全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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收稿日期"$%&% ?%. ?$&
基金项目"国家自然科学基金资助项目#(%!*&$$)国家高技术研究发展计划#!5( 计划$资助项目#$%%!PP%#O.%&$
作者简介"宋娜娜#&!#%$&女&江苏南京人&硕士研究生&研究方向"生物燃料乙醇)宋向阳#联系人$&副教授& 1^M3CJ"VC3E4H3E4GDE4f;DBM3CJ>LDM
里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶及其水解特性
宋娜娜&宋向阳&欧阳嘉&勇"强
#南京林业大学 化学工程学院&林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室&南京 $&%%(*$
摘"要"研究了利用里氏木霉和黑曲霉混合培养产纤维素酶&以黑曲霉孢子悬浮液的不同活化浓度及不同的活化
时间来寻找 $ 个菌种发挥最大协同作用的结合点以及所产纤维素酶的水解特性 以里氏木霉单一培养和黑曲霉
单一培养为参照进行对比研究 底物为农林废弃物之一的玉米秸秆&经过蒸气爆破预处理后&用作产酶 6源 结
果表明"黑曲霉孢子悬浮液活化浓度为 &% 个7MZ&活化时间为 &$ ;时&滤纸酶比酶活最高&达 (h($ X7MZ&高于里氏
木霉单一培养的 $h$# X7MZ&
!
葡萄糖苷酶比酶活达 &h($ X7MZ&高于里氏木霉单一培养的 %h#* X7MZ 为进一步
验证混合菌产纤维素酶的水解效果&利用混合菌产纤维酶的酶液及里氏木霉产纤维素酶的酶液进行酶水解实验&
当酶用量为 $% X74绝干纤维素&底物质量浓度为 &%% 47Z条件下水解 .! ;&混合菌所产酶液酶解得率达 *%h%%g&
高于里氏木霉所产酶液的酶解得率 5(h%#g 实验表明里氏木霉与黑曲霉混合培养产酶是可行的&并优于单一菌
种培养
关键词"黑曲霉)纤维素酶)玉米秸秆)水解)混合培养)里氏木霉
中图分类号"Y8(#&""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%%# ?%5
,0636210942I3:F.2/742J73/;56J.O0I:36F34027!"#$%&(")* "((+(#
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5/I:-545:F04.1F.:127-GI426G1.1
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1QP#
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AK2@LKJBK2@;HI2DJHGCG& B;@@E:HM@F2DMMCV@I LKJBK2@N3G*%h%%g FD2.!;& CBN3G;C4;@2B;3E B;@
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L0G K24I1",-+(".#/0+1#.(")L@JKJ3G@)LD2E GBD[@2);HI2DJHGCG)MCV@I LKJBK2@)!"#$%&(")* "((+(#
""木质纤维原料是当今世界最丰富的可再生能
源*&+ 采用生物技术降解木质纤维原料&使之成
为生物发酵可利用的葡萄糖&并进一步生产乙醇
在经济上还不能做到完全的商业化*$+ 其中主要
的瓶颈在于纤维素酶酶活低且生产成本较高&不
能做到大规模的使用 纤维素酶是一种复合酶&
一般的纤维素酶包括 ( 个主要的组分"内切葡聚
糖酶#@EID4JKL3E3G@G$&外切葡聚糖酶#@VD4JKL3E3G1
@G$&
!
葡萄糖苷酶#
!
14JKLDGCI3G@G$&三个主要组
分协同性降解纤维素得到葡萄糖*(+ 能够产纤维
素酶的微生物很多&研究较多的有木霉属(曲霉
属(青霉属等 目前里氏木霉 WXY6(% 被认为是
最好的纤维素酶产生菌之一&也是植物纤维原料
生物转化制取乙醇工艺中最有工业应用前景的微
生物*.+ 但是里氏木霉 WXY6(% 所产生的
!
葡
萄糖苷酶酶活力不够高&从而限制了从纤维二糖
到葡萄糖的转化&因此&提高纤维素酶酶系结构中
的
!
葡萄糖苷酶酶活力对提高酶水解得率有着
至关重要的作用*#+ 为了克服里氏木霉产纤维素
酶中的
!
葡萄糖苷酶酶活力的不足&可以将里氏
木霉与其他可以高产
!
葡萄糖苷酶的菌种进行混
合培养 黑曲霉#,>"#.("$被认为是高产
!
葡萄
糖苷酶的菌种*5+ 因此本实验的目的是将里氏木
霉WXY61(%与黑曲霉进行混合培养以提高
!
