全 文 ：Mar．2008
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生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
钛离子注入井冈霉素生产菌株的诱变效应
安 肖，虞 龙
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：探讨了利用金属Ti+离子注入井冈霉素生产茵的生物学效应，比较了不同的注入能量与注入剂量对茵株突
变效果的影响。在注入能量为15keV，剂量为1．5×10坫个／cm2离子的诱变条件下，筛选到一株井冈霉素高产菌株
C3-6，其发酵生产井冈霉素A组分的效价为19684p。g／mL，比出发菌株提高41．3％。经多次传代实验表明该菌株
的遗传稳定性较好。
关键词：离子注入；诱变；钛；井冈霉素
中图分类号：Q937 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0056—05
Themutagenicffe tof hevalidamycinproducing
strainimplantedbytitianmium(I)ion
ANXiao，YULong
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NamingUniversityofTechnology，Nanjing210009，China)
Abstract：Themutagenicffe tsofimplantedtitianmiumionofdifferentenergyandosageonthevali—
damycinproducingstrainStreptomyceshygroscupicusvar．JingganggensisYenwasinvestigated．Theoptimi—
amconditionoftitianmiumionmplantationwasat15KeVwithdosageof15X1014ions／era2．Ahigh-yield-
ingstrainWasobtainedwhichproducingvalidamycinAwithtiterof19684．whichWas41．3％highert an
thatoftheoriginalstrain．Furtherexperimentresultshowedthathegeneticstabilityof hestrainwasgood．
Keywords：ionimplantation；mutation；titianium；validamycin
井冈霉素是我国科学家沈寅初院士于20世纪
70年代发现并成功开发的第一个微生物农药，由吸
水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscupicusvar．
JingganggensisYe ．)代谢产生¨。。井冈霉素能有效
抑制水稻纹枯病菌，是目前我国使用面积最广、成
本最低、最安全高效的生物农药旧。3J。井冈霉素的
主要成分是井冈霉素A、B、E、F，井冈羟胺A、B以及
少量的井冈霉素C、D，其中含量最多、活性最强的
是A组分H曲J。 ．
离子束生物工程学创始于20世纪80年代，被
广泛地应用于动植物和微生物品种改良07。9I。经过
20多年的研究和实践，人们对离子注入诱变的生物
学效应和作用机理有了初步的认识，特别是对N+
离子等有机离子注入生物体的作用规律有了较为
系统的总结¨¨11J。但是，利用金属离子对微生物进
行诱变改良的研究目前还鲜有报道。为此，我们尝
试利用金属Ti+离子注入对井冈霉素生产菌株进行
诱变选育，以期探索其基本作用规律和机理，为研
究金属离子与微生物间的作用规律进行了初步的
实践。
收稿日期：2007-05-28
作者简介：安 肖(1982一)，女，河南新乡人，硕士研究生，研究方向：离子束生物工程。
联系人：虞龙，副教授。E-mail：y-lo-sTo@126．com
万方数据
2008年3月 安肖等：钛离子注入井冈霉素生产菌株的诱变效应 ·57·
1材料与方法
1．1 菌种
吸水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscupicus
varoJingganggensisYe )，本实验室保藏。
1．2培养基
固体培养基：葡萄糖10g／L，￡-天冬酰胺O．5
g／L，K2HP040．5g／L，琼脂15g／L，pH自然。
摇瓶发酵培养基：大米粉90g／L，黄豆粉20
∥L，花生粉10∥L，酵母粉10g／L，KH2P040．85
g／L，NaCI1．5g／L，pH自然。
1．3培养方法
将实验室保存的吸水链霉菌井冈变种的孢子
悬液以不同的稀释度在平板培养基上进行涂布分
离，38℃培养3—4d，挑选形态圆整的单菌落至斜
面培养2—3d，接种至发酵培养基中培养92～96h，
测定井冈霉素A的效价。摇瓶装液量为40mL，接
种量为一环孢子，培养温度38℃，摇床转速220
r／mino
