全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
*4;?BDBW>HF?=G>EY;>9F>CBDDX?J;?BBF;?J
d>G7! />7#
a=O$%&%
@>;&&%7#.).0V7;DD?7&)-$ 8#)-!7$%&%7%#7%%!
收稿日期&$%%. 8%, 8&)
基金项目&国家自然科学基金资助项目$#%,-&#)&%)江苏省高校自然科学重大基础研究项目$%)cW$$%&%
作者简介&朱年青$&.!##%"男" 江苏泰州人" 博士研究生"研究方向&蛋白质分离纯化)勇"强$联系人%"教授"XN<=;G&D`4Ie?VEH7B@H7C?
里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质
朱年青"夏文静"勇"强
$南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室"南京 $&%%#-%
摘"要&通过$/L
,
%
$
S+
,
分级沉淀(L;5FB9 $)0&% UBD=G:;?J凝胶色谱脱盐(S>HFCB& 1阴离子交换色谱技术"里氏木
霉$ZH:*N#%%纤维素酶主要组分得以初步分开"再经过 S>HFCB& S阳离子交换色谱(L;5FB9 SB94=CFOGSN&%% LZ凝
胶过滤色谱(SH9BF@BI- 5FB9PF=@B凝胶过滤色谱进一步分离纯化"得到 $ 个纯化的内切葡聚糖酶组分XP
$
(XP
#
和一个外切葡聚糖酶组分 *YL
#
)经过 SUSN5(PX电泳鉴定为电泳纯"测得相对分子质量分别为 f$$ j&%,"
f)$ j&%
,和 )f.% j&%, XP
$
的最适反应 9L是 f)"最适反应温度为) l)XP
#
的最适反应 9L是 ,f,"最适反应
温度为 l)以羧甲基纤维素$*a*%为底物时"XP
#
(XP
$
的米氏常数$)
<
%分别为$f$% *YL
#
的最适反应 9L是 f!"最适反应温度为)% l"以对硝基苯基
)
H 纤维二糖苷$5/5*%为底物时"米氏常
数$)
<
%为%f&$ 关键词&里氏木霉)纤维素酶)酶学性质)分离纯化
中图分类号&1!&,""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%,% 8%,
X34.7.:5G.2/5/J:-545:G04.I5G.2/27:0636510742H84#29"64&% 4,#
KLR/;=?Nb;?J" [^(MB?NV;?J"Q+/P1;=?J
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*M1G45:G&_4BCBGHG=DB>E52#06"42&% 2+#ZH:*N#% =`DDB9=F=:B@ 2O=<<>?;H?"
L;5FB9 $)0&% UBD=G:;?JJBGG=OBFC4F><=:>JF=94O=?@ S>HFCB&1=?;>? BIC4=?JB7_`>B?@>JGHC=?=DBD
$XP[" XP[% =?@ >?BCBG>2;>4O@F>G=DB*YL[` BFB9HF;E;B@ :>4><>JB?B:O2OHD;?JL;5FB9 SB94=CFOG
SN&%% LZ" SH9BF@BI- 5FB9PF=@BJBGG=OBFC4F><=:>JF=94O=?@ S>HFCB& S C=:;>? BIC4=?JBFf_4BB?3OD;?JGBDH2H?;:<>GBCHG=F` B;J4:D>EXP[" XP[=?@ *YL [` BFB=2>H:f$$ j&%
,
" f)$ j&%
,
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)f.% j&%
,
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f)" ,f, =?@ f!7_4B>9:;<=GFB=C:;>? :B<9BF=:HFB>EXP[(XP[=?@ *YL[`BFB)" =?@ )% l7_4B
)
<
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=`D%f&$ N0B O24J1&52#06"42&% 2+#) CBGHG=DB) B?3O?) 9HF;E;C=:;>?
