全 文 ：第 39卷　第 1期 厦门大学学报 (自然科学版 ) Vo l. 39　 No. 1
　 2000年 1月 Journal o f Xiamen Univ ersi ty ( Natural Science) Jan. 2000　
文章编号: 0438-0479( 2000) 01-0096-06
低能碳离子对甜菊生长和叶绿体发育的影响
收稿日期: 1999-03-11
基金项目: 国家重大项目资助课题 ( 19890300)
作者简介: 罗茂春 ( 1956- ) ,男 ,讲师 ,现在福建省龙岩师专生物学系工作 ( 364000) .
罗茂春 1 ,沈明山 1 ,徐金森 1 ,蒋先志1 ,邵寒娟 1 ,陈睦传 1 ,
陆　挺2 , 舒世珍 3
( 1.厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 福建 厦门　 361005; 2.北京师范大学
低能核物理所 ,北京　 100875; 3.中国农业科学院作物品种资源所 ,北京　 100081)
摘要: 研究了能量为 100 keV ,剂量为 1015 /cm2的碳离子对甜菊种子萌发率、幼苗生长发育及叶绿
体结构的影响 .证明被注入种子出现萌发迟缓、生长速度减慢、植株株型变矮和生物量减少等生物学
性状变化 ;幼叶细胞的叶绿体发育分化减慢、基质类囊体形成滞后、基粒数及基粒类囊体片层减少 ;
部分幼叶细胞叶绿体膜破损、基质片层断裂直至叶绿体解体 (约占二十分之一 ) .表明该能量剂量的
碳离子注入将影响种子的生长发育 ,其原因之一是叶绿体发育迟缓和叶绿体的损伤 .该研究为低能
碳离子对甜菊诱变育种提供参考依据 .
关键词:甜菊 ;碳离子注入 ;叶绿体 ;生长发育
中图分类号: Q 691. 5 文献标识码: A　　　　　　　　　　　　　　　
甜菊 ( Stevia rebaudiana Ber toni )是一种多年生草本菊科植物 ,以其叶片含高甜度、低热
量、无毒性的甜菊糖苷而成为继蔗糖、甜菜之后的第三大天然糖源 ,具有较高的经济价值和药
用价值 [1 ] .因此 ,探索培育高产、抗逆、优质、高糖苷含量甜菊新品种的工作正引起越来越多科
学工作者的关注 .
生物诱变育种是全球十分重视的课题之一 .目前国内外以高能量 (可达数百兆电子伏特 ) ,
穿过种子胚部的离子束辐照种子 ,与传统的 X射线、γ射线、质子或中子辐照育种无本质差别 .
以数十至数百千电子伏特能量的离子注入农作物种子而改变种子内部基因结构、实现农作物
的诱变育种、筛选出符合人们需要的优良品种 ,这是我国首创的一种新技术 .具有明显特点:注
入的离子不能穿透种胚 ,只停留在被注入的种子表皮上产生能量沉积和质量沉积 ,使电、能、质
共同作用于种子内生物大分子物质 ,引起生物学效应 ,表现出生物体生理损伤小、变异率高、变
异谱广等特征 [2, 3 ] .研究表明 ,低能离子注入干种子在水稻、玉米、棉花、大豆、三角堇、矮牵牛等
植物中出现明显变异 ;被注入的当代种子发芽率、生长速度、植株株型等方面均出现变化 [4～ 8 ] .
舒世珍等报道 ,用氮离子束辐照甜菊种子发现合理的处理 (能量为 35 keV,剂量为 1013 /cm2～
1014 /cm2 )可促进幼苗生长、植株根深叶茂 ,可提高产量和糖苷含量 ,尤其是增加优质糖苷 R-A
( Rabaudio side-A)在总糖苷中的比例 ,提高产品的质量 [ 9] .
关于把低能离子注入技术用于甜菊种子 ,探索低能碳离子影响甜菊叶绿体发育的研究尚
未见报道 .本文侧重报道了经低能量 ( 100 keV、 1015 /cm2 )碳离子束辐照后 ,甜菊幼苗生长发育
和叶片细胞叶绿体超微结构变化 .
1　材料与方法
1. 1　材　料
供试甜菊干种子为“云宾” ,由中国农科院品种资源所舒世珍研究员提供 ,于北师大低能核
物理所进行碳离子注入 .