1．4井冈霉素A效价测定
井冈霉素A效价测定采用高效液相色谱法¨2I。
1．4．I发酵液处理方法
培养92—96h的发酵瓶称重后，将发酵液
9000r／min离心，取上层清液1mL，蒸馏水稀释定
容至50mL，0．45斗m微孑L滤膜过滤后用HPLC
测样。
1．4．2发酵效价计算方法
井冈霉素效价定量计算采用标准曲线法。
HPLC测得井冈霉素A组分含量，所得效价乘以50，
再乘以摇瓶发酵失水系数，即为40mL发酵液的
效价。
1．5离子注入与样品处理
取待诱变菌株斜面，倒人10mL无菌水，刮下孢
子及斜面培养物，用玻璃珠打散，双层纱布漏斗过
滤，得到孢子悬液，吸取0．1mL，均匀涂布于无菌培
养皿上。以无菌风吹干。镜检无细胞重叠者进行离
子注入。
1．6存活率的计算
将经过离子注入的培养皿以及未接受辐射的
培养皿中的孢子用1mL无菌水洗脱，再进行适当的
稀释后涂布到固体培养基中，置于38℃培养箱中培
养3—4d。统计在不同的诱变能量和剂量下，接受
离子注入诱变的菌株的存活单菌落数与不接受注
入的对照菌株的存活单菌落数，两者的比值即为存
活率。
1．7突变率的计算
经过多次平行实验的结果统计，同一株吸水链
霉菌井冈变种的发酵效价变化幅度在4-4％左右。
所以，在诱变选育研究中，将突变株效价相比于出
发菌株变化幅度在4-5％的菌株视为无义突变株或
实验误差，效价低于出发菌株5％以上的视为负突
变菌株，效价高于出发菌株5％以上的视为正突变
菌株。
负突变率是指负突变菌株占全部被考察菌株
的比率，正突变率是指正突变菌株占全部被考察菌
株的比率，总突变率是指正、负突变率之和。
2结果与讨论
2．1不同注入能量的诱变效应
2．1．1 注入能量对菌体存活率的影响
分别采用10keV，15keV，20keV的离子注入
能量，将注入剂量设定为1．5×1015A--／cm2离子，对
出发菌株进行Ti+离子注入，考察注入能量对菌体
存活率的影响，结果见图1。
零
旃
!!g
幢
圈1 不同能量下Ti+注入对菌体存活率的影响
Fig．1TheinfluenceofTi+implantationenergy
onthesurvivalrate
由图1可见，在10keY注入能量下，菌体存活
率较高，达到29％；当注入能量为15keV和20keV
时，菌体的存活率显著下降。
这种生物学效应的差异可能是由于能量沉积
效应[131的结果。能量沉积可使注人离子直接作用
于细胞的DNA靶位上，使其产生损伤；同时，在此过
万方数据
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程中产生的大量氧化能力极强的自由基也会导致
DNA损伤。一般来说，能量越大，其沉积所造成的
损伤也越大，较大能量的离子注入除了导致DNA损
伤外，对细胞壁、细胞质的刻蚀损伤也比低能离子
要强烈得多。
2．I．2注人能量对菌体突变率的影响
将出发菌株分别以10keV，15keY，20keV的
注人能量进行Ti+离子注入，各能量下分别选取3
个诱变剂量5×10141"／cm2、10×1014个／cm2、15×
10“爪／cm2离子。每个剂量下随机挑取20个诱变
菌落进行摇瓶发酵，测定井冈霉素A效价。考察
Ti+离子注入菌体后，各注入能量下的总突变率与
正、负突变菌株比率，见图2。
图2不同能量下Ti+注入诱变的突变菌株比率
Fig．2Thepositivemutantra ioofdifferent
Ti+implantationenergy
由图2可以看出，在15keV的注入能量下，所
得到的总突变菌株和正突变菌株比率均较高，分别
达到63％和25％，对提高筛选效率和获取优良突变
菌株比较有利。在10keY的注入能量下，正突变率
也比较高，但是总突变率仅有48％，给后续的筛选
工作造成了障碍。在20keV的注入能量下，正突变
菌株比率较低，负突变菌株比率明显增高，对选育
高产菌株的意义不大。
所以，从提高筛选效率和获取高产突变株的概
率方面综合进行考虑，选取15keV为钛离子注入井
冈霉素生产菌株的能量比较合适。
2．2不同注入剂量的诱变效应
2．2．1注入剂量对菌体存活率的影响
设定Ti+离子注入能量为15keV，考察不同注
入剂量的菌体存活率，结果见图3。
离子注入微生物的剂量一效应曲线一般呈现“马
鞍”型，这是离子注入诱变所特有的诱变效应的重
图3 Ti+离子注入吸水链霉菌井冈变种的存活率曲线
Fig．3ThesurvivalrateofStreptomyceshygroscupicusvat．
JingganggensisY ． mplantedbyTi+ions
要表现¨4。。但是，由图3可发现，金属Ti+离子注入
井冈霉素生产菌株的存活率曲线呈现“双马鞍”型，
菌体的存活率分别在10×1014+／cm2和20x1014
1／cm2的剂量下出现了两次回升，但第二次回升的
幅度小于第一次。
存活率的两次回复峰的出现有可能是注入的
Ti+离子与菌体内的修复酶共同作用的结果，其作
用机理可能非常复杂。在相关的报道u纠中也发现
了类似的现象，这是否是Ti+离子或金属离子注入
微生物的共性特征还需进一步的实验研究。
