全 文 ：第７卷第３期
２００９年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．３
Ｍａｙ２００９
收稿日期：２００８－１０－２１
作者简介：乐易林（１９７８—），男，江西宜春人，博士研究生，研究方向：基因工程；邵蔚蓝（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｗｌｓｈａｏ＠ｊｓｍａｉｌ．ｃｏｍ．ｃｎ
极端耐热纤维素酶 Ｃｅｌ７４的表达、纯化与特性
乐易林１，邵蔚蓝１，２
（１．江南大学 生物工程学院，无锡 ２１４１２２；２．南京师范大学 生命科学学院，南京 ２１００４６）
摘 要：从海栖热袍菌中克隆出编码热稳定性的纤维素酶基因，以热激载体ｐＨｓｈ为表达质粒，构建重组质粒ｐｈｓｈ
Ｃｅｌ７４，并转化至大肠杆菌中进行表达。基因表达产物通过热处理和离子交换层析，重组酶纯度达电泳纯。对纯化
的重组酶酶学性质研究表明，最适反应温度８５℃，最适反应ｐＨ４６，ｐＨ４５～６０之间酶的相对酶活在８０％以上。
Ｃｏ２＋对酶活性有促进作用，Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋不影响酶活性，而Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋对酶活性有抑制作用。
关键词：海栖热袍菌；纤维素酶；耐热性
中图分类号：Ｑ８１４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０３－００６４－０４
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａｃｅｌｕｌａｓｅＣｅｌ７４
ＬＥＹｉｌｉｎ１，ＳＨＡＯＷｅｉｌａｎ１，２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮａｎｊｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａｃｅｌｕｌａｓｅＣｅｌ７４ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｐＨｓｈ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙａｓｉｍｐｌｅｈｅａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｌｏｗｅｄｂｙＤＥ
ＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦｃｏｌｕｍｎ．ＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅｆｏｒＣＭＣａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ
８５℃，ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｌｕｌａｓｅＣｅｌ７４ｗａｓｆｏｕｎｄａｔｐＨ４６．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐｕｒｉ
ｆｉｅｄｅｎｚｙｍｅｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ８０％ ｆｒｏｍｐＨ４５ｔｏｐＨ６０．ＥｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｃａｎｂｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙＣｏ２＋，ａｎｄ
ｗｉｌｎｏｔａｆｅｃｔｂｙＣａ２＋，Ｍｇ２＋ｏｒＺｎ２＋，ｂｕｔｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＣｕ２＋，Ｎｉ２＋，Ｍｎ２＋．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍｅ；ｃｅｌｕｌａｓｅ；ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
纤维素酶对纤维素的有效降解不仅可以减少
环境污染，而且在洗涤、造纸、饲料工业中有广泛应
用［１］。目前，这些工业用酶主要来源于里氏木霉和
绿色木霉等，针对里氏木霉，在提高纤维素酶酶活、
降低生产成本等方面已经进行了广泛研究［２－３］。
利用嗜热菌产生的耐高温纤维素酶作为生物
催化剂的优势在于酶制剂稳定性好，降低生产成
本，在高温下进行酶解反应能增加纤维素的溶解性
和可利用性［４］。因此，前人对耐高温纤维素酶产生
菌的筛选与选育进行了广泛研究［５－８］。
由于一些嗜热微生物培养条件比较苛刻，甚至
在实验室中难以培养，所以嗜热微生物用于大规模
工业化生产耐高温纤维素酶还有一系列问题需要
解决。而采用分子生物学手段，将嗜热酶基因导入
大肠杆菌中高效表达，是一种非常有效的方法［４］。
嗜热梭菌内切纤维素酶基因工程菌产生的重组内
切纤维素酶的最适温度为６０℃，在７０℃处理２ｍｉｎ，
酶的活性基本不受影响［９］。另外，对基因工程菌的
规模化生产要求尽可能减少成本，而目前大多数工
程菌进行培养时，通过添加异丙基 β Ｄ 硫代半
乳糖苷（ＩＰＴＧ）作为诱导物，而该试剂的价格昂贵，
不利于降低工业化生产成本。本实验构建的表达
载体 ｐＨｓｈ是受 σ３２调控的热激表达载体。采用
ｐＨｓｈ表达载体进行表达时，外源基因在热激启动子
的控制下，不需要加入 ＩＰＴＧ诱导剂，仅仅通过温度
诱导表达［１０］。
本文主要利用新型热激表达载体 ｐＨｓｈ对极端
嗜热菌海栖热袍菌的纤维素酶 Ｃｅｌ７４进行表达，并