1. 2　方　法
1)注入离子类型: 碳离子 .
2)注入能量与剂量: 100 keV、 1015 /cm2 .
3)生长发育效应评估方法: 种子经 75%乙醇和升汞消毒后点播于灭菌过的营养土中 ,每
组点播 50粒种子 ,每样重复三组 ,置防虫玻璃沙窗房内 ,培养记录种子萌发率和萌动速率、株
高和单株重等参数 .
4)超微结构研究方法: 种子在培养皿内的湿滤纸上于 25℃光照培养箱内催芽 ,第四天摘
取幼叶 ,快速剪成 1 mm× 2 mm大小的长条状组织块 ,立即投入 4℃冰浴的 2. 5%戊二醛液
( 0. 1 mol /L, pH7. 4的磷酸缓冲液配制 )置于 0～ 4℃冰箱固定 5 h以上 .经磷酸缓冲液洗涤 4
次后转入 2% OsO4中后固定 2 h;漂洗后经乙醇系列脱水 ,用环氧树脂 Epon 618包埋、 LKB-
8800Ⅲ型超薄切片机切片 ;以醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后在 JEM-100CXⅡ型电镜下
观察、拍照 [ 10] .
2　结　果
2. 1　碳离子注入对甜菊生长和发育的影响
在相同育苗栽培条件下 ,经离子注入的甜菊种子萌发速度较对照组迟缓 1～ 1. 5 d,催芽 3
d的种子长速明显不如对照组 ;但种子发芽率无明显差异 . 10 d龄幼苗中 4叶株数明显减少 ;
叶片形态与对照组无异 ,但叶面积较小 . 30 d和 60 d龄平均株高均较矮 . 60 d龄现蕾株数约占
对照组的三分之二 ,平均单株重较轻 (表 1) .
表 1　碳离子注入对甜菊生长发育的影响
　　 Tab. 1　 Effect o f ca rbon ion implanta tion on the development and g r ow th of S . rebaudiana
组别 萌发率
/(% )
萌发速率* 10 d龄 4叶株比
/(% )
30 d株高
/cm
60 d株高
/cm
60 d株重 (干 )
/g
60 d蕾株比
/(% )
实验组 90. 0± 2. 7 + 44. 4± 1. 5 6. 7± 0. 8 22. 9± 1. 1 12. 5± 0. 2 50. 0± 2. 3
对照组 87. 0± 1. 6 + + + 80. 0± 1. 8 10. 0± 0. 4 26. 8± 0. 9 13. 5± 0. 3 70. 8± 2. 8
　　* 4层滤纸上检测结果 ,其余数据均为平均值 .
　　由于成熟植株干重差异比较是低能离子注入甜菊种子是否有促长效果的重要指标 ,因此 ,
·97·第 1期　　　　　　　　罗茂春等: 低能碳离子对甜菊生长和叶绿体发育的影响　　　　　　　　　　　　
应用假设检验法 ,对 60 d株重进行数理检验 .结果可得 T ( 188)= 2. 361,与 T ( 188, 0. 05)=
1. 978相比较 , T ( 188)> T ( 188, 0. 05) ,可认为在该注入剂量下 ,离子注入组与对照组有显著的
差别 .
从上述观察结果表明:经 100 keV、 1015 /cm2碳离子束处理后 ,甜菊种子萌动迟缓 ,幼苗生
长分化速度减慢 ,叶面积减少 ,生物量下降 ,生长发育受到明显抑制 .