""纤维素酶是降解纤维素
)
&", 糖苷键"使纤维
素转变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称 纤维
素酶是由内切葡聚糖酶$XP%(外切葡聚糖酶$*YL%
和
)
葡萄糖苷酶 #个主要成分组成的复合酶系 普
遍认为"纤维素完全降解成葡萄糖至少需要以上 # 种
功能不同的但又互补的纤维素酶组分协同作用才能
完成,&- 里氏木霉$52#06"42&% 2+#%被认为是最有
工业应用前景的纤维素酶生产菌株"广泛应用于纤维
素乙醇的制备 然而其分泌的纤维素酶各组分比例
具有不合理性"使得纤维素水解效率不高,$ 8#- )因此
纤维素酶的分离纯化尤为关键"只有得到单一纯酶组
分"才能了解其组成(性质(相互协同的关系"进而重
新设计各个组分的比例来提高糖化效率和降低用酶
成本 纤维素酶的分离纯化已有研究"大多是对酶组
分进行了初步分离"或是对其中一种组分进行分离鉴
定,, 8- 本文通过高分辨率介质 S>HFCB&1(S>HFCB
&S(SB94=CFOGS &%% 和 SH9BF@BI- 5FB9PF=@B对里
氏木霉$ZH:* #%%纤维素酶系中 #种主要的酶组分
进行分离纯化
E?材料与方法
EPE?菌种与培养基
52#06"42&% 2+#ZH:*8#%"南京林业大学生
物化工研究所保藏
培养基 $J0T%&葡萄糖 &(纸浆 !(蛋白胨 &(
$/L
,
%
$
S+
,
$f$(尿素 %f(cL
$
5+
,
$(*=*G
$
%f# 和
aJS+
,
%f# 用%f% <>G0T的柠檬酸缓冲液调节培
养基起始 9L为 ,f!
EPC?酶液的制备
" " 将 菌 株 接 入 % &-% F0<;?的恒温振荡器中培养 #) 4进行菌丝活化
将% 种量 &%k$体积分数%"于#% l(&-% F0<;?的恒温振
荡器上培养-$ 4后"离心得纤维素酶粗酶液
EP@?纤维素酶分离纯化步骤
""每升粗酶液中加入 &%) J$/L
,
%
$
S+
,
", l过夜
&$ %%% F0<;?离心"弃沉淀"在清液中继续添加 $,& J
$/L
,
%
$
S+
,
", l过夜 &$ %%% F0<;?离心"沉淀用
%f%& <>G0T(9L-f% 三乙醇胺$_X(% L*G缓冲液溶
解后"经 L;5FB9$)0&% UBD=G:;?J柱脱盐 采用 (c_(
XI9G>FBF层析系统"脱盐粗酶液上样至 %f%$ <>G0T"
9L-f% _X(NL*G缓冲液平衡的 S>HFCB&1阴离子交
换柱$&% <G0T/=*G梯度洗
脱"自动收集器每管$ 并相应的收集液"分别测定酶活 合并有内切葡聚糖
酶活组分"聚乙二醇$%%%%包埋浓缩"L;5FB9 $)0&%
UBD=G:;?J柱进行 9L,f%(%f%$ <>G0T/=(CNL(C缓冲
液置换后上样到 S>HFCB&S 阳离子交换柱$&% <,! <<%"%f& <>G0T/=*G梯度洗脱"自动收集器每管
& 别测定酶活 合并有内切葡聚糖酶活组分"包埋浓
缩"上样至 L;5FB9 SB94=CFOGS &%% LZ凝胶预装柱
$&) <G0T(9L-f% _X(NL*G缓冲
液洗脱"自动收集器每管 & 后合并同一洗脱峰对应的收集液"分别测定酶活 合
并有较强外切葡聚糖酶活组分"包埋浓缩"上样至
SH9BF@BI- 5FB9PF=@B凝胶过滤柱$&% <%f%$ <>G0T(9L-f% _X(NL*G缓冲液洗脱"自动收集
器每管& 对应的收集液"分别测定酶活
EPT?测定方法
""蛋白质浓度测定,)- &采用 S;J<=公司的YF=@E>F@
试剂测定蛋白质浓度"牛血清蛋白作为标准蛋白
""内切葡聚糖酶活力的测定,-- &以 &% J0T羧甲基
纤维素悬浮液为底物"测定波长为 % ?< 定义酶
活单位为每分钟生成 &
!