对重组酶的酶学特性进行研究。
１ 材料与方法
１１ 菌种、质粒、培养基和培养条件
大肠杆菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９）（购自 Ｐｒｏ
ｍｅｇａ公司）采用 Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培养基培养
（ｇ／Ｌ）：酵母粉５，胰蛋白胨１０，ＮａＣｌ５。
海栖热袍菌（ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍｅＡＴＣＣ４３５８９）采
用厌氧培养基培养，８０℃静置培养８ｈ［１１］。
质粒 ｐＨｓｈ由本实验室构建，属于热激表达载
体。该表达载体是由大肠杆菌 σ３２调控，包括一个
热激启动子和终止子，通过热激表达外源基因［１０］。
１２ 基因操作
海栖热袍菌基因组提取与 ＤＮＡ操作采用分子
克隆技术标准方法进行。质粒转化采用电转化方
法进行，质粒和ＰＣＲ产物采用ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄｋｉｔ和
ＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）纯化。
根据ＧｅｎＢａｎｋ中海栖热袍菌纤维素酶 Ｃｅｌ７４基
因序列 （ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿０００８５３）设计并合成一对引
物。引物１：ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧ和
引物２：ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴ，下划线
部分分别为ＮｃｏⅠ和 ＨｉｎｄШ 酶切位点。以海栖热
袍菌基因组为模板，进行 ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ条件为：
９５℃５ｍｉｎ，１个循环，９４℃ ５０ｓ，５１℃ ５０ｓ，７２℃
３ｍｉｎ，循环３０次；７２℃保温１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物
进行割胶回收后纯化，用ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄШ酶切后进
行浓缩，与ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄШ 双酶切的热激表达载体
ｐＨｓｈ进行连接，连接液转化大肠杆菌ＪＭ１０９构建含
纤维素酶基因片段的重组表达载体ｐＨｓｈＣｅｌ７４。
１３ 重组蛋白的表达与纯化
重组质粒电转化到宿主细胞 ＥｃｏｌｉＪＭ１０９中，
挑取重组单菌落接种于含１００μｇ／ｍＬ的氨苄青霉素
的ＬＢ培养液中，３０℃振荡培养至 ＯＤ６００达到０６～
０８之间，转入４２℃水浴摇床进行热激表达，继续
培养８ｈ后，离心收集菌体，用５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７５的
ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液洗涤细胞２次，并用相同缓冲液重
悬细胞，经高压破碎细胞后，离心取上清即为粗酶
液。将粗酶液在７５℃热处理３０ｍｉｎ后，４℃离心
３０ｍｉｎ去除变性蛋白。用５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７５的Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ缓冲液将ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析柱平衡后，进
行上样，用０～０５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的缓冲液线性梯度
洗脱，收集洗脱液。最终蛋白纯度通过十二烷基硫
酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）鉴定。
１４ 酶活测定方法
羧甲基纤维素（ＣＭＣ）酶活性测定方法参考文
献［１２］进行，以１０％ ＣＭＣ为底物，ＣＭＣ酶活单位
定义为每分钟催化产生１μｍｏｌ还原糖的酶量，定义
为一个酶活力国际单位，用Ｕ表示。
１５ 重组酶的性质分析
最适反应温度的测定：在７５～９５℃范围内，每
隔５℃，分别测定酶活。以酶活最高为１００％，计算
相对酶活。
最适反应ｐＨ：在ｐＨ３８～８２范围内每隔ｐＨ
０４测定酶活，缓冲液是５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑邻苯二甲
酸氢钾缓冲液。以酶活最高为 １００％，计算相对
活性。
ｐＨ稳定性：酶在不同的 ｐＨ条件下保温相同的
时间，再分别测定残留酶活性，与不保温酶的酶活
相比，计算百分比。缓冲液的选择同上。
２ 结果与讨论
１—ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２—ＰＣＲ产物
图１ 纤维素酶Ｃｅｌ７４的ＰＣＲ产物电泳图
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＣｅｌ７４
２１ 重组质粒的构建
以海栖热袍菌基因组ＤＮＡ为模板，采用高保真
的ＤＮＡ聚合酶进行扩增纤维素酶基因片段，在
２１ｋｂ附近有一条很亮的扩增条带（图１），没有明显
的非特异带，所选ＰＣＲ扩增条件能有效扩增目标基
因片段。ＰＣＲ产物克隆至热激载体ｐＨｓｈ中，构建出
５６ 第３期 乐易林等：极端耐热纤维素酶Ｃｅｌ７４的表达、纯化与特性