2. 2　碳离子对甜菊叶绿体发育的影响
电镜观察表明:碳离子注入甜菊种子影响叶绿体的发育 ,发育情况与对照甜菊有明显的差
异 .未经碳离子注入的甜菊种子萌发后叶片细胞叶绿体呈正常 ,在幼叶细胞中的叶绿体轮廓清
楚 ,外膜结构完善 ,基质含有叶绿素 ,可见部分基质片层 ;部分类囊体膜形成具 2～ 4层垛叠的
基粒 ,部分基质片层未与基粒相连 (图 1) .有些叶绿体可见一个或两个质体中心 ,中心小管束
周围类囊体片层呈放射状排列 (图 1～ 2) .发育较早、分化程度较高的叶绿体基质片层与基粒
连系紧密 ,基粒数增加 ,排列有序 ,基粒片层亦增加 ,有些基粒可见 6～ 7层垛叠 ;质体中心范围
逐渐缩小至消失 ,叶绿体呈椭圆状 (图 3) .叶绿体常常通过分裂而增殖 ,处于分裂的叶绿体首
先呈长椭圆形 ,后由中部缢缩呈哑铃状 ,片层和基质分向两端 (图 4) .分裂完成的两个叶绿体
基质片层和基粒片层逐步增加 (图 5) .成熟的叶绿体基粒较丰富、片层较多 ,出现较大的淀粉
区 (图 6) .与对照组相比较 ,经碳离子注入的甜菊种子萌发后 ,幼叶细胞的叶绿体成熟较慢 ,表
现为类囊体分化较迟 ,质体中心可见 ,基质片层模糊 ,基粒片层少见 ,基质丰富呈较高的电子致
密度 ,整个叶绿体较小 (图 7) .其叶绿体片层分化仍不完全、基质片层少、基粒少且垛叠不超过
三层 ,整个叶绿体呈不发达状态 (图 8) .进一步观察还发现 ,叶片中部分细胞的叶绿体外膜破
损 ,基质片层和基粒片层松散 ,片层结构不清晰 ,而其中的淀粉粒和叶绿体邻近的线粒体无破
损迹象 (图 9) .在此基础上细胞中的叶绿体基质片层断裂 ,基粒散开 ,基粒片层亦断裂而呈解
体状 ,最终叶绿体解体 ;其周边细胞的细胞器皆未见异常 (图 10) .
以上结果表明 , 100 keV. 1015 /cm2碳离子注入甜菊干种子后 ,影响幼叶细胞叶绿体的发
育 ,而且其影响持续到叶绿体发育后期 ,并导致部分 (约占 1 /20)细胞的叶绿体解体 .可见叶绿
体的发育受阻与甜菊的生长发育受到影响具有相关性 .
3　讨　论
3. 1　低能离子注入种类、能量、剂量与甜菊生长发育的关系
目前所用的低能离子种类很多 ,有氮、碳、硼、铁离子等 ,注入能量在 30～ 180 keV之间 ;已
应用于水稻、棉花、蕃茄和甜菊的育种 ,取得较好的结果 .舒世珍等 [9 ]报道用氮离子束辐射甜菊
干种子 ,其最佳处理剂量 ,能量为 35 keV, 1013 /cm2～ 1014 /cm2 ;可促进幼苗生长 ,植株根深叶
茂 ,提高产量和糖苷含量 ,增加优质组分 R- A的比例 .本研究采用 100 keV、 1015 /cm2处碳离
子甜菊干种子所获的生长、发育迟缓效应与舒世珍报道的结果有所差异 .如在中低能量、剂量
碳离子处理组合中 ,表现出前期种子萌发速率下降 ,生长缓慢 ,到中、后期生长速率加快 ,生物
量较对照组增加 ,现蕾期提前的正效应 (待发表 ) .因此在低能离子注入研究中 ,重视所注入离
子种类的选择及不同类型离子与注入能量、剂量的关系 ,才有可能获得“生理损伤小、变异率
高、变异谱广、正效应比例高”的预期结果 [2, 3 ] .
·98·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
3. 2　生长发育迟缓的细胞生物学和分子生物学分析
引起该处理组合生长发育迟缓的细胞生物基础是多方面的 ,在种子萌动期叶绿体的变化
是明显的 .本研究对对照组和处理组进行较系统的观察比较发现 ,对照组质体中心丰富 ,约占
所见叶绿体总数的 1 /3～ 1 /4,基质和基粒片层发达 ,外膜完整平滑 ,分裂相清晰可见 ,表明该
时期对照组正处于叶绿体的旺盛发育期 ,而此时处理组却表现出叶绿体发育迟缓和部分叶绿
体的解体现象 .叶绿体发育的迟缓势必影响细胞叶绿体的数量 ,光合作用的电子传递体系的完
整性 ,进而影响光合作用的进程 ,使细胞的同化和异化作用速度减慢 .而部分细胞内的叶绿体
的解体 ,势必影响了细胞的功能和个体的生长与发育进程 .