葡
萄糖苷酶酶活&改进整个纤维素酶的酶系结构&以
提高纤维素酶的水解得率
C?材料与方法
C=C?材料
&>&>&"微生物
里氏木霉#!"#$%&(")* "((+(#$WXY61(%&黑曲霉
#,+-(".#/0+1#.("$,Z%$&由南京林业大学生物化工
研究所保藏
&>&>$"培养基
菌种保藏斜面培养基"马铃薯葡萄糖琼脂培养
基#b3EI@JG
**+菌丝体培养液配方"葡萄糖 &% 47Z&
蛋白胨 &47Z&b3EI@JG营养盐浓液 # MZ7瓶&b3EI@JG
微量元素溶液 %h%# MZ7瓶&& MDJ7Z柠檬酸缓冲液
$h# MZ7瓶&吐温?!% $ 滴7瓶&以上溶液定容至
#% MZ
产纤维素酶培养基#47Z$"葡萄糖 &)蒸气爆破
渣 (%#绝干$)#,+
.
$
$
0-
.
$h$)尿素 %h#)蛋白胨 &)
c+
$
<-
.
$)636J
$
%h()b40-
.
%h%!))@0-
.
%h%%#)
bE0-
.
%h%%& 5)OE0-
.
%h%%& .)6D6J
$
%h%%( * 吐
温 !% $ 滴 初始 A+.h!&装液量 #% MZ
&>&>("原料
蒸气爆破玉米秸秆&秸秆产自内蒙古呼和浩特
市&风干储存 预处理方式&蒸气爆破&维持压力
&h5 b<3&维持压力时间 * MCE 蒸气爆破渣用蒸馏
水洗至中性&保存于 . i冰箱中&平衡水分
&>&>."主要试剂
(&# 二硝基水杨酸试剂#R,0$)柠檬酸缓冲液
# & MDJ7Z( %h%# MDJ7Z$) b3EI@JG营养盐溶液)
b3EI@JG微量元素溶液)吐温 !%)-,!
? 葡萄糖苷$溶液)羧甲基纤维素悬浮液)
& MDJ7Z,3
$
6-
(
溶液
C=A?实验方法
&>$>&"产酶方法
将黑曲霉斜面培养基制成黑曲霉孢子悬浮液&
分别控制菌丝体培养液中的黑曲霉孢子悬浮液浓
度&分别为 &%(&%(和 &%#个7MZ&黑曲霉活化时间
&$($. 和 (5 ;&活化完毕后的里氏木霉(黑曲霉菌
液&以黑曲霉推迟接入 $. ;和里氏木霉与黑曲霉接
种量#体积比$比 # k&接入产酶培养基&第 & 天
(% i&第 $ 天开始 $! i 从第 $ 天开始每天取样&
在 ( %%% 27MCE(. i条件下离心 &% MCE&取上清液
#粗酶液$测定滤纸酶#以下简称 )!
葡
萄糖苷酶#以下简称
!
1QP$活力和内切葡聚糖酶
#以下简称 6b63G@$活力&同时测定 ( 个平行样&取
平均值
&>$>$"酶解方法
称取相当于 $h% 4的绝干气爆渣于 #% MZ三角
瓶中&加入 & MDJ7Z柠檬酸缓冲液以及一定量的水
和相当于每克绝干纤维素加酶$% X的酶液&定容至
$% MZ&充分搅拌均匀后用塑料纸扎紧瓶口&置于
#% i(&#% 27MCE的水浴中水解 水解结束后于
( %%% 27MCE下离心 &%MCE&去清液稀释后测还原糖
5 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
及葡萄糖质量浓度
可发酵性糖比例l
"
&
7
"
$
m&%%g)
酶解得率 l* #
"
&
m@m%h $ 7#)m3$ + m
&%%g
式中"
"
&
为水解液中葡萄糖质量浓度&47Z)
"
$
为水
解液中还原糖质量浓度#纤维二糖和葡萄糖浓度的
总和$&47Z)@为酶解液体积&Z)%h 为纤维素和葡
萄糖之间的转换系数))为原料质量&4)3为原料中
纤维素质量分数&g
C=Q?分析方法
&>(>&"原料测定
原料中纤维素(戊聚糖和木质素等含量的分析
按照美国国家可再生能源实验室#,W^ Z$所推荐的
方法
&>(>$")!
1QP和6b63G@酶活力的测定方法
采用国际理论和应用化学协会#_X标准方法*!+测定
一个 )条件下每分钟生成 &
#
MDJ葡萄糖所需的酶量 一
个
!
