中，
“>!型印迹酶”可催化合成 ?!乙酰!>!氨基酸乙酯，而
“=型印迹酶”催化合成 ?!乙酰!=!氨基酸乙酯的活
力也比未印迹酶提高 @倍左右。
% 酶的定向进化
定向进化［;;］是指在实验室试管中模拟达尔文
生物进化过程，让目标蛋白质在事先设计好的途径
上快速“进化”，从而产生具备某种或多种有用特性
的蛋白分子。酶的体外定向进化属于蛋白质的非合
理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，
通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随
机突变、重组和自然选择），在体外改进酶基因，并定
向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技
术极大地拓展了分子酶学工程的研究和应用范围，
特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶
的结构与功能研究开辟了崭新的途径。
A&; 提高酶分子的催化活性
张今等［;"，;@］对 =!天冬氨酸酶和!!天冬氨酰二
肽酶进行了定向进化研究，以提高酶活力。=!天冬
氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马酸生成
=!天冬氨酸。他们经过四轮易错 BCD，得到一株酶
"<
活力提高 !"倍的突变体。通过天然酶和进化酶酶
学性质的比较分析，发现进化酶的 #$稳定性和热
稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产 %&
天冬氨酸［’!］。!&天冬氨酰二肽酶能够高度专一地水
解 (端为 %&天冬氨酸的!羧基形成的二肽，在酶法
合成三种二肽甜味剂的前体中有重要的应用价值。
然而!&天冬氨酰二肽酶的酶活低，稳定性比较差，不
利于工业生产的应用。在!&天冬氨酰二肽酶的定向
进化研究中，经过三轮连续的易错 )*+和 ,(-重组
以及一轮回交（./01&02344567），在酶活力和热稳定性
双重选择压力下，筛选得到了一株酶活力和热稳定
性都有较大提高的进化酶 #8#9:;<=>。它的催化效
率 !0/? @":值是野生型!&天冬氨酰二肽酶的 >=倍，并
且在 A< B保温 ;< C56后活力仍能保持 "
在工业生产中高温可以提高底物溶解度，降低
介质粘度，减少微生物污染和增加酶活力。在热稳
定性的定向进 化 中，筛 选（ 402886567）比 选 择
（48G80?536）更加有效。一个典型的例子是对硝基苄
基酯酶的定向进化。经过连续几代突变和筛选后，
该酶积累的 ’’个氨基酸突变使得蛋白质对热的耐
受度 #C值提高了 ’> B
［’>］。
E H; 适应人工环境中提高酶活性或稳定性的进化
利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专
一反应的速率，而天然酶在有机溶剂中即使有时能
保持天然构象也极易失活，因此在这种酶分子的应
用环境中对酶分子定向进化十分必要。I/C/134J5
等［’E］利用定向进化和基因重组，使对硝基苄基酯的
进化酶在 ;
第一个通过定向进化技术提高立体选择性的例
子是针对 $%&’()*)+,% ,-&’./+)%, 脂肪酶的研究。野
生型脂肪酶在拆分一种手性酸的对硝基苄基酯时光
学纯度为 !D，稍倾向于 L 构型底物。研究中采用
易错 )*+方法作随机突变（每次得到 ’ E<< M ! E<<
个突变体），通过 >次循环和筛选，最终得到一个突
变体，其催化反应的光学纯度增加到 "’D，证明了
该方法非常有效。另外，最近人们对乙内酰脲酶的
立体选择性进行了定向进化，通过多次循环的随机
突变和饱和突变，可以使乙内酰脲酶的立体选择性
由 ,&型专一性（>
的乙内酰脲酶突变体（88N
工业应用酶源的开发研究正在积极进行，其中
剂型多样性成为酶制剂研究的一个新趋势。而基因
工程技术应用是开发新酶的主要途径：
’）基因重组酶即几种酶基因的杂交，产生的新
酶可能同时具有几种优点。而且一些极端环境中的
微生物的酶基因也极大地丰富了酶的基因库，为酶
的杂交提供了重要原料。
!）目前大量蛋白质的信息库已经建成，重新设
计酶已经成为可能，通过计算机模拟预测酶的结构，
建立模型，然后合成人工酶。人们已经开始设计一
些以前没有的反应途径。
;）抗体酶也是新酶的一个重要来源［!，>］。在模
拟生物体免疫功能的过程中，设计合成具有特定结
构、电子和立体因素过渡态类似的化合物作半抗原，
经细胞诱导产生单克隆抗体，可用于催化反应。由于
潜在的抗原分子近乎有无限个（’<’<个），因此用其诱
导的抗体酶几乎可以用于任何化学反应。通过化学
修饰、定位突变和基因选择等可在抗体结合位点上引
入复杂、高效的催化功能团和辅助因子。聚合物的分
子印迹技术也提供了可靠易行的抗体制备方法，因此
可使反应范围扩大，选择性提高。近年来，抗体酶用
于水解、重排、氧化、还原、光诱导、金属螯合、双烯加
成、环加成等反应都取得了成功，包括有些化学上很
难进行的反应，并已向应用的方向发展。
>）人工模拟酶是新酶的另一个重要来源［!，>］。
模拟酶是利用有机化学、生物化学等方法设计和合
成的一些较天然酶简单但是具有酶学性质的非蛋白
分子或蛋白质分子。随着酶学理论的发展，人们对
酶学机制的进一步认识，以及新技术新思维的不断
涌现，理想的人工酶将会不断产生。
现有的酶催化技术应用范例已经显示酶作为生
物催化剂具有化学催化剂无法比拟的优越性。虽然
酶催化的工业应用还不十分广泛，但随着生物技术
的发展和理论的完善、以及新型酶源的开发，可以预
期酶催化具有非常光明的应用前景。
（下转第 ’E页）
·’<· 生物加工过程 第 !卷第 ’期
万方数据
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万方数据