低能离子不易穿透种胚 ,通常只停留在种子表皮 ,产生能量沉积和质量沉积效应 .为探讨
这些效应对生物的作用机理 ,人们用低能离子注入离体的干燥的氨基酸、蛋白质、质粒 DNA、
细菌和真核生物 DNA,发现在体外能改变这些生物分子的空间构型 ,释放或转移功能团而改
变生物大分子的性质 [11～ 13 ] .但这些结果只能部分间接地解释低能离子注入生物体内所引起的
效应 ,间接地证明低能离子注入可以引起体内 DNA发生突变 .为进一步解释低能离子注入的
生物学效应 ,近年来 ,本科研组以无性繁殖系甜菊种子“丰收二号”为对象 ,直接提取处理组和
对照组 DNA,再经 RAPD技术进行扩增 ,证明了低能离子能作用于甜菊体内生物大分子
DNA,令其发生突变 (另文发表 ) .叶绿体 DNA是一类裸露的 DNA分子 ,它更容易遭遇到低
能离子的作用 .因此本研究认为 ,低能离子注入引起叶绿体发育的迟缓应该是它作用于叶绿体
DNA的必然结果 ,包括作用以后引起的 DNA损伤与修复和基因表达调控的正负效应的总
和 .当损伤较大 ,叶绿体 DNA修复无法进行 ,迟缓或出现错误修复 ,或表达时空关系失控 ,这
种效应就可能导致叶绿体发育到一定阶段而中止 ,或合成某类特异的酶类 ,对叶绿体的膜和片
层结构产生破坏作用 .
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Ef fects of Low-energy Carbon Ion Implantation on the Grow th
and Development of Chlo roplast of Stevia rebaudiana
LUO Mao-chun
1 , SHEN Ming-shan
1 , X U Jin-sen
1 , JIANG Xian-zhi
1 ,
SHAO Han-juan1 , CHEN Mu-chuan1 , LU Ting2 , SHU Shi-zhen3
　　　 ( 1. Key Lab. of the M ini. o f Edu. Cell Bio l. and Tumor Cell Eng . o f Xiamen Univ . , Xiamen,
　　　 361005, China; 2. Inst. of Low Energy Nuclea r Ph ysics, Beijing No rmal Univ. , 100875, China;
　　　 3. Inst. o f Crop Resources, Chinese Acad. o f Ag ricultural Sci. , 100081, China)
Abstract: This paper repo rts the effects of carbon ion implantation at 100 keV and 1015 /
cm
2
on the seed germination rate, development , g row th, and chloroplast st ructure of Stevia
rebaudiana seedling. The resul t show ed the following changes o f the bio logical characters of
the ion implanted seeds in: ( 1) the reta rdation o f the seed germina tion, the decelera tion of
the g row th speed, the stunt of plant height , and the decrease o f biomass; ( 2) the deceleration
o f dif ferentiation and g row th of the chloroplast in y oung leaf cells, the retardation in fo rming
thylakoid, the decrease of the g rana numbers and thylakoid lamella; and ( 3) the damage of
the ch loroplast membrane, the cleavage of st roma lamella and /o r the decomposi tion of
chloroplast (ca. 5% ) . The experimental resul t prov ed that the ca rbon ion implantation at the
above energy and dose surely influenced the development and g row th of S. rebaudiana seed
because of the lesion and development retardation o f chloroplast. The study suggested a ref-
erence to the induced breeding of S. rebaudiana by low-energ y carbon ion implanta tion.
Key words: stevia rebaudian; ca rbon ion implantation; chloroplast, development and
g row th
图版说明
图 1-6为对照组甜菊幼叶细胞叶绿体
图 7-10为经碳离子注入的甜菊幼叶细胞叶绿体
　　 1.示由小管组成的质体中心 ,基粒片层少 . 20 000; 2.示双质体中心 ,基质片层和基粒呈放射状排列 ,
20 000; 3.示质体中心缩小 ,基粒片层增加 27 000; 4.示分裂的叶绿体 ,中部缢缩 , 20 000; 5.示分裂完成
后分开的两个叶绿体 ,基粒增多 , 8 000; 6.示成熟、内有大的淀粉区的叶绿体 , 20 000.
　　 7.示分化迟、基质片层模糊、无基粒的叶绿体 , 20 000; 8.示片层分化增加但基粒少 , 10 000; 9.示叶
绿体部分外膜破损 ,片层松散 , 20 000; 10.示若干个叶绿体基质片层断裂、基粒松散 , 14 000
·100·　　　　　　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　 2000年
·101·第 1期　　　　　　　　罗茂春等: 低能碳离子对甜菊生长和叶绿体发育的影响