从图3可以看出，存活率的第一次下降不是缓
慢的，而是在很低的剂量下就出现了存活率的骤
降。在实验中，多次试图通过减小Ti+离子注入剂
量以得到较高的菌体存活率，但都没有达到预期的
效果。
相关研究旧1指出，离子注入细胞的射程较短，
低剂量时只对细胞表面进行损伤和刻蚀。可以认
为，在这一剂量范围内造成存活率下降的主要原因
是能量沉积效应和动量传递效应[1¨17J。因此可推
测，在较低剂量下对井冈霉素生产菌株进行Ti+离
子注入时，存活率骤降的主要原因可能是动量传递
效应。由于Ti+离子质量较大，注入时所产生的动
量相对较强，其动量传递效应对菌体细胞造成的损
伤也较为严重，从而导致菌体在低剂量下产生了较
高的致死率。
2．2．2注入剂量对菌体突变率的影响
井冈霉素生产菌株经Ti+离子注入后，将每个
剂量下存活的菌株及出发菌株各挑取一定数量的
单菌落，摇瓶发酵测定其井冈霉素A效价，考察菌
株的产素水平。统计注入剂量与正负突变率的关
系，以探索最佳注人剂量。结果见图4。
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2008年3月 安肖等：钛离子注入井冈霉素生产菌株的诱变效应 ·59·
图4不同剂量下Ti+离子注入吸水链霉菌
井冈变种的突变率
Fig．4ThemutationrateofStreptomyceshygroscupicus
v她JingganggensisYen．implantedby
Ti+ionswithdifferentdoses
由图4可以看出，在较低的注入剂量下，菌株发
生负突变与无义突变比率较高；随着注入剂量的增
大，正突变率呈现先增大后减小的趋势，进而出现
全负突变。可见，过大或过小的注入剂量均不利于
菌株的正向突变。
发生正突变的菌株集中在15×1014／?"／cm2左右
的注入剂量下，而且在该剂量下，几乎所有的接受
辐照的菌株都发生了正、负突变；在10×1014／f／cm2
的剂量下，负突变与无义突变率略高于正突变率；
在20×1014个／cm2剂量下，菌株的正、负突变率与无
义突变率基本持平。
所以，在对井冈霉素生产菌株进行Ti+离子注
入诱变选育中，故选取15×1014／l-／cm2为最佳注入
剂量。
2．3高产菌株发酵性能考察
2．3．1发酵曲线
将高产菌株的发酵曲线与出发菌株对比，考察
Ti+离子注入得到的高产突变株C3-6的发酵性能，
结果见图5。
由图5知，发酵初期出发菌株的发酵水平略高
于高产菌株C3-6；发酵时间超过45h之后，出发菌
株发酵效价增长趋势明显低于高产菌株；出发菌株
在90h后基本上效价水平维持在13900左右，而
C3-6的发酵效价在100h后才逐渐稳定在19600
左右。
可以看出，高产菌株的发酵周期比出发菌株略
长，但是，其优势在于发酵迟滞期较短，产物积累的
速度快，达到了预期的选育目的。
苕
●
菩
夏
翟
图5高产菌株C3-6发酵曲线与出发菌株对比
Fig．5Thefermentationcalveofthehish·yielding
mutantC3-6andtheoriginalstrain
2．3．2遗传稳定性
通过Ti+离子注入对井冈霉素生产菌株进行多
轮诱变后，在最佳注入能量和剂量下，筛选到一株
比诱变出发菌株的效价提高41．3％的变异株，命名
为C3-6(A组分效价19684斗g／mL)。
将高产菌株C3-6和诱变出发菌株分别传代3
次，进行发酵效价测定，考察突变株的遗传稳定性，
见表1。
表1高产突变株C3_6的遗传稳定性
Table1 Thegeneticstabilityofhigh-yieldingmutantsC3-6
由表1可知，高产菌株C3-6经传代3次后，效
价略有下降，且代间波动较大。平均效价相对于出
发菌株的增幅为39．4％，比第一代突变株略有
降低。
有研究¨副推测，注入离子的种类主要影响其与
微生物细胞相互作用过程中的质量沉积效应。Ti+
离子注入细胞后，除以各种无机离子的形式沉淀下
来以外，还可以通过与靶分子或自由基结合成络合
物的形式沉淀u8。，其生理生化机制更加复杂。因此
推测，由于金属Ti+离子相对于微生物细胞而言，属
于无机离子，非生命活动所必需，且微生物细胞本
身也具有一定的修复损伤能力，使部分被Ti+离子
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·60· 生物加工过程 第6卷第2期
注入的细胞不能稳定地保留其突变特征，出现了一
定的回复突变。
3结论
利用金属Ti+离子对井冈霉素生产菌株进行诱
变选育，观察和统计了Ti+离子注入对该菌株的生
物学效应。在优选的诱变条件下，筛选到了一株井
冈霉素高产菌株，其发酵生产井冈霉素A组分效价
比出发菌株提高41．3％，经传代实验证明该突变株
的遗传稳定性较好。
以吸水链霉菌井冈变种为考察对象，对金属离
子注入诱变的作用规律进行了初步探索。在离子
束生物工程研究中，金属离子与微生物细胞间的内
在作用机制有待进一步被揭示，使其在工业微生物
育种实践中发挥更大的作用。
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