<>G葡萄糖所需的酶量"R
""外切葡聚糖酶活力的测定,!- &以对硝基苯
基
)
H 纤维二糖苷 $5/5*%为底物"测定波长为
,&% ?< 定义酶活单位为每分钟生成 &
!
<>G对硝
基苯酚所需的酶量"R
""蛋白质纯度鉴定及相对分子质量的测定&采用
SUS 5(PX法 聚丙烯酰胺凝胶质量分数为 &$k"
采用 \BF围 &f,, j&%, g&&f) j&%,
""9L对酶活力影响&分别将酶与不同 9L缓冲液
配制的底物混合"测定酶活来确定酶的最适 9L
""反应温度对酶活力影响&分别在不同温度下"
测定酶活力来确定纤维素酶的最适温度
""酶的酸碱稳定性&将酶与不同 9L缓冲液以一
定比例混合"$ l放置$() 4"然后测定残余酶活力
来确定纤维素酶的 9L稳定性范围
""酶的热稳定性&将酶分别在不同温度下保温
%f(&(&f 4"测定酶残余活力"确定纤维素酶的热
稳定性范围
""酶的动力学&以不同浓度的羧甲基纤维素悬浮
液底物测定内切酶活力)以不同浓度的5/5P底物"
测定外切酶活力 利用 T;?B`B=]BFNYHFA 双倒数作
图法求纤维素酶单一纯组分的)
<
值
C?结果与讨论
CPE?纤维素酶的纯化及相对分子质量的测定
""$%k g)%k分级沉淀后"脱盐粗酶液 &% 上样到 S>HFCB&1阴离子交换柱"经 # 个柱体积
%f%$ <>G0T"9L-f% _X(NL*G缓冲溶液洗脱后"用
&,"第 # 期 朱年青等&里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质
% g%f$ <>G0T/=*G梯度洗脱 & 个柱体积"再用
%f$ g%f <>G0T/=*G梯度洗脱 ) 个柱体积"结果
如图 & 所示"共有 &$ 个吸收峰"其中有 , 个未吸附
的组分"经测定峰 & 具有较强的内切酶活"峰 $ 具
有内切酶活"峰 # 具有内切酶活"峰 , 具有较强外
切酶活"从峰形可以看出峰 , 组分纯度较高
图 E?!234:0EU^阴离子交换层析
Q.;=E?!234:0EU^5/.2/0L:-5/;0
""合并图 & 中峰 & 和 $ 组分"包埋浓缩"L;5FB9
$)0&% UBD=G:;?J柱进行 9L,f%(%f%$ <>G0T"/=(CN
L(C缓冲液置换 上样至 S>HFCB&S 阳离子交换
柱"%f& <>G0T/=*G梯度洗脱 $% 个柱体积"流速
$ 第 & 个峰有内切酶活"其他为杂蛋白 SUSN5(PX
分析为 & 条蛋白带"相对分子质量为 f$$ j&%,$图
#%"记为XP[
图 C?!234:0EU!阳离子交换层析
Q.;=C?!234:0EU!:5G.2/0L:-5/;0
""合并图 & 中峰 # 组分"包埋浓缩"上样至L;5FB9
SB94=CFOGS &%% LZ凝胶预装柱"用 %f%$ <>G0T"
9L-f% _X(NL*G缓冲液洗脱"流速为 %f# 如图 , 所示"经测定仅峰=有内切酶活 SUSN5(PX
分析为 & 条蛋白带"相对分子质量为 f.$ j&%,$图
#%"记为XP[
图 @?#%))(#%)和,8")的!Y! X*%#图谱
Q.;=@?#60:G429-2401.127934.7.0J#%
!