重组质粒ｐＨｓｈ Ｃｅｌ７４。用限制性内切酶对重组质粒
进行酶切鉴定，重组质粒能被ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄШ双酶切
得到２条分别为２１ｋｂ和２３ｋｂ的条带（图２）。证实
纤维素酶基因已插入热激载体中。
１—ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２—重组质粒ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄШ双酶切结果
图２ 重组质粒双酶切验证
Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ
Ｍ—ＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ；１—ＪＭ１０９（ｐＨｓｈ）诱导后细胞上清液；
２—ＪＭ１０９（ｐＨｓｈ Ｃｅｌ７４）诱导后细胞上清液；
３—热处理后细胞上清液；４—经过阴离子交换层析后纯化的蛋白
图３ 重组蛋白纯化过程的ＳＤＳ ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３ ＳＤＳＰＡＧＥｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ
ｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｐｓ
２２ 重组蛋白表达与纯化结果
重组质粒电转化到宿主细胞ＥｃｏｌｉＪＭ１０９中，在
ＬＢ培养液中，３０℃摇床中振荡培养至 ＯＤ６００达到
０６～０８时，转入４２℃水浴摇床进行热激表达８ｈ。
粗酶液经热处理和阴离子交换层析，得到电泳纯重组
蛋白（图３）。从电泳图谱上可以看出，含有重组质粒
的大肠杆菌在相对分子质量大约 ７２×１０４处有明显
的蛋白表达带。纯化过程见表１，粗酶液经过热处理
后，重组酶的比酶活大幅度提高，最后经过阴离子交
换层析，重组酶的比酶活达到２５０５Ｕ／ｍｇ。
表１ 重组酶的纯化
Ｔａｂｌｅ１ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍＥｃｏｌｉ
纯化步骤 总活力／Ｕ
总蛋白／
ｍｇ
比酶活／
（Ｕ·ｍｇ－１）
纯化
倍数
粗酶液 ２５０７５ ３０５８ ８２ １
热处理 １６７１６ ４１５ ４０３ ４９
离子交换层析 ８７６７５ ３５ ２５０５ ３０５
２３ 重组酶的酶学性质
２３１ 温度对酶活的影响
将纯化的重组酶在不同温度下测定酶活，重组
酶的最适反应温度为８５℃（图４）。
图４ 重组酶的最适反应温度
Ｆｉｇ．４ Ｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２３２ ｐＨ对酶活的影响
图５ 重组酶的最适反应ｐＨ
Ｆｉｇ．５ ＯｐｔｉｍｕｍｐＨｆｏｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
将重组酶在不同ｐＨ缓冲液中测定重组酶最适
反应ｐＨ，结果表明该重组酶的最适反应 ｐＨ为４６
（图５）。为了研究重组酶在不同 ｐＨ下的稳定性，
将０２μｇ／μＬ蛋白与不同ｐＨ的缓冲液混合，放置在
６６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
６０℃下保温１ｈ后检测残余酶活性。结果表明从
ｐＨ４０到ｐＨ６０之间，相对酶活性都在８０％以上，
在高ｐＨ的条件下该酶的ｐＨ稳定性差 （图６）。
图６ 重组酶的ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ．６ ｐＨｓｔａｂｉｌｉｔｙｆｏｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２３３ 金属离子对酶活的影响
为了进一步了解二价金属离子对重组酶活性
的影响，测定了二价金属离子 Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、
Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋对酶活的影响。将酶液在
８５℃、ｐＨ４６缓冲液中加入１ｍｍｏｌ／Ｌ不同的二价
离子进行酶活测定（图７）。结果表明 Ｃｏ２＋对酶活
性有促进作用，而Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋对酶活性有抑制
作用，Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋不影响酶活性。
图７ 不同二价离子对重组酶活性的影响
Ｆｉｇ．７ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｏｎｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
３ 结 论
将海栖热袍菌的一个纤维素酶基因在热激表
达载体ｐＨｓｈ上进行了表达，对重组酶进行了纯化，
酶纯度达电泳均一；该重组酶最适反应温度在
８５℃，最适反应ｐＨ为４６，该酶在 ｐＨ４５～６０之
间相对酶活在８０％以上。Ｃｏ２＋对酶活有促进作用，
Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋不影响酶活，而 Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋
对酶活有抑制作用。
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