全 文 ：第6卷第2期
2008年3月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Mar．2008
·61·
碱与微波联合处理蔗渣对里氏木霉
发酵产纤维素酶的影响
杨晓辉，余晓斌
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江南大学 生物工程学院，无锡214122)
摘要：以蔗渣为原料，采用碱和微波辐射联合处理后用于里氏木霉纤维素酶的液态发酵。采用单因素试验与正
交试验确定了最佳的处理条件为：O．30mol／L的NaOH溶液浸泡，微波功率160W，处理5min。在此条件下得到的
单位能耗的酶活净增值最高。后续发酵结束后，酶活较未经处理的蔗渣发酵后所得酶活有显著提高。其中，|IB-葡
萄糖苷酶活、滤纸酶(FPase)活、羧甲基纤维素酶(CMCase)活分别提高了81．3％，88．2％，154．5％。
关键词：甘蔗渣；纤维素；微波；预处理；里氏木霉
中图分类号：Q815，TQ352．62文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02-0061—05
CellulaseproductionbyTrichodermareeseifrom
bagassepr treatedbyalkaliandmicrowave
YANGXiao-hui．YUXiao—bin
(KeylaboratoryofIndustrialB otechnologyMinistryofEducation，SchoolofBiotechnology，JiangnanUniversity，
Wuxi214122，China)
Abstract：Bagassespretreatedwithalkaliandmicrowaver diationw鹅usedtoproducecellulasebyTri-
chodermareeseisubmergedfermentation．Bys nglefactortestandorthogonalexperimentaldesign，the叩-
timalconditionwasbtainedwithalkalisolutionofNaOHatconcentrationof0．30mol／Lundermicrowave
radiationw thpowerof160Wfor5minutes．Themaximumcellulaseyieldusingpretreatedbagassea
rawmaterialW shigherthanthatofusingon—pretreatedbagasses．Theyieldof卢一glucosidase，FPase，
CMCaseincreasedby81．3％，88．2％，154．5％，respectively．
Keywords：bagasse；cellulase；microwave；pretreatment；Tr／chodermareesei
木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源。
其中，蔗渣作为甘蔗提取蔗汁后留下的大量纤维性
废渣，以纤维素、半纤维素、木质素为主要成分，淀
粉和可溶性糖的含量较少【lJ。以蔗渣为原料代替
纯纤维素用于纤维素酶的发酵生产可在一定程度
上节约成本，进而使纤维素酶大规模用于工业生产
成为可能。
纤维质原料不易溶于水，很难被微生物所利用，
通过一定的预处理手段可破坏其结晶结构，增加可及
度，从而使其易于被微生物所利用。通常的预处理方
法包括物理法、化学法、生物法及上述方法的综合利
用旧。J。微波是一种新型节能、无温度梯度的加热技
术，可以促进多种有机化学反应的反应速率怕J。研究
发现，微波辐射可以破坏植物细胞壁的薄膜结构，改
收稿日期：2007-07-It
基金项目：江南大学青年科学基金资助项目(101000-52210468)
作者简介：杨晓辉(1982一)，女，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向：酶工程与技术。
联系人：余晓斌，教授，博士生导师。E—mail：xbyu@sytu．edu．cn
万方数据
· 62· 生物加工过程 第6卷第2期
变纤维素原料的超分子结构，使纤维结晶区尺寸发生
变化m8|。本试验研究了碱与微波联合处理蔗渣对
里氏木霉发酵产纤维素酶的影响。
l材料和方法
1．1出发菌株
里氏木霉(Trichodermareesei)突变株WXll2，
通过诱变里氏木霉RutC-30后筛选获得。
1．2培养基
种子培养基：蔗渣(粉碎后过40目筛)10．0s／L，
麸皮5．0g／L，豆饼粉5．0g／L，胰蛋白胨4．0g／L，营
养盐溶液pH5．5。
初始发酵培养基：蔗渣(粉碎后过40目筛)
20．Og／L，麸皮10．0g／L，豆饼粉10．0g／L，胰蛋白
胨4．0g／L，营养盐溶液pH5．5。
1．3培养条件
种子培养：孢子接种到种子培养基后，在28℃
恒温摇床上，180r／rain震荡培养48h。
发酵培养：以体积分数10％的接种量向发酵培