"#%)5/J,8")
图 T?".X409!09-5:4B6!SEDD"V凝胶过滤层析
Q.;=T?".X409!09-5:4B6!SEDD"V;0665B04
""合并图 & 中峰 , 组分"包埋浓缩"上样至 SH9BFN
@BI- 5FB9PF=@B凝胶过滤柱"%f%$ <>G0T"9L-f%
_X( L*G缓冲液洗脱"流速 %f$ 示"仅有 & 个峰形尖而对称的峰"经测定与外切葡聚
糖酶活力变化曲线吻合 SUS 5(PX分析为 & 条
蛋白带"相对分子质量为 )f.% j&%, $图 #%"记为
*YL
#

图 U?!3904J0L ZU X409%45J0凝胶过滤层析
Q.;=U?!3904J0L ZU X409%45J0;0665B04
""总蛋白质量为 & & 葡聚糖酶分别为& .&% R(& &! R的粗酶液经过多
步分离后得到 $ 种电泳纯组分 XP
$
(XP
#
和
$, 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
*YL
#
"内切葡聚糖酶 XP
$
和 XP
#
分别纯化了
#-f, 和 ,.f!$ 倍"酶活力回收率分别为 $&f,!k和
&!fk"比活力分别为)&f-. R0外切葡聚糖酶*YL
#
纯化了 $f.$ 倍"酶活力回收
率为 )%f,$k"比活力为$)f- R0$
(XP
#
(
*YL
#
的相对分子质量分别为 f$$ j&%,(
f)$ j&%
,
()f.% j&%
,
"与文献,. 8&%-报道相一致
CPC?纯化后#%
!
(#%
"
(,8"
"
的酶学性质
$f$f&"纤维素酶的最适 9L及 9L稳定性(最适反
应温度及热稳定性
""由表 & 可以看出"XP
$
的最适反应 9L是 f)"
最适反应温度为) l"且 9L在 ,f) g)f$ 范围内比
较稳定"在低于$% l下有较好的热稳定性)XP
#
的
最适反应 9L是 ,f,"最适反应温度为 l"且 9L
在 ,f% g)f$ 范围内比较稳定"在低于$% l下有较
好的热稳定性)*YL
#
的最适反应 9L是 f)"最适
反应温度为)% l"且 9L在 ,f, g-f% 范围内比较稳
定"在低于#% l下有较好的热稳定性
表 E?纤维素酶单一组分的酶学性质
F5M60E?X42904G.0127934.7.0J:06365101
性质 最适温度0l
最适
9L
稳定的
9L范围
热稳定性
范围0l
XP
$
) f) ,f) g)f$ 低于 $%
XP
#
,f, ,f% g)f$ 低于 $%
*YL
#
)% f) ,f, g-f% 低于 $%
$f$f$"酶的动力学参数
""利用 T;?B`B=]BFNYHFA 双倒数作图法求纤维素
酶单一纯组分的米氏常数$)
<
% 以羧甲基纤维素
$*a*%为底物时"XP
#
(XP
$
的 )
<
分别为 $f$%
#
对底物的亲和
力比XP
$
大)以5/5*为底物时"*YL
#
的 )
<
值为
%f&$ @?结?论
""经过$/L
,
%
$
S+
,
沉淀(离子交换层析(凝胶过滤
层析"里氏木霉ZH:* #%纤维素酶复合酶系中的主
要 #种单一酶组分得到了分离纯化 其中XP
$
的纯
化倍数和酶活回收率分别为 #-f, 和 $&f,!k) XP
#
的纯化倍数和酶活回收率分别为 ,.f!$ 和
&!fk)*YL
#
纯化了 $f.$ 倍"酶活回收率
为 )%f,$k
""经此多步分离纯化"对酶系中 # 种酶进行了分
离和鉴定"比较目前同类研究"酶的纯化倍数和比
活力都处于较高水平
参考文献&
,&-"K4=?JQL"a;C4=BGXL"W>?=:4=? Za7+H:G>>A E>FCBGHG=DB;9F>]B? D:F=:BJ;BD,W-7Y;>:BC4?>G>JO
(@]=?CBD"$%%)"$,&,$N,!&7