1QP活力 #X$单位定义"每分钟水解生成
&
#
MDJ对硝基苯酚所需要的酶量 一个 6b63G@
活力#X$单位定义"每分钟生成&
#
MDJ葡萄糖所需
的酶量
&>(>("总还原糖含量的测定
采用 (&# 二硝基水杨酸#R,0$法测定
&>(>."糖组成含量测定
采用高效液相色谱#+P4CJ@EB&&%% 型高效液相色谱仪)色谱柱&/CD1W3I
PMCE@V+<\1!*+#(%% MMm*h! MM$)柱温&## i)
流动相&%h%%# MDJ7Z+
$
0-
.
)流速&%h5 MZ7MCE)检
测器&示差折光检测器#W_$)进样量&&%
#
Z
&>(>#"黑曲霉孢子悬浮液浓度测定
采用血球计数板及 -Zb测计数
&>(>5"A+的测定
用+3EE3公司酸度计测定
A?结果与讨论
A=C?里氏木霉产纤维素酶历程
图 & 为里氏木霉产纤维素酶的历程 由图 & 可
知")!
1QP有着相同的变化趋势&在产酶第 #
天时同时达到最高值 )!
1QP的最高比酶活
分别是 $h$# 和 %h#* X7MZ&
!
1QP的比酶活约为
图 C?里氏木霉产纤维素酶的历程
T.;=C?D.J0:2341027:0636510942I3:F.2/
HG !2"((+(#
)!
1QP
与 )的酶解底物类型*+ 这也就显示了在里氏木霉产
纤维素酶过程中
!
1QP缺乏&以至于不能很好地将
纤维二糖转换为葡萄糖
在产纤维素酶的过程中
!
1QP的不足是里氏木
霉产纤维素酶主要的局限性&但是可以通过将里氏
木霉与高产
!
葡萄糖苷酶的黑曲霉进行共培养&以
获得较高的
!
1QP 这也就是本研究所要达到的主
要目的 此历程用作里氏木霉与黑曲霉发酵产纤
维素酶的参照
A=A?黑曲霉产纤维素酶历程
图 $ 为黑曲霉产纤维素酶历程 由图 $ 可知"
)!
1QP持续增
加&但是由于 )糖的效力很低 原因在于黑曲霉产
!
葡萄糖苷酶
和内切葡聚糖酶的能力较强&但是产外切葡聚糖酶
的能力较弱&致使纤维素酶的总体酶活不高*&%+ 此
历程可作里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶
的参照
图 A?黑曲霉产纤维素酶的历程
T.;=A?D.J0:23410270/YGJ0942I3:F.2/
HG ,21#.("
*"第 # 期 宋娜娜等"里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶及其水解特性
A=Q?黑曲霉孢子悬浮液的浓度对混合发酵产纤维
素酶的影响
""图 ( 为不同的黑曲霉孢子悬浮液浓度对混合菌
产酶的影响 由图 ( 可知"黑曲霉活化时间为 (5 ;&
活化完毕后的里氏木霉(黑曲霉菌液&以黑曲霉推
迟接入 $. ;和里氏木霉与黑曲霉接种量比#k&接入
产酶培养基中*&&+ 里氏木霉与黑曲霉进行共发酵
已获得纤维素酶的过程中&为获得最佳的产酶效果
需精确得到黑曲霉的具体接入量 由图 ( 还可知"
黑曲霉孢子悬浮的最佳浓度为&% 个7MZ时 )!
1QP比酶活同时达到最高& 分别为 $h&% 和
%h*& X7MZ 这说明在混合菌产酶过程中两者菌种
的接入量配比是十分关键的因素&只有 $ 种菌种在
最佳的浓度配比条件下才能获得最高的酶活
图 Q?黑曲霉孢子悬浮液浓度对
混合菌产酶的影响
T.;=Q?#70:F127I.7040/F19240:2/:0/F45F.2/
27,21#.("13190/1.2/12/F-0:063626GF.:
0/YGJ0942I3:F.2/
A=R?黑曲霉孢子悬浮液的活化时间对混合发酵产
纤维素酶的影响
""图 . 为不同的黑曲霉孢子悬浮液活化时间对混
合菌发酵产纤维素酶的影响 由 $h( 可知&最佳的
黑曲霉孢子悬浮液浓度为 &% 个7MZ&将浓度为
&% 个7MZ黑曲霉孢子悬浮液分别活化 &$($. 和
(5 ;&活化完毕后的里氏木霉(黑曲霉菌液&以黑曲
霉推迟接入 $. ;和里氏木霉与黑曲霉接种量比 #k&
接入产酶培养基中 由图 . 可知&黑曲霉的最佳活
化时间为 &$ ;&此时 )!