养基中接入种子液，于28℃恒温摇床上，180r／min
震荡培养7d。
1．4甘蔗渣的预处理
碱处理：配制不同浓度的碱溶液，称取一定质量
经粉碎并过40目筛的蔗渣，取固液比1：10，(304-
1)℃静置水解4d，然后用自来水充分冲洗后80℃
烘干备用。
微波与碱联合处理：取固定质量的蔗渣，用一
定浓度的碱液浸泡，选取不同的微波处理功率与处
理时间，于微波炉中进行微波辐射处理。
1．5纤维素酶粗酶液制取
将发酵液于3000r／min的转速下离心10min，
取上清液测定残糖及酶活。
1．6纤维素酶活测定方法
1．6．1卢-葡萄糖苷酶(卢一glucosidase)活力测定
取适当稀释酶液0．5mL，加入1mL质量分数
1％的以pH4．8的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液溶
解的水杨酸溶液，在50℃酶解30min，然后进行还
原糖测定，最后再扣除发酵液中的还原糖含量。
1．6．2滤纸酶(FPase)活力测定
取适当稀释酶液0．5mL，加入lmLpH4．8的
柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液，再加入新华1号滤纸
条(0．5cm×5cm)1片，在50℃酶解30min，其余
同1．6．1。
1．6．3羧甲基纤维素酶(CMCase)活力测定
取适当稀释酶液O．5mL，加入1mL质量分数
1％的以pH4．8的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液溶
解的羧甲基纤维素钠(CMC—Na)溶液，在50℃酶解
20min，其余同1．6．1。
酶活单位定义：50℃下，每分钟水解底物生成1
vLmol葡萄糖所对应酶活定义为1个酶活单位(U)。
微波处理后单位能耗产生的酶活增加量计算
方法如下：
AC=(C’一c)／(P×T)
式中：AC为微波处理后单位能耗产生的酶活增加量，
U／kWh；C’为微波处理后的基质在发酵过程中出现
的最高纤维素酶活，U／mL；C为未经微波处理的基质
在发酵过程中出现的最高纤维素酶活，U／mL；P为微
波处理功率，kW；T为微波处理时间，h。
1．6．4还原糖测定
还原糖测定采用DNS法∽j。
1．7主要仪器
721型分光光度计；格兰仕微波炉WD800．SL；
电热恒温水浴锅；台式离心机TGL．16C；全温摇瓶
柜HYG．A。
2结果与讨论
2．1 碱液处理蔗渣对发酵产酶的影响
分别配制0．1mol／L，0．3moL／L，0．5mol／L，0．7
mol／LNaOH、KOH和NH40H溶液，将蔗渣水解4d
后用于液态发酵产酶。实验结果表明，碱液处理蔗
渣后用于发酵产酶，酶活较未经处理的有不同程度
提高，其中，以O．30mol／LNaOH溶液处理蔗渣后发
酵产酶最高，说明适当浓度的NaOH溶液水解蔗渣
是一种较为有效的化学预处理方法。蔗渣通过碱
液处理，能在一定程度上降低木质素的含量，通过
皂化作用使纤维素、木质素与半纤维素之间的紧密
结构遭到破坏，降低原料的聚合度与结晶度，使其
发生溶胀作用，增加可及度，从而提高利用效率。
2．2碱与微波联合处理蔗渣对发酵产酶的影响
2．2．1微波处理功率对发酵产酶的影响
以0．30mol／LNaOH溶液浸泡蔗渣，选取不同的
微波功率，分别处理5min，考察微波功率对发酵产酶
的影响。由图1、图2、图3可以看出，微波处理功率为
320W时，3种酶活均达到最大值，但若以单位能耗所
获得的酶活净增量为考察指标，则微波处理功率为
万方数据
2008年3月杨晓辉等：碱与微波联合处理蔗渣对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响 ·63·
160W时，效果最好。微波辐射促进了碱水解作用，在
很短的时间内即可得到比单纯碱水解高的酶活。
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图1
Fig．1
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功率对B一葡萄糖苷酶活及其增量的影响
Effectofmicrowavepow rontheyield
ofp-glucosidasean △p—glucosidase
0 0．16 0．32 0．48 0．64 0．80
功率／kW
图2功率对FPase及其增量的影响
Fig．2Effectofmicrowavepow rOHtheyield
of‰eand△n，鹪e
——·一CMCase——●—一△CMCase
功率，kw
图3功率对CMCase及其增量的影响
Fig．3Effectofmicrowavepow rontheyield
ofCMCaseandACMCase
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2．2．2微波处理时间对发酵产酶的影响
以0．30mol／LNaOH溶液浸泡蔗渣，选取微波
功率为320W，分别处理3，5，7，10，15min，考察处
理时间对蔗渣发酵产酶的影响。图4—6反映出在
相同的处理功率下，处理时间为5min时3种酶活均