,$-"W>4=? c"a=:;S ("a=;V=_" B:=G7X?3O<=:;C9F>9BF:;BD>E:4BG>`
<>GBCHG=F<=DDB?@>JGHC=?=DBD*BG&$($XP
%
% =?@ *BG,(
$XPd% >E52#06"42&% 2+#,W-PY;>:BC4"$%%$"..&)#N-!7
,#-"瞿丽莉"朱均均"刘敏"等7
)
葡萄糖苷酶的制备及在纤维素辅
助水解上的应用研究 ,W-7林产化学与工业"$%%."$. $&%&
&#N&-7
1H T;G;"K4H WH?VH?"T;H a;?"B:=G7S:H@O>? 9FB9=F=:;>? >E
)
NJGHN
C>D;@=DB=?@ ;:D=99G;C=:;>? ;? B?3O<=:;C4O@F>GOD;D>ECBGHG>DB
,W-7*4B<[?@ \>FBD:5F>@HC:D"$%%."$.$&%&&#N&-7
,,-"曹健"郭德宪7里氏木霉纤维素酶的纯化和性质,W-7食品科
学"$%%#"$,$%&-$N-7
*=>W;=?"PH>UBI;=?7S:H@O>? 9HF;E;C=:;>? =?@ C4=F=C:BF;D:;CD>E
52#06"42&% 2+#CBGHG=DB,W-7\>>@ *4B<"$%%#"$,$%&-$N-7
,-"江华7两级超滤部分纯化里氏木霉纤维素酶,W-7纤维素科学
与技术"$%%-"&$,%&.N&7
W;=?JLH=75=F:;=G9HF;E;C=:;>? >ECBGHG=DBDEF><52#06"42&% 2+#
2O=:`>ND:=JBHG:F=E;G:F=:;>?,W-7WSC;*BGHG>DB_BC4"$%%-"&
$,%&.N&7
,)-"Y=F@E>F@ a7(F=9;@ =?@ DB?D;:;]B@ E>F:4BbH=?:;:=:;>? >E
<;CF>JF=E9F>:B;? H;:;G;3;?J:4B9F;?C;9GB>E9F>:B;?N
@OB2;?@;?J,W-7(?=GY;>C4B<"&.-)"-$$&0$%&$,!N$#7
,--"朱年青7里氏木霉纤维素酶的分离纯化及应用的研究,U-7南
京&南京林业大学"$%%!7
,!-"阎伯旭"高培基7外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化和部
分性质研究,W-7生物化学杂志"&..-"&#$#%&#)$N#),7
Q=? Y>IH"P=>5B;V;75HF;E;C=:;>? >E:`>CBG>2;>4O@F>G=DBDEF><
52#06"4&% ,+/4"R#-#-># SN#! ,W-7W*4B<" &..-" &# $ # %&
#)$N#),7
,.-"aB@]BW"TBBU"_VBF?BG@V\"B:=G7[>?NBIC4=?JBC4F><=:>JF=94;C
9HF;E;C=:;>? =?@ bH=?:;:=:;]B=?=GOD;D>E52#06"42&% 2+#CBGHG=N
DBDCBG>2;>4O@F>G=DB["[=?@ B?@>JGHC=?=DB[2OE=D:9F>:B;? G;bN
H;@ C4F><=:>JF=94O,W-7W*4F><=:("&..!"!%!$&0$%&&#N&)7
,&%- PHD=A>](d"S=G=?>];C4 _/"(?:>?>](["B:=G7UBD;J? >E4;J4GO
BE;C;B?:CBGHG=DB<;I:HFBDE>FB?3O<=:;C4O@F>GOD;D>ECBGHG>DB
,W-7Y;>:BC4 Y;>B?J"$%%-".-&&%$!N&%#!7
#,"第 # 期 朱年青等&里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质