1QP比酶活同时达到
最高&分别为 (h($ 和 &h(.# X7MZ 由此可知&黑曲
霉的活化菌龄对混合菌产酶也很重要&过长的黑曲
霉活化时间对混合菌产酶是不利的
A=@?混合发酵形式的产酶历程
图 # 为混合发酵形式#黑曲霉孢子悬浮液浓
图 R?黑曲霉孢子悬浮液活化时间对
混合菌发酵产纤维素酶的影响
T.;=R?#70:F127I.7040/F192405:F.N5F.2/F.J0
27,21#.("13190/1.2/12/F-0:063626GF.:
0/YGJ0942I3:F.2/
图 @?混合发酵形式的产酶历程
T.;=@?D.J0:2341027:0636510942I3:F.2/HG 19240
:2/:0/F45F.2/27,21#.("13190/1.2/15F
CBZJX5/I5:F.N5F.2/F.J05FCA -
度为 &% 个7MZ&活化时间为 &$ ;$&活化完毕后的
里氏木霉(黑曲霉菌液&以黑曲霉推迟接入 $. ; 和
里氏木霉与黑曲霉接种量比 #k&接入产酶培养基
中的产酶历程 )到最大&(h($( X7MZ 由于 .! ; 时黑曲霉的接
入&
!
1QP在第 ( 天开始增加&同样第 # 天达到
&h($( X7MZ&此过程主要是里氏木霉产纤维素酶&
而黑曲霉起辅助协同作用&里氏木霉与黑曲霉二
者互利共生 黑曲霉随即产生大量的
!
葡萄糖
苷酶&不仅可以解除纤维二糖对内切葡聚糖酶的
抑制作用*&$+ &也可以有效降解纤维二糖生成葡萄
糖&供给里氏木霉与黑曲霉 还原糖浓度的增加
说明纤维素酶的高催化效能&从第 ( 天的 %h(!
47Z增加到第 # 天的 &h&% 47Z&甚至已经超过了
& 47Z的起始糖的质量浓度
A=V?里氏木霉和黑曲霉单一培养(混合培养所得酶
活及还原糖浓度比较
""里氏木霉和黑曲霉单一培养与混合培养方式
! 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
对所得酶活及还原糖浓度影响结果见图 5 由图 5
可知"相对于里氏木霉单一培养和黑曲霉单一培
养&混合培养的)发酵形式)的)氏木霉的单一培养&
!
1QP有很大的提高&在第 # 天&
混合发酵形式
!
1QP为 &h(# X7MZ&而里氏木霉单
一培养的
!
1QP为 %h#* X7MZ&提高了 $h(5 倍 还
原糖质量浓度也由里氏木霉单一培养的 %h# 47Z
提高到混合发酵的 &h#. 47Z 其主要原因在于由黑
曲霉产生的
!
葡萄糖苷酶活力较高 同样
!
葡萄
糖苷酶使得底物去糖基#I@14JHLDGHJ3BCDE$&并产生龙
胆二糖&龙胆二糖是强产纤维素酶诱导物*&(+ 这也
说明混合培养优于里氏木霉单一培养&里氏木霉与
黑曲霉会产生相同的酶系结构&当协同作用充分发
挥时&不仅可以改善纤维素酶的组分&而且可以提
高纤维素酶的总体酶活和酶的产率
图 V?混合培养与单一培养所产酶活力的比较
T.;=V?,2J954.12/27F-05:F.N.F.0127F-00/YGJ0
742JF-0J.O0I:36F34015/IJ2/2:36F340
27!2"((+(#5/I,21#.("
A=[?不同酶水解对蒸气爆破玉米秸秆酶解效率的
影响
$>*>&"蒸气爆破玉米秸秆纤维成分分析
本实验采用的酶水解底物为蒸气爆破玉米秸
秆&其含量的分析按照美国国家可再生能源实验室
#,W^ Z$所推荐的方法 具体成分见表 &
表 C?蒸气爆破玉米秸秆纤维成分分析
D5H60C?*/56G1.1271F05J0O962I02/:24/1F2N04
7.H04./;40I.0/F?????????????试样 3#纤维素$ 3#戊聚糖$ 3#木质素$ 3#其他$
蒸气爆破
玉米秸秆 .*h5*% #h%$ (h(&$ *h$5
$>*>$"不同酶水解对气爆渣酶解效率的影响
由于木质纤维素的降解是一个复杂的过程&不
同来源获得的酶液由于酶系组成上的差异用于天
然纤维原料的降解效果也会不同 表 $ 为 $ 种不同
来源酶液的性能比较&可以看出里氏木霉所产的纤
维素酶与混合菌所产的纤维素酶在酶系上有很大
的不同 无论是)!