达到最高值，且卢-葡萄糖苷酶活增量及FPase增量
均最高，但CMCase增量在处理3rain时最高。处理
时间越长，耗能越多，也不利于发酵产酶。
时间／rain
图6时间对CMCase及其增量的影响
Fig．6Effectofpretreatedtimeontheyield
ofCMCaseand△CMCase
2．2．3采用正交实验优化预处理条件
(1)正交实验设计及结果
考虑到不同因素共同作用时存在交互作用，因此，
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万方数据
·64· 生物加工过程 第6卷第2期
根据上述单因素试验结果，选取微波处理功率
(A，kW)、时间(B，min)及NaOH浓度(C，moL／L)3个
因素进行正交实验，采用k(34)正交表，分别以单位能
耗下的△B一葡萄糖苷酶活、AFPase和ACMCase为试
验指标，试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。
(2)极差分析
对试验结果进行极差分析，结果如表3所示。
可以看出，微波处理功率、微波处理时间及NaOH浓
度对单位能耗的△届一葡萄糖苷酶活的影响大小为：
A>C>B，对AFPase和ACMCase的影响大小为：
即A>B>C，另外，三个指标达到最大值时的最优
水平均为A。B：C：，即在以0．30moL／LNaOH溶液浸
泡蔗渣，微波处理功率为160W，处理时间为5min
时单位能耗的酶活净增量最高。
表1 正交试验因素水平表
Table1 Thetableoffactorandlevelinorthogonalexperiment
表2微波辐射预处理正交试验表
Table2 Thetableoforthogonalexperimentofmicrowaveradiationpretreated
表3极差分析表
Table3 Extremevalueanalysisoforthogonalexperiment
(3)验证试验
用正交试验所得的最优水平进行验证试验，即用
0．30moL／L的NaOH溶液浸泡蔗渣，在微波功率为
160W条件下，处理甘蔗渣5min，之后用于液态发酵
5d，实验所得单位能耗下的△B．葡萄糖苷酶活、△F．
Pase和ACMCase的平均值分别为49．1U／kW·h、
118．4U／kW·h、6934．4U／kW·h。
2．2．4碱与微波联合处理蔗渣对发酵过程及产酶
量的影响
将未经预处理的蔗渣和在最优条件下预处理
过的蔗渣作为碳源，于相同的摇瓶发酵条件下分别
发酵产酶。图7，图8，图9分别为口一葡萄糖苷酶活、
FPase、CMCase随发酵时间的变化情况，从图中可以
看出，蔗渣经过碱液和微波辐射联合处理后用于发
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2008年3月杨晓辉等：碱与微波联合处理蔗渣对里氏木霉发酵产纤维素酶的影响 ·65·
酵产酶，在第5d时3种酶活均达到最大值，而未经
处理的蔗渣发酵后3种酶活均在第6d时达到最大
值，且经过预处理的蔗渣发酵产生的口一葡萄糖苷酶
活、FPase、CMCause的最大值比未经处理的蔗渣发酵
产生的这3种酶活的最大值分别提高了81．3％，
88．2％，154．5％。微波处理可以缩短发酵周期，提
高纤维素酶的产量，这可能是由于蔗渣的超微结构
发生了改变，使微生物更容易利用，发酵初期产生
的纤维素酶酶解培养基中的基质，供菌体生长并产
酶，在较短时间内即可达到较高酶活。而未处理的
蔗渣由于难以被菌体利用，所以产酶较少且较慢。+160W．5min。0．3mol／LNaOH处理
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图7口·葡萄糖苷酶活摇瓶发酵周期曲线
Fig．7Time·删雠offl-glucosidaseinsh kingflaskculture+160W。5min，0．3mol／LNaOH处理
图8 FPase摇瓶发酵周期曲线
Fig．8Time—courseofFPaseinshakingflaskculture
3结论
利用碱液与微波辐射对植物纤维素原料进行
预处理可部分降解木质素和半纤维素，增加其可及
度，提高菌体利用效率。采用碱液浸泡后经微波辐
射处理的甘蔗渣作为基质进行纤维素酶的液态发
酵可以提高纤维素酶的活性，并缩短发酵周期。最
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图9 CMCase摇瓶发酵周期曲线
Fig．9Time-Cou_r$eofCMCaseinshakingflaskculture
佳处理条件是用O．30moL／L的NaOH溶液浸泡，在
微波功率为160W下处理5min，在此条件下单位
能耗的酶活净增值最大。微波处理后的蔗渣更易
为菌体利用，表现为发酵过程中菌体生长旺盛，酶
活增加，发酵周期缩短。在此基础上对发酵培养基
和培养条件进行进一步优化，有望得到更高的酶活。
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