1QP&混合菌的
产量均高于里氏木霉
""为了检验混合菌所产酶的水解效率&在酶用量
每克绝干纤维素加酶 $% X#下同$&底物质量浓度为
&%% 47Z&酶解温度 #% i(&#% 27MCE 的条件下水解&
其酶水解效率见图 * 由图 * 可知"水解 .! ; 之后
无论是葡萄糖质量浓度(可发酵糖比例还是酶水解
得率&混合菌所产的纤维素酶均高于里氏木霉所产
的纤维素酶 葡萄糖质量浓度从 $$h5 47Z提高到
$!h$5 47Z& 可 发 酵 糖 比 例 从 5!h**g 提 高 到
*5h$$g&酶水解得率从 5(h%.g提高到 *%h%%g
这些数据均可以说明混合菌所产的纤维素酶中包
含了更多的
!
葡萄糖苷酶&可以改善纤维素酶的酶
系组分&使得纤维素酶的酶系结构更加合理&解除
了由于
!
葡萄糖苷酶酶活力不够所造成的产物抑
制作用 使得整个酶水解反应的效率提高&在酶水
解工艺中发挥更大的作用 此研究结果与 T@E
等*&.+的研究结果相一致
表 A?不同酶液的9"和酶活
D5H60A?!90:.7.:0/YGJ05:F.N.F.015/I9"27I.7040/F0/YGJ01263F.2/1
试样 A+
)#X!MZ
?&
$
6b63G@比酶活7
#X!MZ
?&
$
!
1QP比酶活7
#X!MZ
?&
$
( 种比酶活比
里氏木霉产纤维素酶## I$ #h!( $h$5 $h%( %h#* &k%hk%h$#
混合菌产纤维素酶## I$ *h$. (h(( (h$ &h(# &k%h5k%h.
"第 # 期 宋娜娜等"里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶及其水解特性
图 [?不同酶水解蒸气爆破玉米秸秆渣效率的比较
T.;=[?,2J954.12/27I.7040/F0/YGJ012/
-GI426G1.1G.06I271F05J0O962I0I
:24/1F2N04
Q?结?论
&$里氏木霉 WXY61(% 和黑曲霉 ,Z%$ 被选作
本实验的 $ 种菌种&相对于里氏木霉单一培养和黑
曲霉单一培养&当黑曲霉孢子悬浮液活化浓度为 &%
个7MZ&活化时间为 &$ ; 时&滤纸酶活比酶活最高&
达 (h($ X7MZ& 高 于 里 氏 木 霉 单 一 培 养 的
$h$# X7MZ&提高了 &h.* 倍
!
葡萄糖苷酶比酶
活达 &h($ X7MZ& 高于里氏木霉单一培养的
%h#* X7MZ&提高了 $h(5 倍 说明通过调整菌种孢
子悬浮液浓度与黑曲霉的活化时间&找到了里氏木
霉与黑曲霉发挥最大协同作用的最佳结合点&使得
这 $ 种真菌互利共生
$$为进一步验证混合菌产纤维素酶的水解效
果&利用混合菌产纤维酶的酶液及里氏木霉产纤
维素酶的酶液进行酶水解实验&当酶用量为每克
绝干素加酶 $% X&底物质量浓度为 &%% 47Z条件下
水解 .! ;&混合菌所产酶液酶解得率达 *%h%%g&
高于里氏木霉所产酶液的酶解得率 5(h%#g 本
实验充分证明里氏木霉与黑曲霉混合培养产酶是
可行的&并优于单一菌种培养 里氏木霉与黑曲
霉混合培养具有良好的大规模产纤维素酶的工业
应用前景
参考文献"
*&+"\C3ZCMCE4&0;@E \K@JC3E4>+C4;1HC@JI L@JKJ3G@A2DIKLBCDE 9H!"#A
$%&(")* "((+(#OX1%$ DE LD2E LD9 2@GCIK@*S+>/CD2@GY@L;EDJ&
$%%.&&"$#1$5$>
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